Summary
ذبابة الفاكهة،
Abstract
في دراسة الشبكات العصبية من حيث وظيفتها في السلوك، ويجب علينا تحليل كيفية عمل الخلايا العصبية عندما يتم إنشاء كل نمط سلوكي. وبالتالي، التسجيلات في وقت واحد من نشاط الخلايا العصبية والسلوك ضرورية لربط نشاط الدماغ إلى السلوك. لتحليل هذه السلوكية، ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يتيح لنا أن تتضمن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا مثل GCaMP 1، لمراقبة نشاط الخلايا العصبية، واستخدام التلاعب الجيني متطورة لتقنيات توليد الحرارة optogenetic أو على وجه التحديد أو تفعيل الخلايا العصبية التي تم تحديدها 2-5. وقد أدى استخدام تقنية توليد الحرارة لنا للعثور على الخلايا العصبية الحرجة لسلوك التغذية (الفيضانات وآخرون، تحت المراجعة). كجزء رئيسي من سلوك التغذية، وذبابة الفاكهة الكبار تمتد خرطوم من أجل تغذية 6 (خرطوم استجابة الإرشاد؛ PER)، واستجابة لحافز الحلو من الخلايا الحسية على خرطوم الفيل، أو الجفن. شاركmbining البروتوكول بالنسبة بنسبة 7 مع الكالسيوم تقنية التصوير 8 باستخدام GCaMP3.0 1، 9، وقد أنشأت نظام تجريبي، حيث يمكننا مراقبة نشاط الخلايا العصبية في مركز التغذية - العقدة suboesophageal (مجموعة العمليات الخاصة)، في وقت واحد مع الملاحظة السلوكية للخرطوم. لقد صممت جهازا ("يطير المخ لايف التصوير والمرحلة الكهربية": "الذباب") لاستيعاب الكبار ذبابة الفاكهة، مما يسمح للخرطوم لها من التحرك بحرية في حين يتعرض لها الدماغ إلى الحمام لكا 2 + التصوير من خلال عدسة غمر المياه . الذباب هو أيضا مناسبة لأنواع كثيرة من تجارب حية في عقول ذبابة مثل تسجيل الكهربية أو وقت التصوير مرور مورفولوجيا متشابك. لأنه يمكن أن ينتج عن التصوير الحي مرتبطة مباشرة مع سلوك نصيب في وقت واحد، وهذا يمكن منهجية توفير نظام ممتاز تجريبية لدراسة ومعالجة المعلومات من الشبكات العصبية، وكيف أن هذا جويقترن النشاط ellular لعمليات التجميل والذاكرة.
Protocol
1. بناء على الذباب
- تشكيل منصة من الغطاء من 35 طبق الصقر ملم من قبل ذوبان جدار ونحت لتشكيل زاوية مناسبة وسماكة (الشكل 1A، الشكل 2). حفر ثقب في منصة لقبول رئيس ذبابة (الشكل 1A، ب)، مثل التي يتعرض لها بحرية فمها إلى خارج الغرفة (الشكل 1A). قطع نهاية طرف Pipetman، مع حجم المطابقة التي يجب مراعاتها الطاير. الغراء غيض إلى منصة كما هو مبين في الشكل 1A لاستكمال الذباب (الشكل 2).
2. إعداد تحلق لمراقبة
- تجويع ذبابة البالغين لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل التجربة عن طريق وضعها في قارورة فقط مع منشفة ورقية مبللة، إذا الجوع أمر ضروري.
- تخدير الذبابة عن طريق وضعها في أنبوب من البلاستيك 15ml يقف على الجليد.
- باستخدام ملقط، اضافة الى وجود ذبابة في غرفة للالذباب ودفع برفق حتى ذبابة في أنه غير قادر على التحرك. ثم، اضافة الى وجود سد على الإبقاء على الطاير. (الشكل 1A، ب).
- ختم أجزاء المحيطة بها من خرطوم الفيل القريبة (المنبر) إلى الحافة الداخلية للحفرة، ضع كمية صغيرة من الضوء تقديد الغراء (Tetric EvoFlow) على الجانبين، وفوق المنصة من الخارج (الأسهم في الشكل 3). أيضا تطبيق الصمغ من داخل تسير رحلات الى الفضاء بين الجزء الظهري للرأس والحافة الداخلية للحفرة (الشكل 1B). للسماح المنصة على التحرك بحرية، ينبغي توخي الحذر لمنع أي الغراء من لمس المنصة باستخدام رمش (أو شيء مشابه) لنشر الغراء. أخيرا، علاج الغراء مع أضعف من إضاءة الضوء الأزرق كافية لعلاج لتجنب إتلاف ذبابة من الحرارة المفرطة. إزالة المكونات.
