Summary
Den stereotypa projektioner av sensoriska afferenter till gnagare ryggmärgen erbjuda ett lättillgängligt experimentellt system att studera axonal förgrening genom spårning av enskilda axoner.
Abstract
Här presenterar vi en teknik för att märka banor små grupper av DRG nervceller i embryonala ryggmärgen med diffusionsprovtagare färgning med lipofila spårämne 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII) 1 . Jämförelsen av axonal vägar av vild-typ med dem av mus linjer i vilka gener som är muterade kan testa en funktionell roll kandidat proteiner i kontrollen av axonal förgrening vilket är en grundläggande mekanism i ledningar i nervsystemet. Axonal förgrening gör att en enskild neuron att ansluta med flera mål, vilket ger den fysiska grunden för parallell bearbetning av information. Förgreningar till delmål regioner axonal tillväxt kan skiljas från terminalen arborization. Dessutom kan olika typer av axonal gren bildas klassificeras beroende på om förgreningar resultat från verksamheten i tillväxt konen (delning eller försenas behånnching) eller från spirande av säkerheter från axonet axeln i en process som kallas interstitiell förgrening 2 (Fig. 1).
Den centrala projektioner av nervceller från DRG ett användbart experimentellt system för att studera båda typerna av axonal förgrening: när deras afferenta axoner når dorsala zonen roten inträde (DREZ) i ryggmärgen mellan embryonala dagar 10 till 13 (E10 - E13) de visa ett stereotypt mönster av T-eller Y-formade bifurkation. De två resulterande dottern axoner fortsätter sedan i rostralt eller caudal riktningar, respektive vid dorsolaterala marginal på sladden och först efter en väntetid säkerheter Spirande dessa härrör axoner att tränga in i den grå massan (interstitiell förgrening) och projekt för relä nervceller i specifika lamell av ryggmärgen där de ytterligare arborize (plint förgrening) 3. DII tracings har visat tillväxt kottar på dorsala posten zon av ryggmärgen som föreföll vara i process att dela upp tyder på att bifurkation orsakas av uppdelning av tillväxten konen i sig 4 (Fig. 2) har dock andra alternativ diskuterats och 5.
Denna video visar först hur att dissekera ryggmärg från E12.5 möss lämnar DRG bifogas. Efter fixering av provet små mängder av DII tillämpas på DRG med glas nålar dras från kapillärrör. Efter en inkubationstid steg är märkt ryggmärgen monteras som en inverterad öppen bok förberedelse för att analysera enskilda axoner med fluorescensmikroskopi.
Protocol
1. Dissection förfarande
OBS: Experimentell användning av möss bör följa officiellt godkända riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
- Innan förberedelse, ställa in dissekera mikroskop och lägga ut de kirurgiska instrument som behövs för dissektion, inklusive stora och små saxar, stora tandade pincett, böjda pincett och fyra uppsättningar av Dumont No.5 dissekera pincett (varav två har inne-polerat tips) ( för detaljer se tabell specifika reagenser och utrustning). Placera ett ark filtrerpapper i en 100-mm Sylgard-belagd petriskål. Häll kallt PBS i brunnarna på en 12-brunnar, en 100-mm petriskål och en 12-ml rör och lämna på is. Pipettera 2 ml fixering buffert (4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4) i varje brunn på en annan 12-brunnar och lägg på is.
- Efter anesthetization, offra tidsinställda gravida dammen vid E12.5 (upptäckt av vaginala kontakten utsågs E0.5), placera musenmed dess ventrala sida upp på tre ark hushållspapper och njuta buken med 70% etanol.
- Öppna abdominopelvic hålighet, isolera de bilaterala livmoder hornen och överföra dem till en av de 100-mm rätter med iskall PBS.
- Enligt mikroskopisk kontroll, gör ett längsgående snitt i livmoderväggen med små, rak sax och klippa bort alla fostersäcken från moderkakan.
- Skala bort fostersäcken från varje embryo och klippa navelsträngen.
- Med små saxar, halshugga embryon och sätta krona eller en del av dem åt sidan för isolering av arvsmassans DNA om genotypning bör krävas. Därefter överför torsi till respektive brunnar i 12-brunnar med kall PBS.
- Blöt filterpapper i Sylgard skålen med några droppar PBS och position en embryonal torso med ryggen uppåt på papperet. För bättre stabilitet, räta svansen och extremiteter bort från kroppen.
- Arbetaunder ett dissekera mikroskop med en förstoring på cirka 16x, försiktigt nyp ihop huden av embryot ovanför ryggmärgen med två par fina tippas tång och försiktigt riva sönder den. Från och med mitten, gör först mot svansen och sedan återuppta från mitten mot den främre sidan.
