Summary
Den stereotype projeksjoner av sensoriske afferenter til gnager ryggmargen tilby en lett tilgjengelig eksperimentelt system for å studere aksonal branching gjennom sporing av enkelt axoner.
Abstract
Her presenterer vi en teknikk for å merke baner av små grupper av DRG nerveceller i den embryonale ryggmargen ved diffusive flekker bruke lipofile tracer 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII) 1 . Sammenligningen av aksonal pathways av vill-type med de av mus linjer i hvilke gener som er mutert muliggjør testing for en funksjonell rolle kandidat proteiner i kontroll av aksonal forgrening som er en viktig mekanisme i ledningene av nervesystemet. Aksonal forgrening muliggjør en individuell neuron å koble til med flere mål, og dermed gir det fysiske grunnlaget for parallell prosessering av informasjon. Forgreninger på mellomliggende mål regioner av aksonal veksten kan skilles fra terminal arborization. Videre kan forskjellige moduser av aksonal gren dannelsen bli klassifisert avhengig av om forgreninger resultater fra virksomheten av veksten kjeglen (splitte eller forsinket BHnching) eller fra den spirende av collaterals fra axon akselen i en prosess som kalles interstitiell branching 2 (Fig. 1).
Den sentrale projeksjoner av nerveceller fra DRG tilby et nyttig eksperimentelt system for å studere begge typer aksonal forgrening: når deres afferent axons nå dorsal root entry zone (DREZ) av ryggmargen mellom embryonale dager 10 til 13 (E10 - E13) de vise et stereotypt mønster av T-eller Y-formet bifurcation. De to resulterende datteren axoner deretter fortsette i rostral eller caudal retninger, henholdsvis ved dorsolateral margin på ledningen og bare etter en venteperiode collaterals spirer fra disse stammer axons å trenge inn i grå substans (interstitiell forgrening) og prosjekt til stafett nevroner i spesifikke lameller av ryggmargen der de videre arborize (terminal branching) 3. DII Sporing har avdekket vekst kjegler på dorsale roten oppføring sone i ryggmargen som syntes å være i process av splitting foreslå at bifurcation er forårsaket av splitting av veksten kjeglen selv 4 (Fig. 2), har imidlertid andre alternativer vært diskutert så vel 5.
Denne videoen viser først hvordan å dissekere ryggmargen av E12.5 mus å forlate DRG vedlagt. Etter fiksering av prøven ørsmå mengder DII brukes til DRG bruke glass nåler trukket fra kapillarrør. Etter en inkubasjonstid trinn, er den merket ryggmargen montert som en omvendt åpen bok forberedelse til å analysere enkelte axons med fluorescens mikroskopi.
Protocol
1. Disseksjon prosedyre
Merk: Eksperimentell bruk av mus bør følge offisielt godkjent retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr.
- Før forberedelse, sette opp dissecting mikroskop og legge ut den kirurgiske instrumenter som trengs for disseksjon, inkludert store og små saks, store toothed tang, buet tang og fire sett med Dumont No.5 dissecting tang (hvorav to har inside-polert tips) ( for detaljer, se tabell over spesifikke reagenser og utstyr). Plasser et ark med filter papir i en 100 mm Sylgard-belagt petriskål. Hell kald PBS i brønnene av en 12-bra plate, en 100-mm petriskål og en 12-ml tube og la på is. Pipette 2 ml av fiksering buffer (4% Paraformaldehyde i PBS, 7,4 pH) i hver brønn av et sekund 12-bra plate og legg på is.
- Etter anesthetization, ofrer den tidsinnstilte gravide demningen ved E12.5 (påvisning av vaginal plug ble utpekt som E0.5), plasserer musepekerenmed sine ventrale siden opp på tre ark med tørkepapir og suge mageområdet med 70% etanol.
- Åpne abdominopelvic hulrom, isolere den bilaterale livmor horn og overføre dem til en av 100-mm retter med iskald PBS.
- Under mikroskopisk kontroll, gjør et langsgående snitt av livmor veggen med små, rett saks og klippet vekk hver amniotic sac fra morkaken.
- Skrell bort amniotic sac fra hver embryo og klippe navlestrengen.
- Bruk liten saks, halshogge embryoene og sette hodene eller en del av dem til side for isolering av genomisk DNA hvis genotyping bør kreves. Deretter overfører torsi til de respektive brønner av 12-godt plate med kalde PBS.
- Fukt filteret papiret i Sylgard parabolen med noen dråper PBS og posisjon en embryonale torso med dorsal siden opp på papiret. For bedre stabilitet, rette halen og ekstremiteter vekk fra kroppen.
- Workingunder et dissecting mikroskopet med en forstørrelse på ca 16x, forsiktig klype i huden av embryoet over ryggmargen med to par fine tippet tang og forsiktig rive den fra hverandre. Begynnelsen i midten, fortsetter første mot halen og deretter gjenoppta fra midten mot fremre side.
