Summary
VisioTracker göz hareketlerinin kayıt dayalı larva ve küçük yetişkin balık görsel performans kantitatif analizi için otomatik bir sistemdir. Bu tür görsel sistem gelişimi ve işlevi, farmakoloji, nöral devre çalışmaları ve sensorimotor entegrasyon gibi alanlarda yüksek verimli araştırma sağlayarak, görsel uyarana özellikleri ve gerçek zamanlı analiz üzerinde tam denetime sahiptir.
Abstract
Görsel sistem gelişimi ve işlevi içine soruşturmalar işlemek için, ortaya çıkarmak için kolay, sağlam ve basit görsel performansı ölçülebilir davranış modelleri gerektirmektedir. Uygun bir model, bir optokinetik yanıtı (okr), yüksek seçim değeri nedeniyle, tüm omurgalıların bulunan bir dönüşlü bir davranış içinde tespit edilmiştir. Okr hızlı sıfırlama sakkadlar ile dönüşümlü gözleri yavaş uyaran-aşağıdaki hareketleri kapsar. Bu davranış ölçüm kolaylıkla on tercih edilen modellerinden biri için, erken ve istikrarlı başlangıç (tam olarak 96 saat sonrası gübreleme (HPF) sonra geliştirilen), ve zebrafish genetik ilgili tam bir bilgi yararlanarak dolayı, zebrafish larva gerçekleştirilir Bu alanda organizmalar. Bu arada yetişkin balık benzer mekanizmaların analizi özellikle farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için önem kazanmıştır.
Burada, tam otomatik, yüksek throughpu VisioTracker tarifgörsel performans kantitatif analiz için t sistemi. Sistem, Prof Stephan Neuhauß grubuna yapılan araştırmalar esas ve TSE Systems tarafından yeniden dizayn edilmiştir. Bu yüksek çözünürlüklü zum objektife sahip bir yüksek kaliteli video kamera tarafından izlenen küçük balıklar için bir hareketsizleştirir aygıtı oluşur. Balık konteyner bilgisayarda oluşturulan uyarıcı desenleri tahmin edilebileceği üzerine, bir davul ekran ile çevrilidir. Göz hareketleri kaydedildi ve otomatik gerçek zamanlı VisioTracker yazılım paketi tarafından analiz edilir.
Veri analizi, yavaş ve hızlı fazı süresi, hareket döngüsü sıklığı, yavaş faz kazanç, görme keskinliği ve kontrast duyarlılık gibi parametrelerin hemen tanıma sağlar.
Tipik sonuçlar örneğin vahşi tip morfolojisinde belirgin bir değişiklik göstermez görsel sistem mutantların hızlı kimlik veya kantitatif etkilerinin belirlenmesi izin Farmakolojik veya toksik ve mutajenikGörsel sistem performansı üzerinde ajanları.
Protocol
1. Balık Yetiştiriciliği
Embriyolar tuttu ve kaldırdı standart koşullar (Marka 2002) altında ve gün sonrası fertilizasyon (DPF) gelişmesine göre evrelendirildi. 5 dpf at Yetişkin ve larva ölçümleri için kullanılmıştır.
2. Deneysel prosedürün
- Alet hazırlanması
Larva: Balık larvalarının% 3 gömüldü önceden ısıtılmış (28 ° C) vücut hareketleri önlemek için metilselüloz. Embriyolar projelendirme ekrana bakacak, VisioTracker dorsal yüzü yukarı yerleştirildi. Yetişkin balık: Balık hareketsizleştirir cihazın içine monte ve VisioTracker yerleştirilir, 300 mg / l MS-222 kısaca anestezi yapıldı. Ölçümleri başlatılmıştır önce, 1-2 dakika kurtarmak için bırakıldı.
