Summary
Kemirgen omuriliğe duyusal aferentlerde kalıplaşmış projeksiyonları tek akson izleme yoluyla aksonal dallanma incelemek için kolay ulaşılabilir bir deneysel sistem sunuyoruz.
Abstract
Burada lipofilik tracer 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', perklorat (DII) 1 3'-tetramethylindocarbocyanine kullanarak uzadıya boyama embriyonik omurilik içine DRG nöronlar küçük gruplar yörüngeleri etiketlemek için bir teknik . Vahşi tip genleri mutasyona uğramış olan fare hatları ile aksonal yollarının karşılaştırma sinir sistemi kablolama önemli bir mekanizmadır aksonal dallanma kontrolü aday proteinlerin fonksiyonel bir rol için test sağlar. Aksonal dallanma ve böylece paralel bilgi işleme için fiziksel bir temel sağlayarak, çoklu hedefleri ile bağlanmak için tek bir nöron sağlar. Aksonal büyüme ara hedef bölgelerdeki etkileri terminali arborization ayırt edilebilir. Ayrıca, farklı mod aksonal şube oluşumu büyüme konisi (bölme ya da geç sutyen olmadığını dallanma sonuçları bağlı olarak sınıflandırılır olabilirnching) ya da bir süreç akson mili teminatların tomurcuklanan interstisyel dallanma 2 (Şekil 1) denir .
Merkezi projeksiyonları DRG nöronların aksonal dallanma iki türlü incelemek için yararlı bir deneysel sistem sunuyoruz: afferent aksonlar 10 13 (E10 - E13) embriyonik gün arasında omurilik dorsal kök giriş bölgesi (DREZ) ulaştığınızda onlar basmakalıp desen T veya Y-şekilli çatallanma görüntüler. Daha sonra çıkan iki kızı aksonlar kablosunun dorsolateral marjı sırasıyla, rostral veya kaudal yönde ilerler ve bir bekleme süresi teminatlar gri madde (interstisyel dallanma) ve proje özel röle nöronlar nüfuz sonra bu kök aksonlar filiz spinal kord lamina daha da (terminal dallanma) 3 arborize. DII iz pr olduğu ortaya çıktı omurilik dorsal kök giriş bölgesi büyüme konileri ortaya koymuşturbu çatallanma düşündüren bölme ocess büyüme konisi kendisini 4 (Şekil 2) bölünmesi sebep olur, ancak, diğer seçenekler de 5 olarak tartışılmıştır var.
Bu video DRG takılı bırakarak E12.5 farelerin omurilik nasıl incelemek için ilk olarak göstermektedir. Kılcal tüpler çıkarılmış cam iğneler kullanılarak DRG DII numune küçük miktarlarda sonra fiksasyon uygulanır. Bir inkübasyon adımdan sonra, etiketli omurilik floresan mikroskobu kullanarak bireysel aksonlar analiz etmek için ters bir açık-kitap hazırlık olarak monte edilir.
Protocol
1. Diseksiyon işlemi
Not: farelerde deneysel laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurallar resmen onaylanmış takip etmelidir.
- Hazırlanmadan önce, diseksiyon mikroskobu kurmak ve forseps (iç cilalanmış ipuçları var ikisi) diseksiyon büyük ve küçük makas, büyük dişli forseps, kavisli bir forseps ve Dumont No.5 dört setleri de dahil olmak üzere diseksiyon için gerekli cerrahi aletler yatıyordu ( detaylar) özel reaktifler ve ekipman tabloya bakın. 100 mm Sylgard kaplı Petri kabındaki filtre kağıdı bir sayfa yerleştirin. 12 plaka, 100 mm petri ve 12 ml tüp kuyulardan soğuk PBS dökün ve buz üzerinde bırakın. Buz üzerinde ikinci bir 12 plaka yeri ve her iyi fiksasyonu tampon Pipet 2ml (PBS, pH 7.4% 4 paraformaldehid).
