Summary
Meyve sineği,
Abstract
Davranış, işlevi açısından nöron ağları çalışmak için, her bir davranış paterni oluşturulduğunda nöronların nasıl işlediğini analiz etmelidir. Böylece, nöronal aktivite ve davranış eşzamanlı kayıtlar davranış beyin aktivitesini ilişkilendirmek için gereklidir. Bu tür davranış analizleri için, meyve sineği Drosophila melanogaster, bize, bu GCaMP 1 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri dahil etmek nöronal aktivitenin izlenmesi ve özellikle nöronlar 2-5 tespit aktif hale getirmenin optogenetic veya thermogenetic teknikleri için sofistike genetik manipülasyonlar kullanmanıza olanak sağlar. Bir thermogenetic tekniği kullanın beslenme davranışı için kritik nöronlar (Taşkın ve ark., Revizyon altında) bulmak için bize yol açmıştır. Onun probosis veya tarsi üzerinde duyusal hücrelerin tatlı bir uyarana yanıt; davranışı bir beslenme ana parçası olarak, bir Drosophila yetişkin 6 (PER probosis uzantısı yanıt) beslenmek için burnumun uzanır. Codavranışsal gözlem ile eş zamanlı olarak, suboesophageal ganglion (SOG) - GCaMP3.0 1 kullanarak bir kalsiyum görüntüleme tekniği 8, 9 ile 7 BAŞINA için protokol mbining, sanırım besleme merkezinde nöronların etkinliğini izleyebilir deneysel bir sistemi kurduk burnumun. Onun beyni bir suya daldırma merceğinden + görüntüleme Ca 2 banyo maruz iken kendi burnumun serbestçe hareket etmelerine olanak sağlayacak, Drosophila yetişkin yerleştirmek için: Ben bir aparat ("Sinekler" "Fly beyin Canlı Görüntüleme ve Elektrofizyoloji Sahne") tasarladı . Sinekler ayrıca elektrofizyolojik kayıt veya sinaptik morfoloji time lapse görüntüleme gibi sinek beyinleri canlı deneyler birçok türleri için uygundur. Canlı görüntüleme sonuçlarını doğrudan eşzamanlı PER davranışı ile korele edilebildiği için, bu yöntemi nöron ağlarının bilgi işlem eğitim için mükemmel bir deneysel sistem sağlar ve nasıl bu c edebilirsinizellular aktivitesi plastik süreçleri ve bellek bağlanmıştır.
Protocol
1. Sinekler oluşturma
- Yanak eritilmesi ve uygun bir açı ve kalınlık (; Şekil 2, Şekil 1a) oluşturacak şekilde bu oyarak 35 mm Falcon kabının kapağını bir platform şekillendirmeye. Ağız serbestçe odası (Şekil 1a) ve dışında maruz kaldığı bu tür sinek başı (Şekil 1a, b) kabul etmek platformda bir delik delin. Sinek dikkat edilmesi eşleşen boyutu ile, bir Pipetman ucu sonu kesin. Platforma tutkal ucu sinekler (Şekil 2) tamamlamak için Şekil 1a'da gösterilen.
2. Gözlem için Fly hazırlanması
- 25 24 saat için yetişkin bir sinek açlıktan ° C açlık gerekirse, sadece ıslak bir kağıt havlu ile bir şişe yerleştirerek deney öncesinde.
- Buz üzerinde ayakta duran bir 15ml plastik tüp yerleştirerek sinek uyutmak.
- Forseps kullanarak odasının içine bir sinek eklemekSinekler ve hareket edemiyor kadar hafifçe sinek itin. Sonra, sinek korumak için bir fiş takın. (Şekil 1a, b).
- Deliğinin iç kenarı ile proksimal hortum (rostrum) çevreleyen parça mühürlemek; taraftan ışık sertleşen yapıştırıcı (Tetric EvoFlow), az miktarda uygulanır ve ikinci rostrum yukarıda dışındaki (Şekil 3 'de oklar). Sineklerin içten kafasının dorsal parçası ve deliğinin iç kenarı (Şekil 1b) arasındaki boşluğa tutkal de geçerlidir. Kürsüden serbestçe hareket etmesine izin vermek için, bakım tutkal yaymak için bir kirpik (veya benzer bir şey) kullanarak kürsüde dokunmadan herhangi bir tutkal önlemek için alınmalıdır. Son olarak, aşırı sıcaklardan sinek zarar vermemek için tedavi için yeterli mavi ışık zayıf aydınlatma ile tutkal tedavi. Fişi çıkarın.