- ويجوز توظيف الموضوع إلى عقد المنصة رفعت جزئيا (السهم في الشكل 3) لتحقيق الاستقرار في ذبابة "رأس عن طريق تجنب عثرة للجزء البلعومي إلى مجموعة العمليات الخاصة، وفضح كل جزء بطني من مجموعة العمليات الخاصة، وخاصة بالنسبة للمحطات التصوير قبل المشبكي من الخلايا العصبية Gr5a 8، التي تشملها جزء من البلعوم عندما يتم سحب الكامل للخرطوم.
- ملء سطح منصة مع محتوية على سكر خالية من المياه المالحة (مم): كلوريد الصوديوم، 140؛ بوكل، 2؛ MgCl 2، 4.5؛ CaCl 2، 1،5، وHEPES هيدروكسيد الصوديوم، 5 مع الرقم الهيدروجيني من 7.1 10. هذا المالحة السكروز خالية من لديه تحظرب مشابهة لتلك التي يشيع استخدامها السكروز التي تحتوي على salines مثل HL3.1 11.
- فتح الكبسولة رئيس باستخدام شفرة التنغستن والملقط مع نصائح شحذ مثل المقص، الذي هو جهاز حسب الطلب وصممت في الأصل من قبل الدكتور Kageyuki Yamaoka، اليابان، للقص بشرة والقصبة الهوائية لفضح SOG (الشكل 4). تم قطع حافة بطني من بشرة الرأس وبطني وقت ممكن في حين خفض حافة ظهري لم يكن حاسما كما. أولا، إجراء شق طريقالحافة الخلفية باستخدام شفرة التنغستن. ثم، من خلال خفض الجانب والحواف الأمامية باستخدام ملقط شحذ. وينبغي أن يرفع قطعة إهاب قطع مع ملقط وإزالتها. ينبغي قطع الأعصاب وantennal هوائيات بها ملقط شحذ.
- من أجل تجنب الآثار حركة خلال التسجيلات، يجب أن يستقر في الدماغ عن طريق إزالة أجزاء معينة من الذباب. أولا، وإزالة أكياس الهواء بشكل انتقائي بين مجموعة العمليات الخاصة، وبشرة. قطع المريء في نهاية نحو البلعوم وعند نهاية الخوض في مجموعة العمليات الخاصة لإزالة علاقة بين البلعوم والدماغ. ثم سحب من العضلات 16 12، وأخيرا، أي فصل القصبة الهوائية يربط بين الدماغ وإهاب و.
- وضعنا لدينا الذباب على مرحلة مجهر BX51WI أوليمبوس متصلة نظام القرص مجهر متحد البؤر الغزل (Improvision في PerkinElmer) (الشكل 5). ومغمورة عدسة غمر المياه، على سبيل المثال 40X/0.8 NA، في حمام (الشكل 6
3. كاليفورنيا 2 + التصوير من الدماغ
- كاليفورنيا 2 + التصوير باستخدام GCaMP3.0 1، تم تنفيذ 9 من خلال الأسلوب الذي أنشأه ماريلا وآخرون. 8 (الشكل 6). باستخدام مجهر القرص الغزل مبائر (Improvision)، وتأخذ قسما واحد بصري في 4Hz مع زمن التعرض لل122ms باستخدام الليزر 491nm الإثارة، مع التركيز على المنطقة من مصلحة (هيئة خلية من الخلايا العصبية الحركية، أو عصبون 1، أو محطات قبل المشبكي من الخلايا العصبية الحسية الذوقية) مع برنامج السرعة، النسخة. 4.3 (Improvision).
4. تحفيز خرطوم
- نضح 100mM حل السكروز مائي إلى إبرة تحت الجلد مع فتيلة صغيرة (مصنوعة من الورق اشي اليابانية، انظر الجدول الكواشف محددة) جاحظ من طرف (الشكل 7).
- تصريف قطرة صغيرة من محلول السكروز على الفتيل، ثم، نضح به، قبل احتساب فوراه تطبيق ورقة اشي غارقة الفتيل إلى غيض من خرطوم الفيل. يجب فقط الفتيل ورقة اشي تطبق لحظة لتجنب شبع (الشكل 8). رصد استجابة ملحق خرطوم الفيل (PER) السلوك باستخدام كاميرا CCD تعلق على مجهر تشريح (الشكل 5) في وقت واحد مع كا 2 + التصوير. يجب أن تؤخذ البيانات في غضون ساعة واحدة بعد بدء تشريح لأنه لم يتم الحفاظ على استجابة PER أكثر من ساعة واحدة في ظل هذه الظروف.