- Anesthetization sonra E12.5 (vajinal fişi tespit E0.5 olarak belirlenmiştir), zaman hamile baraj kurban, fare yerleştirinüç kağıt havlu, çarşaf ve% 70 etanol ile karın bölgesine emmek ventral yüzü yukarı.
- Abdominopelvik boşluğuna açın, bilateral uterin boynuz izole etmek ve buz PBS ile 100 mm yemekler birine aktarabilirsiniz.
- Mikroskopik kontrolü altında, küçük, düz makas ile rahim duvarına uzunlamasına bir kesi yapmak her amniyon kesesi ve plasenta kesip.
- Uzakta Peel her embriyo amniyon kesesi ve göbek kordonu kesmek.
- Küçük bir makas kullanarak, embriyoların başını kesmek ve genomik DNA izolasyonu için genotipleme gerekli olmalıdır başkanları veya bunların bir kısmını bir kenara koymak. Daha sonra, 12 plaka, soğuk PBS ile ilgili kuyu torsi aktarın.
- PBS birkaç damla ile Sylgard çanak filtre kağıdı ıslak ve kağıt üzerinde, dorsal yüzü embriyonik gövde yukarı konumda. Daha iyi denge için, vücut uzak, kuyruk ve ekstremitelerde düzeltin.
- Çalışma16x büyütme ile yaklaşık bir diseksiyon mikroskobu altında, iki çift ince uçlu forseps ile omurilik üzerinde embriyo cilt dikkatlice çimdik ve nazikçe onu parçalamaktır. Ortalarından başlayarak, ilk kuyruk doğru devam edin ve sonra ön tarafına doğru orta sürdürme.
- Embriyo, kurumasını önlemek için iki veya üç damla PBS zaman zaman ıslatın.
- Cilalı iç-ipucu ile ince bir forseps bıçak ile yatay kayma hareketleri çevreleyen kıkırdak vertebral kolon DRG ve omurilik ayırmak embriyo kaldırıldığında bu DRG önlemek için omurilik kapalı teared. Ön sonuna kadar embriyo sağ tarafının ortasında başlayarak, daha sonra kuyruk doğru şekilde çalışır ve. Daha sonra, diğer tarafta işlemi tekrarlayın. Ilişkili DRG rip off için dikkatli olun.
- Embriyo gevşetti omurilik tamamen ayırmak için, onun cervic pick upal ince forseps ile kaudal sonuna doğru tek parça halinde dışarı doğru çekin.
- Izole spinal fiksasyon tamponu ile dolu 12 plaka iyi kablosunu bağlı DRG olan ve geri kalan embriyolar omurilik hazırlık ile devam Batmak.
- Omurilik Fix buz üzerinde en az iki saat.
2. DRG nöronlar DII etiketleme
- Etiketli her omurilik için bir mikropipet çektirmesi ile iki cam iğneler hazırlar. 2 ISI = 600, VEL = 25 = 175, 3, ZAMAN ISI = 630, VEL = 1 ISI = 625, VEL = 35 = 175, TIME: Sutter model P-97 elektrot çektirmesi (program ayarı 30, ZAMAN = 150).
- Mikroskobik kontrolü altında, etanol içinde DII% 5 (w / v) çözeltisi 3-5 kez, her bir cam iğne ucu batırın. Buharlaşma etanol DII kristalleri iğne üzerinde ince bir tabaka oluşturur.
- Yaklaşık 40x büyütme ile diseksiyon mikroskobu altında çalışan, v ile spinal kordentral yüzü yukarı bir slayt. Yaylı makas kullanılarak, daha sonra ters bir açık-book modunda (bkz. kısım C) hazırlık montaj izin Taban ile keserek bütün uzunluğu ventral tarafta kordon açmak.