- Fukt embryo fra tid til annen med to eller tre dråper PBS for å hindre at den tørker.
- For å hindre at DRG er teared ut fra ryggmargen når den fjernes fra embryoet løsne DRG og ryggmargen fra omkringliggende brusk ryggsøylen ved horisontal skyve bevegelser med bladet på en fin pinsett med inside-polert tips. Starter i midten av embryoet sin høyre side, jobbe deg bakover og deretter til den fremre enden. Etterpå, gjenta prosedyren på den andre siden. Vær forsiktig med å rive av den tilhørende DRG.
- Å koble fullstendig løsnet ryggmargen fra embryo, plukke opp sin cervical del med fine tang og trekk den ut i ett stykke mot sine caudal slutten.
- Senk isolerte ryggmargen med festet DRG i et godt av 12-godt plate fylt med fiksering buffer og fortsett med utarbeidelse av ryggmargen fra de gjenværende embryoer.
- Fix ryggmargen minst to timer på isen.
2. DII-merking av DRG nevroner
- For hver ryggmargen å merkes, utarbeide to glass nåler med en mikropipette avtrekker. Vi bruker en Sutter modell P-97 elektrode puller (program innstilling: 1. VARME = 625, VEL = 35, TID = 175, 2 VARME = 600, VEL = 25, TID = 175, 3 VARME = 630, VEL =... 30, TID = 150).
- Under mikroskopisk kontroll dyppe hvert glass nål tre til fem ganger i en 5% (w / v) løsning av DII i etanol. Fordampning av etanol skaper et tynt lag av DII krystaller på nålen.
- Jobbe under et dissekere mikroskop med en forstørrelse på ca 40x, plassere en ryggmarg med v sinentral siden opp på et lysbilde. Ved hjelp av våren saks, åpne ledningen på baksiden side ved hele sin lengde ved å skjære gjennom floorplate å tillate senere montering av preparatet i en omvendt åpen-bok-modus (se avsnitt C).
- Plasser ryggmargen med dorsal siden opp på et lysbilde. Deretter manuelt tilnærming ledningen med DII dekket tuppen av glass nål under mikroskopiske visualisering og nøye pierce hvert sekund DRG på den ene siden av ryggmargen. Nesten ingen spor av DII bør være synlig i gjennomboret DRG å sikre merking av bare et lite antall nerveceller. Ta en ekstra nål på den andre siden av ledningen. Sikter bare annenhver DRG unngår en overlapp av merket aksonal anslagene fra nabolandet DRG som kan komplisere differensiering av individuelle axoner.
- Tilbake ryggmargen til fiksering buffer og inkuberes i mørke i minst seks timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C for å gi tid for fargestoff til diffuse langs aksonet i plasma membran. Tillat for en lengre inkubasjonstid (opptil to dager ved 4 ° C) hvis analysen av sivile vekst i ryggmargen er ønsket.
3. Montering og mikroskopisk analyse
- Etter fargestoff diffusjon, posisjon én ryggmargen med dorsal side ned på et dekkglass i en dråpe PBS. Pass på at vedlagte DRG er riktig orientert sidelengs og ikke blander seg. Aspirer overflødig væske og flate ut ledningen i en omvendt åpen bok modus ved hjelp av tang.
- Monter forberedelse på et objektglass med PBS.
- For å hindre økningen av uønskede bakgrunn flekker fluorescens mikroskopisk analyse av merket aksonal projeksjoner bør gjennomføres den dagen montering. Inntil da holder lysbildene i mørke ved 4 ° C.
Fire. Representant Resultater:
Ryggmargen av musen mottar afferent projections fra 8 par cervikale, 13 par av thorax, 5 par lumbar og 4 par sakrale DRG totalt til 60 spinal ganglier. Etter litt trening en ryggmargen med de fleste DRG fortsatt festet kan bli isolert fra et embryo på under fem minutter. Denne prosedyren er egnet for isolering av ryggmargen med festet DRG fra E11.5 til E13.5 mus embryoer. Imidlertid er beste resultater fra E12.5. Eksemplarisk utfall av merking prosedyren som er beskrevet her er vist i figur 3. Merkingen av DRG over hele lengden av ryggmargen kan deretter brukes til å kvantifisere aksonal branching atferd på ulike vertebral nivåer (fig 4).
Figur 1. Scheme skildrer de to viktigste moduser av aksonal forgrening. (A) Avgrening av aktiviteter av veksten kjegle som kan føre til en bifurcation - som angitt her - samt komplekse terminal arbors eller(B) sikkerheter formasjon i axon akselen (interstitiell branching). Sistnevnte modus er den dominerende forgrenede type prosjektering kortikale og thalamocortical axons 6,7.
