Summary
De stereotiepe projecties van de zintuiglijke afferenten in het ruggenmerg knaagdier bieden een gemakkelijk toegankelijk experimenteel systeem om axonale vertakkingen door het opsporen van enkele axonen studie.
Abstract
Hier presenteren wij een techniek om de trajecten van kleine groepen van DRG neuronen label in de embryonale ruggenmerg door diffuse kleuring met behulp van de lipofiele tracer 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DII) 1 . De vergelijking van axonale routes van wild-type met die van de muis lijnen in welke genen gemuteerd kunnen testen voor een functionele rol van de kandidaat-eiwitten in de controle van axonale vertakkingen, die is een essentieel mechanisme in de bedrading van het zenuwstelsel. Axonale vertakkingen in staat stelt een individueel neuron te verbinden met meerdere doelen, waardoor het verstrekken van de fysische basis voor de parallelle verwerking van informatie. Gevolgen bij tussentijdse doelstelling regio's van axonale groei kan worden onderscheiden van terminal arborization. Bovendien kunnen verschillende vormen van axonale tak formatie worden ingedeeld, afhankelijk van de vraag of vertakking resultaten van de activiteiten van de groei kegel (splitsen of vertraagd behanching) of bij het ontluiken van de zekerheden van het axon as in een proces genaamd interstitiële vertakking 2 (afb. 1).
De centrale projecties van de neuronen van de DRG bieden een nuttige experimenteel systeem op beide soorten van axonale vertakkingen studie: als hun afferente axonen bij de dorsale wortel entry zone (DREZ) van het ruggenmerg tussen embryonale dag 10 tot 13 (E10 - E13) zij weer een stereotype patroon van T-of Y-vormige splitsing. De twee resulterende dochter axonen dan verder in rostrale of caudale richtingen, respectievelijk aan de dorsolaterale marge van het koord en pas na een wachttijd collateralen ontspruiten uit deze stam axonen naar de grijze stof (interstitiële vertakking) en het project door te dringen tot relay neuronen in specifieke laminae van het ruggenmerg, waar ze verder arborize (terminal vertakking) 3. Dii traces hebben uitgewezen groei kegels op de dorsale wortel entry zone van het ruggenmerg die leek te zijn in de process van het splitsen van wat suggereert dat bifurcatie wordt veroorzaakt door het splitsen van de groei conus zelf 4 (afb. 2), echter, hebben andere opties besproken en 5.
Deze video toont eerst hoe te ontleden het ruggenmerg van muizen E12.5 het verlaten van de DRG aangesloten. Na fixatie van het monster kleine hoeveelheden van Dii worden toegepast op de DRG met behulp van glas naalden getrokken uit capillaire buizen. Na een incubatie stap, is de gelabelde ruggenmerg gemonteerd als een omgekeerde open boek, voorbereiding op de individuele axonen met behulp van fluorescentie microscopie te analyseren.
Protocol
1. Dissection procedure
Let op: Experimenteel gebruik van muizen moeten officieel goedgekeurd te volgen richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
- Voor de voorbereiding, het opzetten van uw dissectiemicroscoop en lay-out van de chirurgische instrumenten die nodig is voor dissectie waaronder grote en kleine schaar, grote tanden tang, gebogen pincet en vier sets van Dumont No.5 ontleden pincet (waarvan er twee binnen-gepolijst tips) ( voor details zie de tabel van specifieke reagentia en apparatuur). Leg een vel filtreerpapier in een 100-mm Sylgard-gecoate petrischaal. Giet koude PBS in de putjes van een 12-wells plaat, een 100-mm petrischaal en een 12-ml tube en laat op ijs. Pipetteer 2 ml van de fixatie buffer (4% paraformaldehyde in PBS, pH 7,4) in elk putje van een tweede 12-wells plaat en leg ze op ijs.
- Na de verdoving, de getimede zwangere dam te offeren op E12.5 (detectie van vaginale plug werd aangewezen als E0.5), plaats de muismet de buikzijde op drie vellen papier handdoeken en genieten van de buikstreek met 70% ethanol.