- Wet embryot från tid till annan med två eller tre droppar av PBS för att förhindra den från att torka.
- För att förhindra att DRG är teared av från ryggmärgen när den tas ut ur embryot bort DRG och ryggmärgen från den omgivande brosk ryggraden av horisontella glidande rörelser med bladet på en fin pincett med inne-polerad tips. Med början i mitten av embryot rätt sida, arbeta dig mot svansen och sedan till framändan. Efteråt, upprepa proceduren på andra sidan. Var noga med att inte slita tillhörande DRG.
- För att ta bort helt lossnat ryggmärgen från embryot, plocka upp sina cervical del med fina pincett och dra ut den i ett stycke mot sitt stjärtfenan slut.
- Sänk den isolerade ryggmärgen med bifogade DRG i en brunn på 12-brunnar fyllda med fixering buffert och gå vidare med förberedelserna av ryggmärgen från de återstående embryona.
- Fix ryggmärg minst två timmar på is.
2. Dii-märkning av DRG nervceller
- För varje ryggmärgen som ska märkas, förbereda två glas nålar med en mikropipett avdragare. Vi använder en Sutter modell P-97 elektrod avdragare (program inställning: 1 HEAT = 625, StPL = 35, TID = 175, 2 HEAT = 600, StPL = 25, TID = 175, 3 VÄRME = 630, StPL =... 30, TIME = 150).
- Enligt mikroskopisk kontroll doppa toppen av varje glas nål tre till fem gånger i en 5% (w / v) lösning av DII i etanol. Avdunstning av etanol skapar ett tunt lager av DII kristaller på nålen.
- Arbetar under en dissekera mikroskop med en förstoring på cirka 40x, placera en ryggmärgen med sin ventral sidan upp på en bild. Med Spring sax, öppna sladden på den ventrala sidan på hela sin längd genom att skära igenom floorplate att låta senare montering av preparatet i en inverterad öppen bok (se avsnitt C).
- Placera ryggmärgen med ryggsidan upp på en bild. Sedan manuellt tillvägagångssätt sladden med DII täckta toppen av glaset nålen under mikroskopiska visualisering och försiktigt tränga igenom varje sekund DRG på ena sidan av ryggmärgen. Nästan inga spår av DII ska synas i den genomborrade DRG för att säkerställa att märkningen av endast ett litet antal nervceller. Ta en andra nål för den andra sidan av kabeln. Syftar bara varannan DRG undviker en överlappning av märkt axonal prognoser från närliggande DRG som kan komplicera differentiering av enskilda axoner.
- Återgå ryggmärgen till upptagningen buffert och inkubera i mörker i minst sex timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C för att ge tid för färgen att diffuse längs axonet i plasmamembranet. Låt en längre inkubationstid (upp till två dagar vid 4 ° C) om analys av säkerheter tillväxt i ryggmärgen önskas.
3. Montering och mikroskopisk analys
- Efter färgämne diffusion, placera en enda ryggmärgen med sin ryggsidan nedåt på ett täckglas i en droppe PBS. Var noga med att de bifogade DRG är rätt vända i sidled och inte blandas. Aspirera överflödig vätska och platta ut linan i en inverterad öppen bok läge med pincett.
- Montera preparatet på ett objektsglas med PBS.
- För att förhindra en ökning av oönskade bakgrundsfärgning fluorescens mikroskopisk analys av märkt axonal prognoser bör göras dagen för montering. Tills dess håller bilderna i mörker vid 4 ° C.
4. Representativa resultat:
Ryggmärgen på musen får afferenta projections från 8 par av livmoderhalscancer, 13 par bröst, 5 par länd-och 4 par sakrala DRG totalt till 60 spinal ganglierna. Efter lite träning en ryggmärgen med de flesta DRG fortfarande ansluten kan isoleras från ett embryo på under fem minuter. Detta förfarande är lämpad för isolering av ryggmärgen med bifogade DRG från E11.5 till E13.5 musembryon. Men bäst resultat uppnås från E12.5. Exemplarisk resultat av märkningen procedur som beskrivs här visas i figur 3. Märkning av DRG över hela sin längd av ryggmärgen kan sedan användas för att kvantifiera axonal förgreningar beteende på olika vertebrala nivåer (bild 4).
Figur 1. Scheme skildrar två huvudsakliga typer av axonal förgrening. (A) Förgrening av verksamheten av tillväxten konen som kan leda till en bifurkation - som anges här - liksom komplexa pergolor terminal eller(B) säkerheter bildas vid axonet axeln (interstitiell förgrening). Det senare läget är den dominerande förgrening typ av projektering kortikal och thalamocortical axoner 6,7.
