Summary
果蝇，
Abstract
他们在行为的功能研究的神经网络，我们必须分析神经元是如何运作时产生的每一个行为模式。因此，神经活动和行为的同时录音是必不可少的行为相关的大脑活动。对于这样的行为分析，果蝇， 果蝇 ，让我们纳入如GCaMP 1基因编码的钙指标，监测神经元的活动，并使用为optogenetic或thermogenetic技术复杂的遗传操作，特别激活确定神经元2-5。使用一个thermogenetic技术已经使我们发现摄食行为的关键神经元（洪水等，正在修订）。作为摄食行为的主要组成部分， 果蝇成年喂养6（长鼻延伸反应; PER）的延伸，它的长鼻，从它的长鼻或跗骨的感觉细胞的甜刺激的响应。合作每7 mbining协议与钙成像技术，使用GCaMP3.0 1 8日，9时 ，我已经建立了一个实验系统，在这里我们可以监视在摄食中枢的神经元活动- suboesophageal节（SOG），同时与行为观察长鼻。我已经设计了一个仪器（“苍蝇的大脑实时成像和电舞台”：“苍蝇”），以适应一个果蝇成人，允许其长鼻自由移动，而它的大脑暴露洗澡钙通过浸水镜头+成像。苍蝇也适用于多种类型的现场苍蝇的大脑，如电生理记录或突触形态时移成像实验。由于实时成像结果可直接相关，同时每行为，这种方法可以提供一个很好的实验系统研究神经元网络的信息处理，以及如何这个Cellular活动耦合塑料进程和内存的。
Protocol
1。构建苍蝇
- 塑造一个平台，从35毫米猎鹰盘的盖子融化侧壁和雕刻，形成一个适当的角度和厚度（ 图1a，图2）。钻一个洞，在这个平台上接受苍蝇头（ 图1A，B），这样的口器自由地接触到外面室（ 图1a）。削减的Pipetman尖底，与大小匹配飞待观察。胶尖在图1a所示的平台完成的苍蝇（ 图2）。
2。准备观察粉煤灰，
- 挨饿24小时的成年果蝇在25°C间事先放置在一个小瓶只用湿纸巾，如果饥饿是必要的实验。
- 麻醉由放置在15毫升塑料管站在冰上飞。
- 使用镊子，插入室的苍蝇苍蝇，轻轻一推在飞，直到它无法动弹。然后，插入一个插件保留的苍蝇。 （ 图1A，B）。
- 近端长鼻（主席台）孔的内边缘密封周边配件;应用少量的光固化胶（EvoFlow Tetric）双方从主席台上方的外（ 图3中的箭头）。也适用于胶从里面的苍蝇头背侧部分和孔的内边缘（ 图1b）之间的空间。允许讲台上自由移动，应小心，以防止任何触摸主席台上，通过使用睫毛（或相媲美的东西）传播胶水胶水。最后，治愈与蓝色光固化过多的热量，以避免损坏飞足够的光照最弱的胶水。删除插件。
- 一个线程持有的部分解除了讲台上（ 图3中的箭头），可以采用稳定苍蝇“避免磕碰的咽的一部分，特别一次过拨款及特别一次过拨款的腹侧部分，揭露，尤其是成像突触前末梢神经元Gr5a 8，长鼻完全缩回时咽的一部分，这是由覆盖头部。
- 填补了无糖盐水含（毫米）：氯化钠，140平台的表面;氯化钾，2 4.5 氯化镁 ， 氯化钙 ，1.5和肝素钠的氢氧化钠，pH值7.1 10 5。这种无蔗糖的生理盐水，也有类似的强壮那些常用的蔗糖含salines如HL3.1 11。
- 打开头壳使用削尖的秘诀，如剪刀，这是一个定制的设备和设计最初是由博士，日本，景行山冈夹角质层及气管暴露SOG（ 图4）钨刀片和镊子。头部的角质层腹侧边缘尽可能削减腹，背边割而不是作为关键。首先，通过一个切口使用钨刀片后缘。然后，穿过侧面和使用削尖钳前边缘。切角质层件应解除与镊子和删除。应触角和触角神经切断由削尖钳。
- 为了避免在录音移动文物，大脑必须稳定通过清除苍蝇的某些部分。首先，有选择性地删除假手术和表皮之间的空气袋。在年底向咽部及特别一次过拨款，以清除咽部和大脑之间的连接在年底削减食道。然后拉出肌肉16 12，最后，分离气管连接大脑和角质层。
- 奥林巴斯显微镜BX51WI连接到一个旋转盘共聚焦显微镜系统（Improvision在珀金埃尔默）（ 图5）上的阶段，我们建立我们的苍蝇。一个水浸泡镜片，如40X/0.8 NA，浸入浴（ 图6
3。的Ca 2 +的脑成像
- 钙离子成像使用GCaMP3.0 1，9，玛蕊乐等建立的方法。（ 图6）。使用旋转盘共聚焦显微镜（Improvision），在4Hz的一个单一的光学部分使用491nm激发激光122ms曝光时间，重点在该地区的利益（运动神经元的细胞体或中间神经突触前末梢味觉的感觉神经元）与速度的软件，VER。 4.3（Improvision）。
4。刺激的长鼻
- 小灯芯从尖（ 图7）凸出（从日本和纸，见特定试剂表 ）到一个注射器针头吸100MM水蔗糖溶液。
- 放电到灯芯的小水滴的蔗糖溶液，然后，吸它，立即江前ê申请浸泡和纸纸灯芯喙尖。和纸灯芯只应适用于瞬间，以避免饱食（ 图8）。监测的长鼻扩展响应（PER）的行为，使用CCD相机连接到一个解剖显微镜（ 图5），同时与Ca 2 +成像。数据必须在一小时内开始后剥离，因为每个反应不能维持一个多小时，在这些条件下。