5. ممثل النتائج
تم الإبلاغ عن الخلايا العصبية الحركية للمنقلة المنصة، وزوج من العضلات الرئيسية المسؤولة عن رفع المنصة لتمديد خرطوم، لاظهار ردود قوية للمؤثرات الحلو 13. الشكل 9 يبين كا 2 + من خلال إشارات GCaMP3.0 1 و 9 التي أعرب عنها غل 4 سائق، E49 13، من هيئة خلية من الخلايا العصبية الحركية. كما هو موضح في الفيديو، وروبووقد لوحظ الحادي الواحد في تزامن مع زيادة في الكالسيوم 2 + إشارة.
الشكل 1. التخطيطي لتصوير الدماغ لايف الطيران والمرحلة الكهربية (الذباب). 1، وقد تم بناء هذا الذباب أن زاوية الجدار يسمح لرأس ذبابة على الخروج على التوالي. ثلاثة قطاعات من خرطوم الذبابة هي مرمزة، والمنبر هو أرجواني. يتم إدراج الطيران في غرفة مع ملقط، وقطعة من قطع نهاية طرف Pipetman موصول الجزء الخلفي من غرفة لقطع الطريق على الطاير من الهرب. ب، وبالملل وثقب لتتوافق مع رأس الذبابة. وأغلقت الثغرات المتبقية مع ضوء تقديد الغراء كما هو مبين لضمان عدم وجود أي تسرب. بعد الغراء قد شفي، تتم إزالة معلومات سرية Pipetman باعتبارها المكونات. يسكب المياه المالحة إلى الذباب بحيث يتم تغطيتها بالكامل من سطح الدماغ. وينبغي التأكد من عدم وجود تسرب المياه المالحةجى للخروج الى نهاية الأمامي من رأس ذبابة. المنطقة المظللة محاطة خط متقطع في لوحة ب يظهر جزء منه إلى أن تشريح خارج.
الشكل 2. صورة من الذباب. ويتكون جدار على شكل هلال من الغراء (من مسدس الغراء) للسيطرة على تدفق من محلول ملحي خلال نضح، وإلى تقليل كمية المياه المالحة المستخدمة.
الشكل 3. شنت مباشر نظرا للحظر الطيران في الذباب. هذه الصورة تبين كيف تم تعيين ذبابة في الذباب، وكيف يتم تطبيق الغراء ضوء تقديد حول الرأس من ذبابة (الأسهم) لإنشاء ختم المالحة واقية. إذا أي تسرب المياه المالحة من خلال لخرطوم الفيل من ذبابة، ثم التجربة ستفشل. الخيط (النصال) مصطفة على المرحلة هو الاستمرار على خرطوم الفيل في الموقف، وذلك حتى لا يكون retrac تماما تيد. وإلا فإنه عرقلة جزء بطني أكثر من مجموعة العمليات الخاصة وتتسبب في حركة القطع الأثرية.
الشكل 4. أعلى نظرا للذباب مع ذبابة تشريح. هذه الصورة تبين مجموعة العمليات الخاصة تتعرض للبشرة إزالة ذبابة التالية. المريء، العضلات 16 و القصبات الهوائية متصلة إلى الدماغ، وكذلك كما تم اختيار الهواء وإزالة أكياس لمنعهم من تعكير الدماغ، الذي يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية في إشارات الكالسيوم.
الشكل 5. أجهزة الرصد. يتم تجميع هذا الجهاز من مجهر BX51WI أوليمبوس تعلق على نظام القرص مجهر متحد البؤر الغزل (Improvision)، والجانب محمولة على نيكون SMZ800 المجهر. هذا الإعداد يسمح للتصوير الحية من خلال نشاط الدماغ لكل سلوك.
6 "SRC =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
الشكل 6. صور فوتوغرافية لإظهار جانب نظرا للذباب. محصورة في طبقة رقيقة من محلول ملحي بين العدسة مياه الغمر 40X والذبابه.