- Uyaran desen Nesil
Balık etrafında dönen dikey siyah-beyaz sinüs ızgaralar oluşan Stimulus desenler oluşturulantescilli yazılım paketini kullanarak. Onlar dalga formu, kontrast, yoğunluk, açısal hız ve uzaysal frekansa göre yazılım paketi ile modüle olabilir. Desenler VisioTracker içinde bulunan bir dijital ışık projektörü kullanarak ekrana yansıtılan edildi. Balık gözü ve ekran arasındaki yaklaşık mesafe 4.5 cm, ve projeksiyon boyutu ekranda yatay 360 derece ve dikey olarak 55 derece oldu. Larva balık için, stimülasyon yönünü sakkad sıklığını azaltmak için 0.33 Hz frekans ile değiştirilmiştir. Yetişkin balıklar tek yönlü teşvik edildi ve genel olarak burun-to-temporal göz hızı (Mueller ve Neuhauß, 2010 bakınız) anlamlı olarak daha düşük ve daha az sabittir yana sadece zamansal-to-burun yönünde uyarılan göz, kabul edildi.
- Göz hareketlerinin kaydedilmesi
Balığın başının parlak alanlı görüntü kızılötesi kamera beslenmiştir. Balık Kızılötesi aydınlatma f etkilenmiştirAşağıda rom. Kamera sırasıyla, 5 kare / saniye (larva) veya 12.5 kare / saniye (yetişkin) oranında görüntüleri kaydedildi. Görüntüler otomatik olarak, işlenmiş düzeltilmesi ve göz şekli için düzgünleştirilir. Yatay eksen ile ilgili olarak göz yönlendirme sonra otomatik olarak tespit edildi ve göz hız özel yazılım paketi ile hesaplanmıştır. Balık küçük hareketleri otomatik olarak yazılım tarafından için düzeltilmiştir. Tüm kayıt ve analiz gerçek zamanlı olarak elde edildi.
3. Post-deneysel veri işleme
- Göz hızlarının Ham ölçümleri yavaş faz hızı elde etmek amacıyla sakkadlar için filtre edildi.
- Sakkad-filtre gözü hız eğrilerini 7 kare kayar pencere ile çalışan bir ortalama ile düzeltilmiş edildi.
- Göz hızı aynı uyarıcı koşulları ile çerçeve üzerinde ortalama edildi.
- Larva balık için, göz hızı iki gözü üzerinde ortalama edildi.
4. Temsilcisi sonuçları:
Larva Zebrafish için, tampon mutant seçilmiştir. Bu mutant, lens epitel hücrelerinde azalma lens boyutu ve lens ektopik konumu yol hyperproliferate. Bu morfolojik değişiklikler bir kontrast hassasiyeti önemli ölçüde azalma ve görme keskinliğinde (Schonthaler ve ark., 2010) tarafından yansıtılır. Şekil 1 yabani tip kardeşlerine karşı tampon mutantlar kontrast duyarlılık açısından farklılık göstermektedir. Tampon mutantlar giderek uyaran kontrastı azaldıkça gözün hızı ayarlamak için başarısız. Benzetme, uyaran uzaysal frekans arttığında, uyaran şerit genişliği azalır, yani tampon mutantlar aynı şekilde görme keskinliği (Şekil 2) azaltılmış şekilde gösteriyor
Erişkin Zebrafish visua ve bağımlılığıçevre koşullarına l performans 30 dakika boyunca kendi tank su içinde alkol farklı konsantrasyonlarının için balık tabi tutulması ve daha sonra çeşitli uyarıcı koşullar altında optokinetik tepkisini ölçmek ile araştırılmıştır. Yetişkin Zebrafish artan alkol konsantrasyonlarını (Şekil 3) muhafaza kontrast duyarlılık belirgin bir azalma göstermektedir. Balık artan konsantrasyonlarda alkol (Şek. 4) ile muamele edildiği uzamsal geniş bir frekans aralığı üzerinde genel olarak göz hız benzer bir doza bağımlı azalma gözlenebilir. Alkol tedavisi ayrıca doza bağımlı olarak artan uyaran hızı (Şekil 5) örneklediği gibi daha zorlu görevler de okülomotor performansını azaltır.
Şekil 1. Zebra balığı larvalarının gözü hızı uyarıcı kontrast bağlıdır. 10 tampon mutantlar ve 10 yabani tip kardeşler s değişen altında 5 dpf at analiz edildi Tümülüsü şerit kontrast koşulları. Grafik ortalaması göz hızı ± 1 SEM göstermektedir.