- Open de abdominopelvic holte, isoleren de bilaterale baarmoeder horens en zet ze in een van de 100-mm gerechten met ijskoude PBS.
- Onder microscopische controle, maken een longitudinale incisie van de baarmoederwand met kleine, rechte schaar en knip weg elk vruchtzak van de placenta.
- Afpellen van de vruchtzak uit ieder embryo en knip de navelstreng.
- Met behulp van kleine schaar, onthoofden van de embryo's en opzij gezet de koppen of een deel van hen voor de isolatie van genomisch DNA als genotypering worden verlangd. Vervolgens overdracht van de torsi aan de respectieve putjes van de 12-wells plaat met koude PBS.
- Nat het filterpapier in de Sylgard schotel met een paar druppels PBS en positie een embryonale torso met haar rug naar boven op het papier. Voor een betere stabiliteit, weg recht zijn staart en ledematen van het lichaam.
- Werkzaamonder een dissectie microscoop met een vergroting van ongeveer 16x, voorzichtig knijpen de huid van het embryo boven het ruggenmerg met twee paar van fijne getipt pincet voorzichtig scheur het uit elkaar. Begin in het midden, eerst verder naar de staart en vervolgens hervatten vanaf het midden naar de anterieure zijde.
- Nat het embryo van tijd tot tijd met twee of drie druppels PBS om te voorkomen dat het drogen.
- Om te voorkomen dat DRG zijn gescheurd af van het ruggenmerg wanneer het wordt verwijderd uit het embryo los van de DRG en het ruggenmerg van de omringende kraakbenige wervelkolom door horizontale glijdende bewegingen met het mes van een fijne tang met binnenkant gepolijst tips. Vanaf het midden van het recht van de embryo's kant, werk je weg naar de staart en vervolgens naar de voorste einde. Daarna herhaalt u de procedure aan de andere kant. Wees niet te rip off de bijbehorende DRG.
- Om los te maken van de volledig los ruggenmerg van het embryo, pick-up zijn cervical een deel met fijn pincet en trek deze uit in een stuk naar haar staart einde.
- Dompel de geïsoleerde ruggenmerg met aangebouwde DRG in een goed van de 12-wells plaat gevuld met fixatie buffer en ga verder met de voorbereiding van ruggenmerg van de resterende embryo's.
- Fix ruggenmerg minstens twee uur op het ijs.
2. Dii-etikettering van DRG neuronen
- Voor elke ruggenmerg te worden geëtiketteerd, voor te bereiden twee glazen naalden met een micropipet trekker. We maken gebruik van een Sutter model P-97 elektrode trekker (programma-instellingen: een HEAT = 625, VEL = 35, TIME = 175; 2 HEAT = 600, VEL = 25, TIME = 175; 3 HEAT = 630, VEL =... 30, TIME = 150).
- Onder microscopische controle drie tot vijf keer dip het uiteinde van elk glas naald in een 5% (w / v) oplossing van Dii in ethanol. Verdamping van het ethanol zorgt voor een dunne laag van DII kristallen op de naald.
- Werken onder een dissectie microscoop met een vergroting van ongeveer 40x, plaats een ruggenmerg met zijn vENTRALE kant naar boven op een dia. Met behulp van de lente schaar, opent u het snoer aan de ventrale zijde op zijn hele lengte door te snijden door de vloerplaat om de latere bevestiging van de voorbereiding in een omgekeerde open-boek-modus (zie deel C).
- Plaats het ruggenmerg met de dorsale zijde naar boven op een dia. Vervolgens handmatig aanpak het snoer met de DII bedekte uiteinde van de glazen naald onder microscopische visualisatie en zorgvuldig te doorboren elke seconde DRG aan de ene kant van het ruggenmerg. Vrijwel geen sporen van Dii moet zichtbaar zijn in de doorboorde DRG voor de etikettering van slechts een klein aantal neuronen te verzekeren. Neem een tweede naald voor de andere kant van het snoer. Streven slechts om de seconde DRG voorkomt een overlap van gelabelde axonale projecties uit omliggende DRG waarin de differentiatie van de individuele axonen kunnen bemoeilijken.