- Bir slayt dorsal yüzü omurilik yerleştirin. Sonra mikroskobik görselleştirme DII kaplı altında cam iğne ucu ve omurilik bir tarafında dikkatle delmek her saniye DRG elle kablosu yaklaşım. DII hemen hemen hiçbir iz sadece küçük bir nöron sayısı etiketleme sağlamak için deldi DRG görünür olmalıdır. Kablonun diğer tarafına ikinci bir iğne götürün. Sadece her saniyede DRG hedefleyen bireysel akson farklılaşma zorlaştıran komşu DRG etiketli aksonal projeksiyonlar bir örtüşme önler.
- Ortam sıcaklığı en az altı saat ya da 4 gece, karanlıkta fiksasyon tampon ve inkübe omurilik dön ° C di boya için zaman vermekplazma zarı içinde akson boyunca ffuse. Omuriliğe teminat, büyüme analizi isteniyorsa daha uzun bir kuluçka dönemi (iki gün kadar 4 ° C) için izin ver.
3. Montaj ve mikroskopik analizler
- Dorsal yüzü tek bir omurilik PBS açılan bir lamel aşağı boya difüzyon, pozisyon sonrasında. Ekli DRG laterale doğru yönde ve karışmaz özen gösterin. Aşırı sıvı aspire ve forseps kullanarak ters bir açık-book modunda kablosu düzleştirmek.
- Hazırlık PBS kullanarak bir mikroskop lamı üzerine monte edin.
- Etiketli aksonal projeksiyonlar istenmeyen arka plan boyama floresan mikroskopik analiz artışı önlemek için montaj gün yapılmalıdır. 4 slaytlar karanlıkta tutmak kadar ° C
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Fare omurilik alır afferent prservikal 8 çift ojections, 13 çift torakal, lomber ve sakral DRG 4 çift 60 spinal ganglionlar olmak üzere toplam 5 çift. Bir eğitimden sonra en DRG ile hala bağlı bir omurilik beş dakika altında bir embriyo izole edilebilir. Bu prosedür E11.5 E13.5 fare embriyoları bağlı DRG omurilik izolasyonu için uygundur. Ancak, en iyi sonuçları E12.5 elde edilir. Burada açıklanan etiketleme prosedürü Örnek sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. Spinal kord uzunluğu boyunca DRG etiketleme sonra farklı vertebra seviyelerinde (Şekil 4) aksonal dallanma davranışını ölçmek için kullanılıyor olabilir.
Şekil 1: Programı aksonal dallanma iki temel modları tasvir. Burada belirtildiği gibi - (A) bir çatallanma yol açabileceği büyüme konisi faaliyetleri ile Dallanma yanı sıra karmaşık terminali milleri ya da(B) kollateral oluşumu akson mil (interstisyel dallanma). Ikinci modu 6,7 kortikal ve talamokortikal aksonlar projelendirme hakim dallanma tipi.
Şekil 2 Afferent projeksiyonları embriyonik omuriliğe DRG nöronların aksonal dallanma her iki tip ekran: çatallanma tarafından DREZ (1) ve aksonlar ilk şubesini interstisyel dallanma (2) bir bekleme süresinden sonra kızı dalları teminatlar formu.
Şekil 3, embriyonik fare DRG nöronları tek aksonal yörüngeleri Görselleştirme . (A) bağlı DRG Omurilik bir E12.5 fare embriyo hazırlanmıştır. Artan büyütme wild-tip farelerden DII etiketli DRG (Ölçek çubuğu, 1 mm) (BD) Dorsal kez gösterilmiştir. B her saniye DRG labeled DII tarafından. Floresan görüntüleri ters, kaudal sol ve yanal C ve D alt kısmında. C küçük bir sayıda akson etiketli ve yüksek büyütme T gibi dalların omurilik DREZ varlığı tespit edilebilir. (Ölçek barlar, 250 mikron (B), 100 mikron (C) ve 50 mm (D).)
Şekil 4 T-biçimli dalları, yabani tip tek rostral veya kaudal döner ve C-tipi natriüretik peptid (CNP) eksik E13.5 fareler Kantitasyonu. Sayılır tek bir akson sayısı, her bir genotip için farklı gövde düzeyi için parantez içinde verilmiştir. C veya R-döner, ya da rostral kaudal yönde sadece büyüme, sırasıyla.