5。代表结果
在主席台量角器，一双的负责解除长鼻延伸主席台的主要肌肉，运动神经元已显示强大的13甜刺激的反应。，通过GCaMP3.0 1 9 图9所示的Ca 2 +信号表示加仑4驱动，E49 13，从运动神经元的细胞体。如图所示，在视频，robuST每增加的Ca 2 +信号的同步观测。
图1。苍蝇的大脑实时成像和电生理阶段（苍蝇）的示意图。 ，苍蝇建墙的角度，允许苍蝇头走出来直。飞长鼻三段彩色编码;主席台是洋红色。孔飞用钳子插入室，从一个Pipetman尖底切下一块是插入室，以阻止苍蝇逃跑的背面，B，无聊符合苍蝇的头。余下的差距与光固化胶密封的指示，以确保没有泄漏。胶水固化后，作为一个插件Pipetman尖被删除。生理盐水倒入苍蝇等，完全覆盖大脑表面。有没有盐水泄漏，应确保ING，到年底前的苍蝇头。在B组的虚线包围的阴影区域显示部分被解剖。
图2。苍蝇的照片。胶水状的月牙墙（从胶枪）是由控制盐水灌注过程中的流动，减少使用量的生理盐水。
图3。安装在苍蝇苍蝇的正面视图。此图像显示了一只苍蝇，苍蝇如何，以及如何应用光固化胶头的苍蝇（箭头）创建生理盐水证明印章周围。如果通过飞长鼻任何盐水泄漏，则实验会失败。拴在舞台上的线程（箭头）举行的长鼻位置，所以它不是完全retrac特德。否则，它会阻碍更多的腹侧部分的特别一次过拨款，并导致移动文物。
图4。与解剖苍蝇苍蝇的顶视图。此图像显示了苍蝇以下角质层去除暴露的特别一次过拨款。 16食道，肌肉和气管连接到大脑，以及选定的空气，麻袋也被删除，以防止他们扰乱大脑，从而导致钙信号文物。
图5。该仪器的监测仪器。BX51WI连接到一个旋转盘共聚焦显微镜系统（Improvision）奥林巴斯显微镜组装，边安装尼康SMZ800显微镜。此设置允许在每实时成像大脑活动的行为。
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图6。照片显示的苍蝇侧视。盐水之间夹着一层薄薄的40X水浸泡的镜头和苍蝇。
图7。示意图和纸灯芯雁皮和纸是日本传统的羊皮纸，是非常薄而光滑（灰原，日本）。它也是非常强，可以保留大量的液体。必须和纸剪成一个梯形，非常具体的尺寸，0.3毫米和0.7毫米，宽度和长度4-5毫米（ 一 ）。这梯形然后插入到了23政注射器针头尖端从0.7毫米方，也可以通过插入昆虫的脚，弯曲V形（二）稳定，C，和纸变成透明以下曝光液体，使这个实验的理想选择。
图8。天鹰，灯芯苍蝇长鼻刺激。在一个注射器针头尖端和纸灯芯一方面用操纵杆操纵即时申请。针是通过软管连接用另一只手操纵的注射器，抽吸和排放的蔗糖溶液。
图9。有代表性的成果。 ，每行为记录通过安装在立体显微镜的CCD相机。一个饥饿的苍蝇正面意见与扩展长鼻（箭头）在刺激之前的刺激，刺激后，用含有100毫米蔗糖水溶液（箭头）灯芯。照明是通过491纳米激光用于荧光，B为GCaMP蔗糖诱导GCaMP的运动神经元在主席台肌肉处于饥饿状态的量角器3.0响应。刺激前面板，底部面板后，立即刺激。比例尺，10微米，C，量化的蔗糖诱导GCaMP的3.0响应的。运动神经元响应蔗糖刺激，随后的几秒钟的恢复阶段的底线在荧光急剧增加。
Discussion
苍蝇可同时录制的Ca 2 +信号，每行为。即使暴露于生理盐水正常每行为的大脑进行了观察。使用，而不是在原有毛细血管method7用于Kimwipe灯芯雁皮天鹰灯芯利于高度重复性和稳定的每个行为和避免了成为熟练的决策和选择一个好的Kimwipe灯芯。上述实验提示允许运动的长鼻我们成功地避免干扰，导致录音非常稳定的钙2 +信号与噪音低。有时，组织切除不充分暴露细胞或抑制运动充分，导致效果不佳。然而，一旦我们熟练，超过80％的准备工作产生了良好的效果。这种方法不仅对Ca 2 +成像，但也可以适应任何实时成像，而每行为观察。例如，我们可以访问任何通过细胞使用电极直接记录活动。结合双光子激发显微镜，我们是能够执行的时间时隔突触结构成像，它可以与行为改变。因此，这种方法与行为观察大脑成像神经网络的功能解剖不仅是宝贵的，但可以作为一个强大的工具，相关的突触可塑性的14记忆背后的机制。
Acknowledgments
我感谢大号渡边，男Gorczyca和有益的意见和讨论的吉原实验室的其他成员。我感谢K.斯科特和Looger研究苍蝇股票，横山的实验表明，伸井口的技术帮助，和信子吉原物料信息。这项工作得到了研究所，心理健康教育资助MH85958和我的伍斯特基金会
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
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