Summary
Die VisioTracker ist ein automatisiertes System für die quantitative Analyse der visuellen Leistung von Larven und kleine erwachsene Fische auf der Aufzeichnung von Augenbewegungen basieren. Es verfügt über die vollständige Kontrolle über visuelle Reiz Eigenschaften und Echtzeit-Analyse und ermöglicht High-Throughput-Forschung in Bereichen wie visuelle System Entwicklung und Funktion, Pharmakologie, neuronalen Schaltkreis Studien und sensomotorische Integration.
Abstract
Untersuchungen des visuellen Systems Entwicklung und Funktion erforderlich quantifizierbare Verhaltensmodelle der Sehleistung, die einfach zu entlocken, robust und einfach zu handhaben sind. Ein geeignetes Modell ist in der optokinetischen Antwort (OKR), eine reflexive Verhalten in allen Wirbeltieren aufgrund seiner hohen Selektionsdruck Wert gefunden. Der OKR beinhaltet langsame Reiz-folgenden Bewegungen der Augen mit schnellen Zurücksetzen Sakkaden abwechselten. Die Messung dieses Verhalten wird leicht aus im Zebrafisch-Larven durchgeführt, aufgrund seiner frühen und stabiles Einsetzen (vollständig nach 96 Stunden nach der Befruchtung (HPF) entwickelt), und dem die als umfassendes Wissen über Zebrafisch Genetik, seit Jahrzehnten eine der bevorzugten Modell Organismen in diesem Bereich. Inzwischen ist die Analyse von ähnlichen Mechanismen bei erwachsenen Fisch hat an Bedeutung gewonnen, insbesondere für pharmakologische und toxikologische Anwendungen.
Hier beschreiben wir VisioTracker, ein vollautomatisches High-throughput-System zur quantitativen Analyse der Sehleistung. Das System basiert auf der Forschung in der Arbeitsgruppe von Prof. Stephan Neuhauss durchgeführt und wurde von TSE Systems neu gestaltet. Es besteht aus einer Immobilisierungsvorrichtung für kleine Fische durch eine hochwertige Videokamera mit einem hochauflösenden Zoomobjektiv ausgestattet überwacht. Der Fisch wird von einem Behälter Siebtrommel umgeben, auf dem Computer-generierten Reizmuster projiziert werden kann. Augenbewegungen aufgezeichnet und automatisch durch den VisioTracker Software in Echtzeit analysiert.
Datenanalyse ermöglicht die sofortige Erkennung von Parametern wie langsame und schnelle Phasen-Dauer, Bewegung Taktfrequenz, langsame Phase Verstärkung, Sehschärfe und Kontrastempfindlichkeit.
Typische Ergebnisse ermöglichen zum Beispiel die schnelle Identifizierung von visuellen Systems Mutanten, die keine erkennbare Veränderung in Wildtyp-Morphologie zeigen, oder die Bestimmung der quantitativen Auswirkungen der pharmakologischen oder toxischen und mutagenenAgenten auf visuelle System-Performance.
Protocol
Ein. Zucht von Fischen
Die Embryonen wurden gehalten und unter Standard-Bedingungen (Brand 2002) angehoben und inszeniert nach Entwicklung in Tag nach der Befruchtung (dpf). Adulte und Larven wurden bei 5 dpf für Messungen genutzt werden.
2. Versuchsdurchführung
- Herstellung Instrument
Larven: Fish Larven wurden in 3% Embedded vorgewärmten (28 ° C) Methylcellulose Körperbewegungen zu verhindern. Die Embryonen wurden dorsal nach oben in den VisioTracker, mit Blick auf die Projektionsleinwand. Erwachsene Fische: Fische waren kurzzeitig betäubt in 300 mg / l MS-222, ausgestattet in die Sperrvorrichtung und in den VisioTracker. Vor den Messungen wurden initiiert, wurden sie von links nach 1-2 min erholen.