Şekil 2. Zebra balığı larvalarının gözü hızı uzaysal frekans bağlıdır. 10 tampon mutantlar ve 10 yabani-tip kardeşler 5 dpf, farklı uyarıcı şerit genişliği tabi olarak tarif analiz edildi. Grafik ortalaması göz hızı ± 1 SEM göstermektedir.
Şekil 3. Kontrast duyarlılık Yetişkin Zebra balığı gösterisi alkol konsantrasyona bağımlı azalma. Yetişkin Zebra balığı 30 dakika süreyle gösterilir ve değişen uyaran şerit kontrast koşulları altında analiz olarak alkol konsantrasyonları değişen muhafaza edildi. (: N = 11 kontrol grubu hariç) Grafik ortalama temporal-to-burun göz hızı ± grup başına 9 balık 1 SEM göstermektedir.
E 4 "src =" / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg "/>
Şekil 4,. Uyarıcı şerit genişliği geniş bir aralığı üzerinde genel olarak göz hareketi Yetişkin Zebrafish göstermektedir alkol konsantrasyona bağımlı bir azalma. Yetişkin Zebra balığı 30 dakika süreyle gösterilir ve değişen uyaran şerit genişliği koşullarında analiz gibi alkol konsantrasyonları değişen muhafaza edildi. (: N = 11 kontrol grubu hariç) Grafik ortalama temporal-to-burun göz hızı ± grup başına 9 balık 1 SEM göstermektedir.
Şekil 5,. Uyarıcı hızlarının geniş bir aralığında genel olarak göz hareketi Yetişkin Zebrafish göstermektedir alkol konsantrasyona bağımlı bir azalma. Yetişkin Zebra balığı 30 dakika süreyle gösterilir ve uyarıcı hız koşullarında değişen altında analiz olarak alkol konsantrasyonları değişen muhafaza edildi. Grafik ortalama temporal-to-burun göz hızı ± grup başına 9 balık (kontrol grubu hariç 1 SEM göstermektedir:n = 11).
Discussion
Görme fonksiyonunun çalışması için okr önemi uzun bir süre (Paskalya & Nicola 1996, 1997) için bilimsel camiada kabul edilmiştir, ve gerçekten paradigma ölçmek için girişimleri bir on yıl önce de başlamıştır. Paskalya ve Nicola (1996) motorlu göz hareketi video kaydı manuel analiz edildi çizgili davul, dönen bir sistem geliştirdi. Bu sistem repozisyon sık kılavuzu gerekli balık embriyo, immobilizasyonu eksikliğinden muzdarip ve sadece büyük zorluklarla gözler izleme hareketleri tespit olabilir. Bir adım daha ileri daha değişken bilgisayar oluşturulan uyaran sunum (.; Rinner ark, 2005a Roeser & Baier, 2003) sağlamak için bir video-yansıtılan çizgili davul kullanımı oldu.
Videoya kayıt çoğunlukla manuel, kare-kare analizi, son derece zahmetli olduğu kanıtlanmıştır ve gözlemci önyargı (Beck ve ark. Tarafından engellenmektedir belli bir dereceye kadar olan2004). Gerçek zamanlı otomatik analizi davranışsal geribildirim öğrenme mekanizmaları (Major ve ark., 2004) kullanımına izin vermek için önerilmiştir. Aydınlatma ve frekans kontrollü dönen uyarıcı kullanımı Beck et al tarafından öncülük edilmiştir. (2004). Bununla birlikte, sistemin sadece larvaları için orada kullanılmıştır tarif edilmiştir ve off-line analiz gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, VisioTracker böylece deney ders konusunda daha fazla esneklik ve spontan etkisi sağlayan, deney sırasında uyarıcı değiştirerek dahil uyaranlar, üzerinde tam kontrol sağlar. Ayrıca, VisioTracker tarafından kullanılan dijital canlandırma oluşturma çizgili bir uyaran davul (Beck ve ark., 2004) eylemsiz kütle ivme ile daha önce bahsedilen problemlerin üstesinden.