الشكل 7. التخطيطي لصنع الفتيل ورقة اشي. Gampi-اشي ورقة هي شهادة جامعية اليابانية التقليدية التي هي رقيقة للغاية وسلسة (Haibara، اليابان). كما أنها قوية جدا ويمكن الاحتفاظ بها على كمية كبيرة من السائل. يجب أن تقطع ورقة اشي في شبه منحرف مع أبعاد محددة للغاية؛ 0.3 مم و 0.7 مم في العرض، و 4-5 ملم في الطول (أ). ثم يتم إدخال هذا شبه منحرف من الجانب مم 0.7 في غيض من إبرة تحت الجلد 23 G، ويمكن أيضا أن يستقر من خلال ادراج 1 دبوس الحشرات، والتي يعكف على شكل-V (ب) (ج)، ورقة يصبح اشي بعد التعرض شفافإلى السائل، مما يجعلها مثالية لهذه التجربة.
الرقم 8. التحفيز للخرطوم على الذباب مع الفتيل-اشي. يتم تطبيق الفتيل ورقة اشي على طرف إبرة تحت الجلد لحظة باستخدام مناور المقود بيد واحدة. يتم توصيل إبرة عن طريق انبوب مرن لحاقن التلاعب بها مع من ناحية أخرى، لالشفط والتفريغ حل السكروز.
الشكل 9. ممثل النتائج. 1، ولكل سلوك سجلت من خلال كاميرا مثبتة على اتفاقية مكافحة التصحر stereomicroscope. أمامي وجهات النظر من ذبابة المتعطشة مع خرطوم الموسعة (الأسهم)، قبل ان التحفيز، وبناء على التحفيز، وبعد التحفيز مع فتيلة التي تحتوي على 100 مائي السكروز حل ملم (رأس السهم). ويتم إنجاز الإضاءة بواسطة ليزر 491 نانومتر المستخدمةلب GCaMP. مضان، السكروز بفعل GCaMP 3.0 استجابة في الخلايا العصبية الحركية للمنقلة من عضلة المنصة في الدولة المتعطشة. لوحة أعلى، وذلك قبل التحفيز، واللوحة السفلية، مباشرة بعد التحفيز. مقياس بار، و 10 ميكرون. ج، القياس الكمي لاستجابة السكروز بفعل 3.0 GCaMP. والخلايا العصبية الحركية تستجيب لتحفيز السكروز بواسطة زيادة حادة في مضان، تليها مرحلة ترميم عدة ثوان إلى خط الأساس.
Discussion
الذباب يسمح للتسجيل في وقت واحد من الكالسيوم 2 + إشارات والسلوك الواحد. حتى مع لوحظ في الدماغ عرضة للسلوك ملحي طبيعي. استخدام الفتيل Gampi-اشي بدلا من الفتيل Kimwipe المستخدمة في method7 في شعري الأصلي يسهل سلوك استنساخه للغاية ومستقر لكل والابتعاد عن ضرورة أن تصبح ماهرة في صنع واختيار الفتيل Kimwipe جيد. صرح النصائح التجريبية فوق سمح لنا لتجنب الاضطرابات بنجاح من قبل حركة خرطوم الفيل، مما أدى إلى تسجيل مستقر جدا من الكالسيوم 2 مع انخفاض مستوى الضجيج اشارات +. في بعض الأحيان، كان إزالة الأنسجة ليست كافية لكشف الخلايا أو قمع حركة على نحو كاف، مما يؤدي إلى نتائج سيئة. أنتج أكثر من 80٪ من التحضيرات ولكن، مرة كنا المهرة، وتحقيق نتائج جيدة. هذه المنهجية ليست فقط لكا 2 + التصوير، ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع أي التصوير الحي مع مراعاة لكل سلوك. على سبيل المثال، يمكننا الوصول إلى أي خلية من خلالاستخدام كهربائي لتسجيل مباشرة النشاط. جنبا إلى جنب مع المجهري إثارة اثنين من الفوتون، ونحن قادرون على أداء ووقت التصوير مضي هيكل متشابك، والتي يمكن أن تكون ذات صلة إلى تغييرات سلوكية. لذلك، وهذه الطريقة من تصوير الدماغ مع الملاحظة السلوكية ليست فقط قيمة للتشريح وظيفي لشبكة الخلايا العصبية، ولكن يمكن استخدامها كأداة قوية لربط متشابك 14 اللدونة للآليات وراء الذاكرة.
Acknowledgments
أشكر L واتانابي، Gorczyca M وأعضاء آخرين في مختبر يوشيهارا لتعليقات مفيدة والمناقشة. أشكر ك. سكوت وLooger L. للأسهم الطاير، S يوكوياما لعرض التجارب، شينيا Iguchi للحصول على المساعدة التقنية، وNobuko يوشيهارا للحصول على معلومات مادية. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية MH85958 المنح، ومؤسسة ورسستر في بلادي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