- Generation von Reizmuster
Reizmuster aus vertikalen schwarz-weißen Sinuswelle Gittern Drehen um die Fische geschaffenüber das proprietäre Software-Paket. Sie könnten durch das Software-Paket moduliert gemäß Wellenform, Kontrast, Helligkeit, Winkelgeschwindigkeit und Ortsfrequenz. Patterns wurden auf dem Bildschirm mit einem digitalen Lichtprojektor im VisioTracker enthaltenen projiziert. Der ungefähre Abstand zwischen dem Fischauge und der Bildschirm war 4,5 cm, und Projektion Größe auf dem Bildschirm betrug 360 deg horizontal und 55 Grad vertikal. Für Fischlarven, wurde Richtung Stimulation mit einer Frequenz von 0,33 Hz verändert werden, um Sakkade Frequenz zu reduzieren. Erwachsene Fische wurden unidirektional und stimuliert nur das Auge in temporal-to-nasaler Richtung stimuliert wurde berücksichtigt, da nasal-to-zeitliche Auge Geschwindigkeit im allgemeinen deutlich geringer und weniger konstant (siehe Müller und Neuhauss, 2010).
- Aufzeichnung der Augenbewegungen
A Hellfeldbild des Fisches Kopf wurde auf einer Infrarot-Videokamera zugeführt. Infrarot-Beleuchtung Fisch wurde f erfolgtrom unten. Die Kamera erfasst Bilder mit einer Rate von 5 Frames / Sekunde (Larven) oder 12,5 Frames / Sekunde (Erwachsene), bzw.. Die Bilder werden automatisch verarbeitet, korrigiert und geglättet zur Augenform. Eye Orientierung in Bezug auf die horizontale Achse wurde dann automatisch bestimmt und Auge Geschwindigkeit wurde durch das proprietäre Software-Paket berechnet. Kleine Bewegungen der Fische wurden automatisch durch die Software korrigiert werden. Alle Aufzeichnung und Analyse wurde in Echtzeit erreicht.
3. Post-experimentelle Datenverarbeitung
- Rohmessungen des Auges Geschwindigkeiten wurden Sakkaden gefiltert, um langsam Phasengeschwindigkeit extrahieren.
- Sakkade-gefilterten Auge Geschwindigkeitskurven wurden von einem laufenden Durchschnitt mit einem Schiebefenster von 7 Frames geglättet.
- Eye Geschwindigkeit wurde über Frames mit identischen Stimulus-Bedingungen gemittelt.
- Für Fischlarven wurde eye Geschwindigkeit über beiden Augen gemittelt.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Für Larven Zebrafisch, wurde der Stoßfänger mutierten gewählt. In dieser Mutante, Linsenepithelzellen hyperproliferate, was zu einer reduzierten Größe und ektopische Linse Position der Linse. Diese morphologischen Veränderungen werden durch eine deutliche Reduzierung der Kontrastempfindlichkeit und Sehschärfe (Schönthaler et al., 2010) reflektiert wird. Abbildung 1 zeigt den Unterschied in Kontrastempfindlichkeit des Stoßfängers Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Geschwister. Stoßfänger Mutanten immer nicht in Auge Geschwindigkeit wie die Stimulus dagegen Rückgänge einstellen. Analog dazu, wenn der Reiz Raumfrequenz erhöht wird, dh die Impulse Streifenbreite verringert wird, Stoßfänger Mutanten ebenfalls demonstrieren Sehschärfe (Abb. 2) gesenkt
Die Abhängigkeit von erwachsenen Zebrafisch visual Leistung auf Umgebungsbedingungen wurde durch Unterziehen der Fische zu variierenden Konzentrationen von Alkohol im Tank Wasser für 30 Minuten und anschließendes Messen der optokinetischen Reaktion unter variierenden Stimulus Bedingungen untersucht. Adult Zebrafisch zeigen eine deutliche Reduktion der Kontrastempfindlichkeit, wenn in zunehmenden Alkohol-Konzentrationen (Abb. 3) erhalten. Eine ähnliche dosisabhängige Reduzierung der gesamten Auges Geschwindigkeit über einen weiten Bereich von räumlichen Frequenzen konnte beobachtet werden, wenn der Fisch mit steigender Alkoholkonzentration (Abb. 4) behandelt wurden, werden. Alkohol-Behandlung weiterhin dosisabhängig reduziert okulomotorischen Leistung bei anspruchsvolleren Aufgaben wie durch erhöhte Reiz Geschwindigkeiten (Abb. 5) veranschaulicht.