- Ga terug het ruggenmerg naar de fixatie buffer en incubeer in het donker gedurende ten minste zes uur op omgevingstemperatuur of overnacht bij 4 ° C om de tijd te geven om de kleurstof te diffuse langs de axon in het plasmamembraan. Laat voor een langere incubatieperiode (tot twee dagen bij 4 ° C) indien de analyse van het onderpand de groei in het ruggenmerg is gewenst.
3. Montage en microscopische analyse
- Na kleurstofdiffusie, de positie van een enkele ruggenmerg met de dorsale zijde naar beneden op een dekglaasje in een daling van PBS. Zorg ervoor dat de bijgevoegde DRG juiste manier zijn lateraal en niet vermengen. Aspireren overtollig vocht en verzacht de koord in een omgekeerde open-boek-modus met een tang.
- Monteer de voorbereiding op een objectglaasje met PBS.
- Om te voorkomen dat de toename van ongewenste achtergrondkleuring fluorescentie microscopische analyse van gelabelde axonale projecties moeten worden uitgevoerd op de dag van montage. Tot die tijd houden de dia's in het donker bij 4 ° C.
4. Representatieve resultaten:
Het ruggenmerg van de muis ontvangt afferente projections van 8 paar cervicale, 13 paren van thoracale, 5 paar van de lumbale en 4 paar sacrale DRG in totaal tot 60 spinale ganglia. Na enige training een ruggenmerg met de meeste DRG nog aan kan worden geïsoleerd uit een embryo in minder dan vijf minuten. Deze procedure is geschikt voor de isolatie van ruggenmerg met aangehechte DRG van E11.5 tot E13.5 muizenembryo's. Toch worden de beste resultaten bereikt met E12.5. Voorbeeldige uitkomsten van de etikettering procedure hier beschreven, worden weergegeven in figuur 3. De etikettering van DRG over de gehele lengte van het ruggenmerg kan dan gebruikt worden om axonale vertakkingen gedrag te kwantificeren op verschillende niveaus vertebrale (afb. 4).
Figuur 1. Schema beeltenis van de twee belangrijkste takken van axonale vertakkingen. (A) vertakken door de activiteiten van de groei kegel die kunnen leiden tot een splitsing - zoals aangegeven hier - evenals complexe terminal priëlen of(B) onderpand formatie op het axon as (interstitiële vertakking). De laatste mode is de overheersende vertakking soort projecteren corticale en thalamocortical axonen 6,7.
Figuur 2 Afferente projecties van de DRG neuronen in de embryonale ruggenmerg beide types van axonale vertakkingen weer te geven:. Axonen eerste filiaal op de DREZ door bifurcatie (1) en uit de resulterende dochter takken collateralen vormen na een wachttijd van interstitiële vertakking (2).
Figuur 3. Visualisatie van enkele axonale trajecten van embryonale muis DRG neuronen. (A) het ruggenmerg met aangehechte DRG bereid uit een E12.5 muis embryo. (Schaal bar, 1 mm.) (BD) Dorsaal uitzicht op Dii-gelabeld DRG van wild-type muizen op het vergroten van een vergroting worden weergegeven. In B elke tweede DRG is labeled door Dii. Fluorescentie beelden zijn omgekeerd, staartvin is aan de linkerkant en in de C en D, laterale is aan de onderkant. In C een klein aantal van de axonen is gelabeld en bij hogere vergroting van de aanwezigheid van T-net als de takken kunnen worden geïdentificeerd in de DREZ van het ruggenmerg. (Schaal bars, 250 pm (B), 100 micrometer (C) en 50 micrometer (D).)
Figuur 4. Kwantificering van de T-vormige takken, enkele rostrale of caudale bochten in wild-type en C-type natriuretisch peptide (CNP)-deficiënte muizen op E13.5. Het aantal getelde enkele axonen tussen haakjes voor de verschillende niveaus voor elke stam genotype. C-of R-bochten - groei alleen in caudale of rostraal richting, respectievelijk.