Figur 2 Afferent projektioner av DRG nervceller i embryonala ryggmärgen visa båda typerna av axonal förgrening:. Axoner första gren på DREZ av bifurkation (1) och från den resulterande dottern grenarna säkerheter form efter en väntetid av interstitiell förgrening (2).
Figur 3. Visualisering av enstaka axonal banor av embryonala nervceller mus DRG. (A) ryggmärgen med bifogad DRG beretts av en E12.5 mus embryo. (Skala bar, 1 mm.) (BD) ryggfenan utsikt över DII märkt DRG av vildtyp möss att öka förstoringen visas. I B varannan DRG är labeled med DII. Fluorescens bilder är inverterad, är caudal till vänster och i C och D, lateral är längst ner. I C ett litet antal axoner är märkta och vid högre förstoring förekomsten av T-liknande grenar kan identifieras i DREZ av ryggmärgen. (Skala barer, 250 ìm (B), 100 ìm (C) och 50 ìm (D).)
Figur 4. Kvantifiering av T-formade grenar, enstaka rostralt eller stjärtfenan vänder i vildtyp och C-typ natriuretisk peptid (CNP)-brist möss vid E13.5. Antalet enskilda räknas axoner inom parentes för olika bål nivåer för varje genotyp. C-eller R-svängar - tillväxt endast i stjärtfenan eller rostralt riktning, respektive.
Figur 5. En cGMP signalväg utlöser sensoriska axon bifurkation på DREZ av ryggmärgen. (A) ordning förcGMP signalväg som består av liganden CNP, receptorn guanylyl cyclase Npr2 och serin / treoninkinas cGKIα i embryonala DRG nervceller. Npr2 genererar cGMP från GTP vid stimulering av CNP. (B) DII spårning av enstaka axoner av DRG nervceller i vildtyp och CNP-brist möss. (Skala bar, 25 ìm.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotypa projektion mönster som består av både typerna av axonal gren bildas tillsammans med enkel beredning i kombination med användning av fasta vävnad för DII märkning gör embryonala ryggmärgen med bifogade DRG en gynnsam modell för att studera axonal förgrening. Tillämpningen av små mängder av DII använda belagt glas nålar låter - i motsats till huvuddelen märkning av DRG - visualisering av små grupper av DRG nervceller och därmed analys av enskilda axoner och deras förgrening mönster. Den beskrivna metoden skulle kunna förbättras ytterligare genom jontoforetiskt injektion av lipofila spårämne vilket ytterligare minskar antalet märkta nervceller 8. Detta skulle dock vara mer tidskrävande.
DII märkning av enstaka axonal banor i hela montera preparat från embryonala ryggmärgen var avgörande för identifieringen av en cGMP signalering kaskad-bestående av liganden CNP, dess receptor Npr2, ochcGMP-beroende kinas cGKIα - som reglerar en typ av axonal förgrening: bifurkationen av DRG nervceller vid DREZ 4,5,9-12. I motsats till vildtyp, axoner av DRG nervceller i cGMP signalering mutanter tur bara i en riktning, i stället för bifurcating vid DREZ (bild 5). Dessa studier visade också att säkerheten bildandet påverkades inte i cGMP signalering mutanter vilket tyder på att denna andra typ av gren bildning observerats i DRG nervceller olika regleras 4.
Alternativt kan förgrenade beteende enda DRG axoner också studeras i transgena möss som uttrycker antingen en fluorescerande protein i endast en liten delmängd av DRG nervceller 13 eller innehåller en kombination av fluorescerande markörer som gör att man kan skilja mellan enskilda nervceller 14. Däremot har arbetet med att korsa den muterade musmodell som skall analyseras med fluorescerande mus linjer beaktas. Vidare, på grund av promotor (Thy1) används uttrycket för fluorescerande proteiner i transgena möss linjerna startar endast vid födseln stadier vilket gör det svårt att ta reda på om ett observerat förgrening fenotyp är resultatet av nedsatt gren bildas under fosterutvecklingen eller senare degeneration processen i stället. Däremot har DII märkning av embryonala DRG fördelen att studera processen axonal förgrening och dess störningar i lämpliga mus mutanter vid den tidpunkt då axonal förgrening sker.
Beredningar av embryonala ryggmärgen med bifogade DRG kan ytterligare användas för andra märkning förfaranden (hela montera in situ hybridisering, LacZ-eller AP-färgning av transgena möss), insamling av ryggmärgen och DRG vävnad för RNA-isolering, eller efter anpassning till sterila förhållanden för experiment vävnadsodling och nedströms applikationer som kalcium avbildning eller elektrofysiologiska mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) för värdefulla kommentarer. Detta arbete stöddes av forskningssamarbete centrum (SFB665) av den tyska forskningsrådet (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