Abbildung 1. Zebrafisch Larven Auge Geschwindigkeit ist abhängig vom Stimulus Kontrast. 10 Stoßfänger Mutanten und 10 Wildtyp-Geschwister wurden bei 5 dpf unter variierenden s analysiert timulus Streifen Kontrastverhältnisse. Die Grafik zeigt den durchschnittlichen Auge Geschwindigkeit ± 1 SEM.
Abbildung 2. Zebrafisch Larven Auge Geschwindigkeit ist abhängig von Ortsfrequenz. 10 Stoßfänger Mutanten und 10 Wildtyp-Geschwister wurden zu verschiedenen Stimulus Streifenbreiten bei 5 dpf unterzogen und wie beschrieben analysiert. Die Grafik zeigt den durchschnittlichen Auge Geschwindigkeit ± 1 SEM.
Abbildung 3. Adult Zebrafisch zeigen Alkoholkonzentration-abhängige Reduktion der Kontrastempfindlichkeit. Adult Zebrafisch wurden in unterschiedlichen Alkoholkonzentrationen für 30 Minuten angegeben und analysiert unter variierenden Stimulus Streifen Gegensatz Bedingungen gehalten. Die Grafik zeigt die durchschnittliche zeitliche-to-nasal Auge Geschwindigkeit ± 1 SEM von 9 Fisch pro Gruppe (außer Kontrollgruppe: n = 11).
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Abbildung 4. Adult Zebrafisch zeigen Alkoholkonzentration-abhängige Verringerung der gesamten Augenbewegung über einen weiten Bereich von Stimulus Streifenbreite. Adult Zebrafisch wurden in unterschiedlichen Alkoholkonzentrationen für 30 Minuten angegeben und analysiert unter variierenden Stimulus Streifenbreite Bedingungen gehalten. Die Grafik zeigt die durchschnittliche zeitliche-to-nasal Auge Geschwindigkeit ± 1 SEM von 9 Fisch pro Gruppe (außer Kontrollgruppe: n = 11).
Abbildung 5. Adult Zebrafisch zeigen Alkoholkonzentration-abhängige Verringerung der gesamten Augenbewegung über einen weiten Bereich von Stimulus Geschwindigkeiten. Adult Zebrafisch wurden in unterschiedlichen Alkoholkonzentrationen für 30 Minuten angegeben und analysiert unter variierenden Stimulus Geschwindigkeit Bedingungen gehalten. Die Grafik zeigt die durchschnittliche zeitliche-to-nasal Auge Geschwindigkeit ± 1 SEM von 9 Fisch pro Gruppe (außer Kontrollgruppe:n = 11).
Discussion
Die Bedeutung des OKR für das Studium der visuellen Funktion hat in der wissenschaftlichen Gemeinschaft wurde für eine lange Zeit (Ostern & Nicola 1996, 1997) erkannt und versucht, wirklich zu quantifizieren das Paradigma haben auch vor über einem Jahrzehnt begonnen. Ostern und Nicola (1996) ein System entwickelt, mit motorisierten rotierenden gestreiften Schlagzeug, wo die Video-Aufzeichnung der Augenbewegungen wurde manuell analysiert. Dieses System litt unter dem Mangel an Immobilisierung des Fischembryo, die häufige manuelle Neupositionierung erforderlich und könnte die Tracking-Bewegungen der Augen nur sehr schwer zu erkennen. Ein Schritt nach vorn war die Verwendung eines Video-projizierten gestreiften Trommel für mehr variable Computer generiert Reizdarbietung (Roeser & Baier, 2003. Rinner et al, 2005a) zu ermöglichen.
Die meist manuell, Frame-by-Frame-Analyse der Videoaufnahmen Aufnahmen erweist sich als äußerst mühsam, und bis zu einem gewissen Grad durch Beobachter bias (Beck et al. Behindert,2004). Automatisierte Analyse in Echtzeit wurde vorgeschlagen, um die Verwendung von Verhaltens Rückfragen Lernmechanismen (Major et al., 2004) zu ermöglichen. Der Einsatz von Infrarot-Beleuchtung und Frequenz-gesteuerten rotierenden Reize wurde von Beck et al Pionierarbeit. (2004). Das beschriebene System hat es nur für Larven verwendet wurde, und zur Analyse die off-line durchgeführt wird. Weiterhin erlaubt die vollständige Kontrolle über VisioTracker Stimuli, einschließlich Ändern des Stimulus während des Experiments, wodurch eine größere Flexibilität und spontane Einfluss auf den Verlauf des Experiments. Außerdem überwindet die digitale Impulse durch die Schaffung VisioTracker verwendet Probleme bereits erwähnt mit Beschleunigung der trägen Masse eines gestreiften Stimulus Trommel (Beck et al., 2004).