- Kürsüden kısmen (Şekil 3 ok) kaldırdı tutmak için bir konu sinek stabilize etmek için istihdam edilebilir 'SOG için faringeal bölümünün yumru kaçınarak ve özellikle burnumun tamamen geri çekilir farenks parçası ile kaplıdır Gr5a nöronların 8, görüntüleme presinaptik terminaller için, SOG ventral kısmı açığa tarafından kafası.
- ; KCl, 2; MgCl2, 4.5; CaCl2, 1.5; ve HEPES-NaOH, 5 7,1 10 arasında bir pH değerine sahip NaCl, 140: bir şeker içermeyen tuzlu su ihtiva eden (mm) ile platform yüzeyi doldurun. Bu sakaroz içermeyen tuzlu sık kullanılan olanlar sukroz içeren bu HL3.1 11 olarak Salines benzer toniklik vardır.
- Ismarlama bir cihaz ve ilk SOG (Şekil 4) ortaya çıkarmak için manikür ve trakea klibi Dr Kageyuki Yamaoka, Japonya tarafından tasarlanmış makas gibi keskin uçlu bir tungsten bıçak ve forseps kullanarak baş kapsülü açın. Dorsal kenar kesim gibi kritik değildi oysa kafa kütikül ventral kenarı mümkün olduğunca ventral olarak kesildi. Birincisi, üzerinden bir kesi yapmakarka kenarı bir tungsten bıçak kullanarak. Sonra, tarafı boyunca kesilmiş ve keskin forseps kullanılarak, ön kenar. Cut manikür parçası forseps ile kaldırdı ve çıkarılmalıdır. Anten ve antennal sinirler bilenmiş forseps tarafından kesilmelidir.
- Kayıt sırasında hareket eşya önlemek amacıyla, beyin sineği bazı kısımlarının çıkarılması ile stabilize edilmesi gerekir. İlk olarak, seçici SOG ve tırnak arasında hava çuval kaldırın. Farenks doğru sonunda ve farenks ve beyin arasındaki bağlantıyı kaldırmak için SOG girecek sonunda yemek borusu kesin. Sonra Muscle 16 12 çekin ve son olarak beyin ve kütikül bağlayan herhangi bir trakea ayırın.
- Biz bir iplik diski konfokal mikroskop sistemi (Perkin Elmer içinde Improvision) (Şekil 5) bağlı bir Olympus BX51WI mikroskop sahnede bizim Sinekler ayarlayın. Bir suya daldırma objektif, örneğin 40X/0.8 NA, banyo (Şekil 6 batırılır edildi
3. Ca 2 + Beyin Görüntüleme
- Ca2 + görüntüleme GCaMP3.0 kullanılarak 1, 9 Marella ark tarafından belirlenen yöntemi vasıtasıyla yapıldı. 8 (Şekil 6). Bir iplik Disk konfokal mikroskop (Improvision) kullanarak, ilgi bölgedeki (motor nöron bir hücre gövdesi, ya da bir internöron veya presinaptik terminallerinde odaklanarak, 491nm uyarılma lazer kullanarak 122ms bir pozlama süresi ile 4Hz tek bir optik bölümü almak tat duyu nöronlarının) Hız yazılım, sürüm ile. 4,3 (Improvision).
4. Probosis Uyarıcı
- Ucu (Şekil 7) dışarı çıkan küçük bir fitil (Japon washi kağıttan yapılmış, özel reaktiflerin bkz. Tablo) hipodermik bir iğne içine 100mM sulu sakaroz çözeltisini aspire.