Figuur 5. Een cGMP-signaleringsroute leidt tot zintuiglijke axon splitsing bij de DREZ van het ruggenmerg. (A) regeling van dede cGMP-signaleringsroute samengesteld uit de ligand CNP, de receptor guanylyl cyclase Npr2 en de serine / threonine kinase cGKIα in embryonale DRG neuronen. Npr2 genereert cGMP van GTP na stimulatie door NPM. (B) DII opsporen van enkele axonen van de DRG neuronen in wild-type en CNP-deficiënte muizen. (Schaal bar, 25 pm.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotiepe projectie patronen bestaande uit beide types van axonale tak formatie samen met het gemak van voorbereiding in combinatie met het gebruik van vaste weefsel voor DII etikettering maakt de embryonale ruggenmerg met aangebouwde DRG een gunstige model om te studeren axonale vertakkingen. De toepassing van minieme hoeveelheden van Dii gebruik van gecoat glas naalden laat - in tegenstelling tot het grootste deel etikettering van DRG - het visualiseren van kleine groepen van DRG neuronen en daarmee de analyse van individuele axonen en hun vertakking patronen. De beschreven methode kan verder worden verbeterd door iontoforetische injectie van de lipofiele tracer die verder vermindert het aantal gelabelde neuronen 8. Dit zou echter meer tijd in beslag.
Dii etikettering van een axonale trajecten in hele berg voorbereidingen van het embryonale ruggenmerg was instrumenteel in de identificatie van een cGMP signaalcascade-bestaande uit de ligand CNP, zijn receptor Npr2, en decGMP-afhankelijke kinase cGKIα - dat een soort van axonale vertakkingen regelt: de splitsing van de DRG neuronen in de DREZ 4,5,9-12. In tegenstelling tot de wild-type, axonen van de DRG neuronen in de cGMP-signalering mutanten hun beurt slechts in een richting, in plaats van bifurcating bij de DREZ (fig. 5). Deze studies bleek ook dat onderpand formatie werd niet beïnvloed in de cGMP-signalering mutanten te geven dat dit tweede type vestiging formatie waargenomen in DRG neuronen verschillend is 4 geregeld.
Als alternatief kan de vertakking gedrag van enkele DRG axonen ook worden onderzocht in transgene muizen lijnen dat zich een fluorescerend eiwit in slechts een klein deel van DRG neuronen 13 of met een combinatie van fluorescente markers die het mogelijk maakt een onderscheid maken tussen individuele neuronen 14. Echter, de inspanning om kruisen de gemuteerde muis model worden geanalyseerd met de tl-muis lijnen dient te worden beschouwd. Bovendien, als gevolg van de promotor (Thy1) gebruikte uitdrukking van de fluorescerende eiwitten in de transgene muizen lijnen start pas op postnatale fase waardoor het moeilijk is om uit te vinden of een vertakking waargenomen fenotype is het resultaat van een gestoorde tak vorming tijdens de embryonale ontwikkeling of een latere degeneratie proces plaats. In tegenstelling, Dii etikettering van embryonale DRG heeft als voordeel dat het proces van axonale vertakkingen en de verstoring in de juiste muizenmutanten studie op het moment dat axonale vertakking optreedt.
De voorbereidingen van de embryonale ruggenmerg met aangehechte DRG kan verder gebruikt worden voor andere etikettering van procedures (ganse berg in-situ hybridisatie, LacZ-of AP-kleuring van transgene muizen), verzameling van het ruggenmerg en de DRG weefsel voor RNA-isolatie, of als aangepaste om steriele omstandigheden voor weefselkweek experimenten en afgeleide toepassingen, zoals calcium imaging of elektrofysiologische metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Centrum, Berlijn) bedanken voor zijn behulpzame opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de collaborative research centrum (SFB665) van de Duitse Research Council (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