Figur 2 afferent projeksjoner av DRG nerveceller i den embryonale ryggmargen vise begge typer aksonal forgrening. Axons første grenen på DREZ ved bifurcation (1) og fra den resulterende datteren grenene collaterals form etter en ventetid ved interstitiell forgrening (2).
Figur 3. Visualisering av enkelt aksonal baner av embryonale mus DRG nerveceller. (A) Ryggmargen med vedlagt DRG forberedt fra en E12.5 mus embryo. (Skala bar, 1 mm.) (BD) Dorsal utsikt over DII-merket DRG av vill-type mus ved å øke forstørrelse er vist. I B annenhver DRG er labeled ved DII. Fluorescens bilder er omvendt, er caudal på venstre og i C og D, lateral er nederst. I C et lite antall axoner er merket og ved høyere forstørrelse tilstedeværelsen av T-lignende grener kan identifiseres i DREZ av ryggmargen. (Scale barer, 250 mikrometer (B), 100 mikrometer (C) og 50 mikrometer (D).)
Figur 4. Kvantifisering av T-formede grener, single rostral eller caudal svinger i vill-type og C-type natriuretisk peptid (CNP)-mangelfull mus ved E13.5. Antallet enkelt axoner telte er gitt i parentes for ulike trunk nivåer for hver genotype. C-eller R-svinger - vekst bare i caudal eller rostral retning, henholdsvis.
Figur 5. En cGMP signalveien utløser sensoriske axon bifurcation på DREZ i ryggmargen. (A) Scheme avden cGMP signalveien består av ligand CNP, reseptoren guanylyl cyclase Npr2 og serin / treonin kinase cGKIα i embryonale DRG nerveceller. Npr2 genererer cGMP fra GTP ved stimulering av CNP. (B) DII sporing av enkelt axoner av DRG nevroner i vill-type og CNP-mangelfull mus. (Scale bar, 25 mikrometer.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotype projeksjon mønstre bestående av begge typer aksonal grenen formasjon sammen med enkel tilberedning i kombinasjon med bruk av fast vev for DII merking gjør embryonale ryggmargen med festet DRG en gunstig modell for å studere aksonal branching. Anvendelsen av små mengder av DII bruke belagt glass nåler gir - i motsetning til mesteparten merking av DRG - visualisering av små grupper av DRG nevroner og derved analyse av individuelle axoner og deres forgreninger mønstre. De beskrevne metoden kan bli ytterligere forbedret ved iontophoretic injeksjon av lipofile tracer som ytterligere reduserer antall merket nevroner 8. Dette ville imidlertid være mer tidkrevende.
DII merking av single aksonal baner i hele montere preparater fra embryonale ryggmargen var instrumental i identifikasjon av en cGMP signalering kaskade-bestående av ligand CNP, dets reseptor Npr2, ogcGMP-avhengig kinase cGKIα - som regulerer én type aksonal forgrening: den bifurcation av DRG nevroner ved DREZ 4,5,9-12. I motsetning til vill-type, axons av DRG nevroner i cGMP signalering mutanter sving bare i én retning, i stedet for bifurcating på DREZ (fig 5). Disse studiene viser også at sikkerhet formasjonen var ikke påvirket i cGMP signaliserer mutanter som indikerer at denne andre typen gren dannelse observert i DRG nevroner er forskjellig regulert 4.
Alternativt kan forgrening oppførselen til enkelt DRG axoner også bli studert i transgene mus linjer uttrykker enten en fluorescerende protein i bare en liten undergruppe av DRG nevroner 13 eller som inneholder en kombinasjon av fluorescerende markører som gjør det mulig å skille mellom individuelle nerveceller 14. Imidlertid har innsatsen for å kryss-avle den muterte mus modell som skal analyseres med fluorescerende musen linjene å bli vurdert. Videre, på grunn av utnevnes (Thy1) brukte uttrykket av fluorescerende proteiner i transgene mus linjene starter kun ved postnatal stadier gjør det vanskelig å finne ut om en observert forgrening fenotype er et resultat av nedsatt grenen formasjon under embryonal utvikling eller en senere degenerasjon prosessen i stedet. I kontrast har DII merking av embryonale DRG fordel å studere prosessen med aksonal forgrening og avbrudd i passende mus mutanter på den tiden da aksonal branching oppstår.
Preparater av embryonale ryggmargen med festet DRG kan videre brukes til andre merking prosedyrer (hele montere in-situ hybridisering, LacZ-eller AP-farging av transgene mus), innsamling av ryggmargen og DRG vev for RNA-isolering, eller når tilpasses til sterile forhold for vev kultur eksperimenter og downstream applikasjoner som kalsium avbildning eller elektrofysiologiske målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) for nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av forskningssamarbeid sentrum (SFB665) av den tyske Research Council (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