Şekil 5 cGMP bir sinyal yolağı omurilik DREZ duyusal akson çatallanma tetikler. (A) Programıligand CNP, alıcı guanil siklaz Npr2 ve serin / treonin kinaz cGKIα embriyonik DRG nöronlar oluşur cGMP sinyal yolağı. Npr2 GTP CNP tarafından uyarılması üzerine gelen cGMP üretir. (B), yabani tip ve CNP-eksik farelerde nöron DRG tek bir akson izleme DII. (Ölçek çubuğu, 25 mm.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalıplaşmış projeksiyon modelleri DII etiketlenmesine yönelik sabit doku kullanımı ile birlikte hazırlık kolaylığı ile birlikte iki tip aksonal şube oluşumu oluşan aksonal dallanma çalışma için uygun bir model DRG bağlı embriyonik omurilik yapar. Kaplı cam iğneler kullanarak DII dakika miktarda uygulama sağlar DRG nöronlar küçük gruplar görselleştirme ve böylece bireysel akson ve dallanma desen analizi - DRG toplu etiketleme aksine. Etiketli nöronlar 8 sayı daha da azalır lipofilik tracer iyontoforez enjeksiyon yoluyla açıklanan yönteme daha iyi olabilirdi . Ancak, bu daha çok zaman alıcı olacaktır.
Embriyonik omurilik bütün montaj hazırlıkları tek aksonal yörüngeleri DII etiketleme cGMP sinyalizasyon kaskad-oluşan bir ligand CNP, reseptör Npr2 belirlenmesinde etkili oldu vecGMP-bağımlı kinaz cGKIα - aksonal dallanma tek tip düzenler: DREZ 4,5,9-12 nöronlar DRG çatallanma. CGMP sinyalizasyon mutantlar nöronlar DRG yabani tip, aksonlar aksine DREZ (Şekil 5) az çatallanan yerine, sadece tek bir yöne çevirin. Bu çalışmalar aynı zamanda kollateral oluşumu DRG nöronlar şube oluşumu gözlenen bu ikinci tip farklı 4 düzenlenmiş olduğunu belirten cGMP sinyalizasyon mutantlar etkilenen değildi saptandı.
Alternatif olarak, tek DRG aksonlar dallanma davranış ya da sadece küçük bir alt nöronlar 13 DRG veya bir bireysel nöronlar 14 arasında ayırt etmesine olanak veren bir floresan belirteçlerinin kombinasyonu içeren bir floresan protein ifade transgenik fare hatları incelenecektir. Ancak, floresan fare hatları ile analiz edilmesi mutant fare modeli melez için çaba dikkate alınmalıdır. Ayrıca, promotor (Thy1) transgenik fare hatları floresan proteinleri kullanılan ifade nedeniyle zor gözlenen bir dallanma fenotip, embriyonik gelişim ya da daha sonraki bir dejenerasyon sırasında bozulmuş dal oluşumu sonucu olup olmadığını öğrenmek için doğum sonrası aşamalarında başlar yerine süreç. Buna karşılık, embriyonik DRG DII etiketleme aksonal dallanma oluştuğunda zaman aksonal dallanma ve uygun fare mutantlar bozulma sürecini incelemek üzere bir avantaja sahiptir.
Bağlı DRG embriyonik omurilik hazırlıklar daha adapte zaman omurilik toplanması ve RNA izolasyonu için doku DRG (in-situ hibridizasyon, tüm montaj LacZ veya transgenik farelerin AP-boyama) diğer etiketleme işlemleri için kullanılır, ya da olabilir doku kültürü deneyleri ve kalsiyum görüntüleme veya elektrofizyolojik ölçümler gibi downstream uygulamalar için steril koşullar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Alistair Garratt (Max Delbrück Merkezi, Berlin) faydalı yorumları için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Alman Araştırma Kurumu (DFG) ortak araştırma merkezi (SFB665) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