Larven Zurückhaltung Methylcellulose nicht signifikant mit der Augenbewegung stören und hat keine langfristige Auswirkungen auf Zebrafisch Wohlbefinden. Fischlarven wurden erfolgreichinstandgehalten Methylcellulose mehrere Tage eingebetteten, bis Sauerstoffzufuhr durch die Haut unzureichend für die Nachfrage mit zunehmendem Alter (Qian et al., 2005).
Die erwachsenen Fische Rückhaltemittel Methode ist ebenso einfach auf das Tier. Die kurze Dauer des Experiments, mit der Möglichkeit, schnell Austausch der Versuchstiere für einen anderen ein gekoppelt, weiter ergänzt die positiven Aspekte des Tierschutzes des Systems. Da die Kiemen kontinuierlich mit Wasser gespült werden, ist es zweckmäßig, Aufstockung der Wasser mit Chemikalien der Wahl, um seine Wirkung auf Augenbewegungen und Sehleistung zu studieren. Ebenso wird eine wash-out-Experiment kann ohne die Notwendigkeit, das zwischen den Experimenten tierischen handhaben zugesetzt werden.
Pixelrauschen im Video-Bild wurde durch Glätten des proprietären Algorithmen VisioTracker Software minimiert, so dass hochpräzise Messungen der Augenposition und Winkelgeschwindigkeit. Weiterhin erleichtert statistischenAnalyse, die Software aus Sakkaden die in festen Geschwindigkeit auftreten und nicht von dem experimentellen Anweisung beitragen filtriert. Eine Mittelung der Geschwindigkeit Kurven über 7 Video-Frames erleichtert eine spätere Analyse.
Die VisioTracker eröffnet eine neue Dimension für viele verschiedene Forschungsbereiche. Das System und seine Vorgänger bereits erfolgreich zur Sehleistung in Zebrafischlarven quantifizieren, anhand von Parametern wie Sehschärfe, Kontrastempfindlichkeit und leichte Anpassung (Rinner et al., 2005a, Schönthaler et al., 2010), für die funktionelle Analyse Zapfen-Photorezeptoren nach Manipulation der Mitglieder des visuellen transduktionskaskade (zB Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011.)., oder die Analyse von Fehlsichtigkeiten in der Mutante Zebrafisch-Larven (zB Schönthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). Die Interdependenz von morphologischen und funktionellen Reifung des visuellen Systemsdurch OKR Messungen wurden untersucht, um nachzuweisen, dass die Sehschärfe hauptsächlich, aber nicht vollständig durch Photorezeptor Abstand an Larvenstadien (Haug et al., 2010) beschränkt.
Die VisioTracker eignet sich gleichermaßen zur visuellen Funktion bei erwachsenen Zebrafisch und anderen ähnlich großen Fischarten (Mueller und Neuhauss (2010), dieser Bericht) zu analysieren.
Es ist auch denkbar, das System in Forschungsbereichen wie Toxikologie oder der Pharmakologie, wobei Substanzen untersucht werden, um den Wasserfluss rund um die erwachsenen Fische Kiemen hinzugefügt werden könnten nutzen. Darüber hinaus ermöglicht die Vielseitigkeit der VisioTracker weitere gründliche Analysen z. B. der ontogenetics der Sehfunktion, neuronalen Schaltkreis-Funktion und Entwicklung oder sensomotorische Steuerung (siehe Beitrag in Huang & Neuhauss, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach und Holger D. Russig sind Mitarbeiter von TSE Systems GmbH, die die visuelle Performance-Tracking-System in diesem Artikel verwendet produziert. Die Produktion dieser Artikel wurde von TSE Systems GmbH gesponsert. Stephan CF Neuhuass ist ein Mitarbeiter von der Universität Zürich, die Vergütung erhält von TSE Systems für jedes System verkauft.
Acknowledgments
KPM wurde von EU FP7 (RETICIRC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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