- Fitil üzerine sukroz çözeltisi, küçük bir damla deşarj, daha sonra, hemen befor, bu aspireburnumun ucu ıslanmış washi kağıt fitil uygulayarak e. Washi kağıt fitil sadece doyma (Şekil 8) önlemek için bir an için uygulanmalıdır. Probosis Uzatma Tepki (PER) Ca 2 + görüntüleme ile eşzamanlı olarak (Şekil 5) bir diseksiyon mikroskobu bağlı bir CCD kamera kullanarak davranışlarını izlemek. Veri BAŞINA yanıtı bu koşullar altında bir saatten fazla devam etmez çünkü diseksiyonu başladıktan sonra bir saat içinde alınmalıdır.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Kürsüden iletki, burnumun uzantısı için kürsüden kaldırma sorumlu tutulan başlıca kasları bir çift, Motor nöronların tatlı uyaranlara 13 sağlam yanıtları göstermek için bildirilmiştir. Şekil 9'da, Ca 2 + sinyalleri GCaMP3.0 1, 9 yoluyla ifade motor nöron bir hücre gövdesinden Gal 4 sürücüsü, E49 13,. Video, bir robu 'de gösterildiği gibist BAŞINA Ca2 + sinyali bir artış ile eşzamanlı olarak gözlenmiştir.
Şekil 1.. Fly beyin Canlı Görüntüleme ve Elektrofizyoloji Sahne (uçar) şematik. Bir, sinekler sinek kafası düz bir şekilde gelmesi için duvar açısı sağlayan bu tür inşa edilmiştir. Sinek burnumun üç segmente renk kodlu vardır; kürsüsüne eflatun olduğunu. Sinek forseps odasına yerleştirilen ve bir Pipetman ucunun sonunda kesilen bir parça kaçan sineği engellemek için odanın arka takılı edilir. B, delik sinek kafasına uyacak şekilde sıkılır. Sızıntı olmadığından emin olmak için belirtilen kalan eksiklikleri ışıkla sertleşen yapıştırıcı ile kapatılır. Tutkal tamamen donduktan sonra bir tıkaç görevi Pipetman ucu kaldırılır. Salin beynin yüzey tamamen kapalı olduğu gibi sinekler içine dökülür. Hiçbir tuzlu su sızıntısı olduğunu sağlanmalısinek başın ön ucuna dışarı ing. Panel b kesikli çizgi ile çevrelenmiş gölgeli alan çıkarılmış üzere bir kısmını göstermektedir.
Şekil 2. Sineklerin Fotoğraf. Tutkal hilal şeklinde bir duvar (bir tutkal tabancası itibaren) perfüzyon sırasında tuzlu su akışını kontrol etmek ve kullanılan tuz miktarını azaltmak için yapılır.
Şekil 3. Bir sinek ön görünümü ışıkla sertleşen yapıştırıcı bir tuzlu su geçirmez conta oluşturmak için sinek (oklar) başının etrafında nasıl uygulanacağını Bu görüntü bir sinek Sineklerin ayarlanır gösterir. Sinekler monte ve. Sineğin probosis kadar herhangi bir tuzlu su sızıntıları, daha sonra deneme başarısız olur. Sahneye tethered iplik (ok başları) tamamen retrac değildir, böylece pozisyonda burnumun tutmak olduğunu ted. Aksi takdirde SOG ile daha ventral kısmı tıkayabilir ve hareket eserler neden olur.
Şekil 4. Bir disseke sinek ile Sineklerin En görünümü. Bu görüntü bir sinek şu kütikül kaldırma maruz SOG gösterir. Yemek borusu, kas 16 ve trakea beyin bağlı olarak seçilen hava-çuval da kalsiyum sinyalleri eşya yol açabilir beyin, rahatsız engellemek için çıkarıldı.
Şekil 5. Izleme cihazı. Bu cihaz bir iplik diski konfokal mikroskop sistemi (Improvision) bağlı bir Olympus BX51WI mikroskop monte edilen ve bir Nikon SMZ800 mikroskop yan monte edilir. Bu kurulum davranış BAŞINA sırasında beyin aktivitesinin canlı görüntüleme sağlar.
6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
6 Şekil. Sineklerin yan görünümü göstermek için fotoğraf. Tuzlu su ince bir tabaka 40X suya daldırma lens ve sinek arasında sandviç edilir.
