Summary
2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしている
Abstract
リンパ節（LNS）は、戦略的適応免疫応答を準備するために末梢組織からの外来抗原の捕捉とプレゼンテーションを可能にするために体全体に配置されており、二次リンパ器官である。自然免疫と適応免疫応答の間の並置、LNは、免疫細胞の相互作用1,2を研究する理想的なサイトです。リンパ球（T細胞、B細胞およびNK細胞）、樹状細胞（DC）、マクロファージは、LNの骨髄由来細胞成分の大部分を構成しています。これらの細胞は、戦略的に自己抗原および潜在的な外来抗原3-5の効率的な監視を可能にするためにLNに配置されている。リンパ球が正常に同族抗原に遭遇するプロセスは、近年の激しい調査の対象となり、抗原受容体、接着分子、ケモカイン、およびそのような線維網状ネットワーク2,6-12として間質構造体を含む分子の連絡先の統合を含む。 前の唯一の形態、位置、およびアーキテクチャに関する答えを提供してin vivoイメージング、静的な画像に頼った捜査官、で高解像度のリアルタイム蛍光灯の開発に。これらの質問は、免疫細胞の挙動の理解に根本的なものですが、この手法の本質的な制限が解読リンパ球人身売買や動的な細胞の挙動に影響を与える環境手がかりに分析を許可されていません。最近、生体内の開発は二光子レーザー走査顕微鏡（2P-LSM）は、捜査官は現場 12月16日 のライブLNS内でダイナミックな動きと個々の細胞の相互作用を表示することができました。特に、我々と他のものは、そのコンパクトな、緻密な自然は、多様な組織のサブ構造11,17-18で大きな組織領域上の多重データ取得の利点を提供して膝LN、内のイメージ細胞挙動との相互作用にこの手法を適用している。それは私のこのテクニックは植血液の中断を必要とする組織のイメージング技術、リンパの流れ、およびシステムの最終的に細胞のダイナミクス上の追加の利点を提供していることに注意することが重要です。さらに、外植組織は、組織が外植後のイメージングのための生きたままでいる時間の非常に限られたウィンドウを持っています。動物の環境条件の適切な水分補給と監視により、撮像時間が大幅にこの生体内技術で拡張することができます。ここでは、生体内イメージングを行う目的で、マウス膝窩LNの準備の詳細な手法を提案する。
Protocol
1。マウス·ホルダ·アセンブリ
- 下向きに100 mmのプラスチックシャーレの蓋の上に100 mmのガラスシャーレの蓋を重ねる。ガラスはほとんどプラスチック皿の中心点に触れなければならない。ステンシルとしてガラスを使用して、プラスチック製の皿の上にマークをトレースします。
- 三日月型のプラットフォームを作成するには、100 mmのプラスチックシャーレの蓋の部分を削除するには、ハンドドリル（すなわち、ドレメル）を使用します。この三日月形のプラスチック製のふたは、マウスの上部の胴（図1a）のサポートとして機能します。金属製のツイストタイでガスマスクを確保するために三日月形の蓋にある2つの穴を開けます。スーパー接着剤または同等の強力な接着剤（図1b）を用いて、ガラスペトリ皿の縁にプラスチック製の蓋を固定します。
- 接着剤2ドーム型キャップPCRチューブ（ヒンジで切断）離れて膝の皮膚フラップを固定する目的で底皿の中央に1cmのふた。
2。マウスの準備
3。手術 4。 2光子イメージングの取得** **この手術はまた、2P-LSM以外の生体内イメージングの他の形態のために役に立つかもしれません。 5。代表的な結果 様々な循環免疫細胞移入後に異なるレートでLNに動員されています。 CD4 +およびCD8 +リンパ球、これらの細胞は2〜4時間6,17-18後、膝窩LNに到着した実質的な数字のIV転送後、高内皮細静脈（HEV）分を介してLNに到着し始める。 Bセルのためにlsは、かなりの数が8から24時間19後、蓄積されます。活性化樹状細胞は、足蹠注射3,11,16-17以下の排出膝窩LN 8から16時間以内に表示されるように開始する必要があります。図2aには、他のランドマークがない、そのようなB細胞濾胞として構造が2P-LSM 19歳未満に見える丸い球状の細胞の蓄積によって容易に識別できることを示しています。このようなユビキチン-GFPの脾細胞（図2、補足動画1と2）の内因性蛍光レポーターを使用して、1つは、非刺激性の生理学的条件の下で週に日、これらのリンパ球の移行や行動を追跡することができます。マルチチャンネルの高感度検出器と、それは構造情報だけでなく、17,19、複数の携帯パートナー間の相互作用のダイナミクスを含む多重イメージングのデータセットを取得することが可能です。 手術手技が適切に実行され、環境条件が注意深く監視され、lymphocy図2C、2Dおよび他13-14,16で示すようにTESは、特徴的な移動速度を示すべきである。リンパ球はまた、血管（のような容器染料の導入によって強調表示された）のようなので、追加のマークは、全体的な画像品質（すなわち、適切な温度制御を判断するのに役立ちますが、イメージングを受けたLNのサブ領域に応じて移動速度の違いを示すことができる、LN等への最小限の外傷）3,6,20。 補足ビデオ1、図2で説明したマウス膝窩のLNのタイムラプス生体2P-LSMのイメージング。 1×10 7リンパ球の合計が単離されたFROMユビキチン-GFP +ドナーマウスと養子、24時間イメージングする前に、C57BL / 6レシピエントマウスに静脈内転送されます。 xyのシリーズは（750μmのX 750μm）の蛍光画像は20秒ごとに繰り返されたXYZ画像のスタック（750μmのX 750ミクロン×65μm）を、得るために固定のZスタック（5μmのステップ、13ステップ）を介して撮影された60分の合計は、速度解析（図2C、2D）のxyzt撮像シーケンスの結果。再生速度= 450X。スケールバー=50μmである。タイムスタンプ=分：秒。 補足ビデオを見るにはここをクリックしてください 。 補足ビデオ2ズーム·イン、B細胞の毛包でのサプリメンタル·ビデオ1の撮像シーケンスの観点から- 。T細胞ゾーンの境界線。再生速度= 450X。スケールバー=25μmである。タイムスタンプ=分：秒C補足ビデオを見るにはここをなめる。 