Metilselüloz tarafından Larva emniyet anlamlı göz hareketi ile karışmaz ve zebrafish refahı üzerinde herhangi bir uzun vadeli etkileri yoktur. Balık larvalarının başarılı olmuşturderi yoluyla oksijen kaynağı artan yaş (Qian ve ark., 2005) ile talebin yetersiz hale gelinceye kadar devam, birkaç gün boyunca metilselüloz gömülü.
Yetişkin balık yasaklama yöntemiyle hayvan üzerinde eşit derecede kolaydır. Hızla için farklı bir deney hayvanı değişimi opsiyon ile birlikte deney, ve kısa bir süre daha fazla sisteminin pozitif hayvan koruma özellikleri ekler. Solungaçları devamlı su ile yıkanmalıdır olduğundan, başak göz hareketleri ve görsel performans üzerindeki etkisini incelemek için seçtiğiniz herhangi bir kimyasal ile su için uygundur. Benzer şekilde, bir yıkama deneyi dışında deneyler arasında hayvan işlemek için gerek kalmadan ilave edilebilir.
Video resmindeki Piksel gürültü göz pozisyonu ve açısal hız son derece hassas ölçümler sağlayan, patentli VisioTracker yazılım algoritmaları yumuşatma minimize edilmiştir. Ayrıca, istatistiksel kolaylaştırmak içinanalizi, yazılım sabit hızda meydana gelir ve deneysel açıklamaya katkıda bulunmayan sakkadik hareketler filtrelenir. 7 video kareleri üzerinde hız eğrilerini bir ortalamasını sonra analiz kolaylaştırdı.
VisioTracker çok çeşitli araştırma alanlarında yeni bir boyut açar. Sistemi ve selefine zaten böyle görme keskinliği, kontrast duyarlılık ve hafif adaptasyon (Rinner ark., 2005a, Schonthaler ve ark., 2010) gibi parametreler kullanılarak, zebrafish larvaları görsel performansı ölçmek için başarıyla kullanılmaktadır, fonksiyonel analizi için . görsel transdüksiyon kaskad (.. örn. Rinner ark, 2005b, Renninger ark, 2011), ya da mutant zebrafish larva (örn. Schonthaler ark, 2005, 2008 görsel kusurları analiz üyelerinin manipülasyon sonrasında koni fotoreseptör; Bahadori ve ark., 2006). Görme sisteminin morfolojik ve fonksiyonel olgunlaşma bağımlılıkBu görme keskinliği ağırlıklı ama tamamen larva evreleri (Haug ve ark., 2010) fotoreseptör boşluğu ile sınırlı değildir göstermek için okr ölçümleri ile incelenmiştir.
VisioTracker yetişkin zebrafish ve diğer benzer büyüklükteki balık türlerinin (Mueller ve Neuhauß (2010), bu rapor) görme fonksiyonunu analiz etmek için eşit derecede uygundur.
Böyle araştırılması gereken maddeler yetişkin balık solungaçları çevreleyen su akışı eklenebilir sayede toksikoloji veya farmakoloji gibi çalışma alanlarında sistemi kullanmak için de düşünülebilir. Ayrıca, VisioTracker çok yönlülüğünü görme fonksiyonu, nöral devre fonksiyonu ve geliştirme, ya da sensorimotor kontrol (Huang ve Neuhauß, 2008 yılında yorum bakınız) ontogenetics, örneğin daha kapsamlı analizler sağlar.
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach ve Holger D. Russig Bu makalede kullanılan görsel performans izleme sistemi üretir TSE Systems GmbH çalışanlarıdır. Bu makalenin Üretim TSE Systems GmbH tarafından sponsor oldu. Stephan CF Neuhuass satılan her sistem için TSE Systems tarafından ücret alan Zürih Üniversitesi'nden bir çalışanıdır.
Acknowledgments
KPM AB 7.ÇP (RETICIRC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
- Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome. Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).
- Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms. Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).
- Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. Zebrafish, Practical Approach Series. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Visual acuity in zebrafish: behavior and histology. Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).
- Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).
- Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).
- Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish. Zebrafish. 2, 189-196 (2005).
- Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae. Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).
- Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).
- Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).
- Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles. Development. 135, 387-399 (2008).
- Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness. Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).
- Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision. Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).