Şekil 7. Washi kağıt fitil yapmak için şematik. Gampi-washi kağıt (Haibara, Japonya) son derece ince ve pürüzsüz bir geleneksel Japon parşömen olduğunu. Ayrıca, çok kuvvetli ve sıvı büyük miktarda muhafaza edebilir. Washi kağıt çok özel boyutları olan bir yamuk şeklinde kesilmiş olmalıdır; 0.3 mm ve 0.7 mm genişliği ve uzunluğu 4-5 mm (a). Bu, daha sonra bir yamuk 23 G derialtı iğne ucu içine 0,7 mm taraftan eklenir ve aynı zamanda bir V-şeklinde (b) bükülmüş bir böcek pimi, yerleştirilmesi ile kararlı hale getirilebilir. C, washi kağıt hale şeffaf aşağıdaki maruz kalmabir sıvı için, bu deney için idealdir.
Şekil 8. Washi-fitil ile sinekleri üzerinde burnumun uyarılması. Bir derialtı iğne ucunda washi kağıt fitil tek elle bir Joystick manipülatör kullanılarak bir an için uygulanır. İğne sukroz çözeltisi aspirasyon ve boşaltılması için, diğer taraftan ile manipüle bir enjektör için esnek bir boru ile bağlanır.
Şekil 9. Temsilci sonuçlanır. bir, davranış PER stereomikroskop yüklü CCD kamera aracılığıyla kaydedildi. Stimülasyonu azından uyarılmasıyla önce uzun bir hortum (oklar), ve 100 mM sukroz sulu çözeltisi (arrowhead) ihtiva eden bir fitil A ile uyarıldıktan sonra bir starved sinek frontal görünümler. Aydınlatma kullanılan bir 491 nm lazer sayesinde gerçekleşirGCaMP floresans. b, hasret devlet kürsüden kas iletki için motor nöron içinde GCaMP 3.0 yanıtı Sakkaroz-indüklenen. Uyarılması daha önce üst panel; alt panelini, hemen uyarıldıktan sonra. Ölçek çubuğu, 10 mikron. C, sukroz bağlı GCaMP 3.0 yanıtının belirlenmesi. Motor nöron temel çizgi birkaç saniyelik bir restorasyon aşaması takip floresan keskin bir artış ile sakaroz uyarana yanıt verir.
Discussion
Sinekler Ca2 + sinyalleri ve BAŞINA davranış eşzamanlı kayıt için olanak sağlar. Hatta, normal tuzlu su ile BAŞINA davranışı maruz beyin gözlenmiştir. Yerine özgün kılcal method7 kullanılan bir Kimwipe fitilin Gampi-washi fitil kullanmak, yüksek oranda tekrarlanabilir ve istikrarlı BAŞINA davranışı kolaylaştıran ve yapma ve iyi bir Kimwipe fitil seçiminde becerikli olmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Deneysel ipuçları bizi başarıyla Ca 2 derece stabil bir kayıt yol burnumun hareketi bozuklukları önlemek için + sinyaller düşük gürültü ile izin yukarıda belirtilen. Bazen, doku alınması kötü sonuçlara yol açan, hücrelerin maruz veya yeterince hareketini bastırmak için yeterli değildi. Ancak, bir kez biz becerikli, hazırlıkları fazla% 80 iyi sonuç üretti. Bu metodoloji Ca 2 + görüntüleme için değil sadece, ama davranış BAŞINA gözlemlerken aynı zamanda herhangi bir canlı görüntüleme adapte edilebilir. Örneğin, üzerinden herhangi bir hücre erişebilirdoğrudan faaliyet kaydetmek için bir elektrot kullanın. Iki foton uyarması mikroskobu ile birlikte, biz davranış değişiklikleri ile ilgili olabilir sinaptik yapısı time lapse görüntüleme gerçekleştirmek edebiliyoruz. Bu nedenle, davranışsal gözlem ile beyin görüntüleme yönteminin nöronal ağ fonksiyonel diseksiyon için değerli değil sadece, ama bellek arkasındaki mekanizmalar sinaptik plastisite 14 ilişkilendirmek için güçlü bir araç olarak kullanılabilir.
Acknowledgments
I L Watanabe, M takımlarda hasar ve kullanışlı yorum ve tartışma Yoshihara laboratuvar diğer üyelerine teşekkür ediyorum. Ben sinek stokları, deneyler göstermek için S Yokoyama, teknik yardım için Shinya Iguchi ve malzeme bilgi için Nobuko Yoshihara K. Scott ve L. Looger teşekkür ederiz. Bu çalışma Ruh Sağlığı Teşvik MH85958 Ulusal Enstitüsü, ve MY için Worcester Vakfı tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