図1。マウス膝窩LNイメージングのためのマウスホルダーの建設 ）は、マウス·ホルダ·アセンブリの概略図; b）の代表的な生体マウスの準備、c）に完成したマウス·ホルダ·アセンブリと、d）手術の暴露後窩LNの景色をクローズアップ。 
図2。 GFP +リンパ球の移行解析膝窩LNに（a）はC57BL / 6レシピエントマウスに膝LNの2P-LSMの撮像シーケンスから取得した3Dスナップショットは、養子前の画像への1×10 7 GFP +リンパ球が1日に転送されます。破線は、B細胞濾胞の境界を示し、（b）の連続撮影1時間の間にリンパ球遊走の曲、全体のリンパ球遊走速度のc）の分布。 B細胞濾胞（オープンバーで見出される細胞のd）の差動細胞の移行速度分布;速度= 10.04±4.26μm/分を（解析15125トラックの合計）平均= 8.79±3.90μm/分の速度を意味し、合計1525トラックを分析）とT細胞ゾーン（黒棒、平均速度= 13.77±5.93μm/分、分析した1250トラックの合計）。スケールバー=50μmである。
Discussion
特に現場のイメージング技術、2P-LSM の高解像度での最近の進歩は、 生体内での動的な細胞挙動の研究への関心の高まりを伴っています。ライブマウスの膝窩LN上の4Dイメージング技術は、undisrupted組織微小環境内で免疫細胞の動的挙動のそのような分析を可能にします。可視スペクトル全体にまたがる複数の検出器と2P-LSMを使用すると、複数の細胞集団の同時イメージングデータ収集を可能にします。これは現在（有機蛍光細胞色素を用いた差動標識細胞集団の移入の使用と組み合わせてin vivoで細胞特異的な蛍光レポーターマウス（例えば、ユビキチン-EGFP-RFP、または-ECFP） での使用によって達成することができます例えば、CFSE 、SNARF-1、セルトラッカーオレンジ）LN内の細胞のメカニズムと機能を調べることができます。差動追跡cとの間の相互作用の直接観測に加えてエルの人口は、多重イメージングのデータセットには、さらに細胞の挙動と機能を解明するために市販の画像処理ソフトウェアのプログラム（例えばImaris、ビットプレーン社製）でさらに分析を受けることができます。可能性の広範な配列は、in vivoおよびin silicoでのテクニックでこれらを使用して細胞の相互作用のメカニズムを研究するために存在しています。
ここで説明する実験的なアプローチの主な制限は、手術のアプローチに内在する技術的な複雑さです。このテクニックは、関連する解剖と正確な技術的手続きと、このプロトコルで必要とされるスキルに精通するための厳しい訓練を必要とします。さらに複雑な要因は、撮像中に組織の安定性を最適化し、撮像実験の前と間にLNにサーマル、レーザー損傷を防止するため、LNの探査中に組織の損傷を最小限に抑えることの難しさがあります。これらの要因のいずれかへの摂動は、より少なくより最適なリンパ節になりますocyte運動したがって、イメージングデータの解析結果としての適切な解釈に干渉します。
Disclosures
著者らは、開示には何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NCI 1R01CA154656、NIAID 1R21AI092299、がん研究所、聖剣帯財団、ダナ財団、ガブリエルのエンジェル財団、アメリカの現代（ヒョンデ）自動車の "ホープ·オン·ホイール"プログラムからの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Nair - hair removal lotion | Nair | ||
| PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
| Heating pad | Watlow | ||
| Heating Pad Controller | Watlow | ||
| Air and O2 | Airgas | ||
| Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
| Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
| Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
| Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
| Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).
