Abstract
وضع العلامات رجعي من الخلايا العصبية هي طريقة التشريحية مستوى 1،2 التي قد استخدمت أيضا لتحميل الكالسيوم والأصباغ الجهد حساسة إلى الخلايا العصبية 3-6. عموما، يتم تطبيق الأصباغ والبلورات الصلبة أو عن طريق الحقن الضغط المحلية باستخدام ماصات زجاجية. ومع ذلك، وهذا يمكن أن يؤدي إلى التخفيف من شدة العلامات صبغ وانخفاض، وخاصة عندما يطلب من عدة ساعات لنشر صبغ. هنا علينا أن نبرهن تقنية بسيطة ومنخفضة التكلفة لإدخال الأصباغ الفلورية وايون تراعي في الخلايا العصبية باستخدام ماصة شفط البولي ايثيلين مليئة الحل صبغ. هذا الأسلوب يوفر وسيلة يمكن الاعتماد عليها للحفاظ على نسبة عالية من الصبغة في اتصال مع محاور عصبية طوال الإجراء التحميل.
Protocol
وقد استخدمت dextrans فلوري كأدوات التشريحية وللتصوير نشاط الخلايا العصبية 1-4. الحقول وآخرون، (2009) 4 نشر بروتوكول لتطبيق ايون والجهد حساسة للأصباغ إلى مساحات محواري مع التركيز على الحبل الشوكي ونظام نموذجي. نحن هنا وصفا لإجراءات أكثر تفصيلا لتطبيق صبغة الفلورسنت و / أو أيون الحساسة إلى الجذور بطني قطع والجذور الظهرية أو أي المسالك العصبية في النخاع الشوكي لفي المختبر دراسات optophysiological والمورفولوجية.
1. النوع الأول والنوع الثاني الماصات
تبدأ سحب قسمين قصيرة من أنابيب البولي ايثيلين (PE90، العلامة التجارية ادامز كلاي) على شعلة مصباح الكحول 7 إلى إنتاج الماصات مع نصائح مدبب. ينبغي للمرء أن ماصة (نوع-I) أن تكون قصيرة (3-7 ملم) مع طرف الصغيرة التي يمكن أن تعقد بإحكام جذر هدف أو المسالك (القطر الخارجي: 0،2-0،4 مم؛ القطر الداخلي: 0،1-0،3 مم). ثم سحب ماصة الثاني (نوع-II) مع أطول (8-12 سم) رمح أرق، وطرف ناعم جدا (القطر الخارجي: 0،2-0،3 مم؛ القطر الداخلي: 0،1-0،2 مم) التي يمكن إدراجها في نوع-I ماصة بقدر على الحافة. سيتم استخدام ماصة أرق الثانية لنضح وإدخال الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF) والحل صبغ على التوالي من نوع ماصة-I.
2. تحديد المواقع من نوع-I ماصة
تشريح وعزل النخاع الشوكي 8،9 ووضعه في حمام، superfused مع aCSF مبرد (~ 16 درجة مئوية) في جميع مراحل عملية التحميل. وضع نوع-I ماصة على حامل قطب كهربائي (H1/12 حامل قطب كهربائي، Narishige) بحيث يمكن افتتاحه ظهر صلها بسهولة إلى حقنة (1ml U-100 حقنة الأنسولين، بيكتون ديكنسون أو مشابه) عن طريق أنابيب مرنة (PharMed BPT، كول، Parmer، # AY242002؛ 10 سم) (Fig.1A-B).
3. صبغ التطبيق
- باستخدام محقنة، رسم 1تليها القناة محواري أو جذر المراد شغلها (الشكل 2B)؛ aCSF في ماصة نوع-I (2A Fig.1B). وينبغي بعد ذلك في أنابيب مرنة يمكن ازالتها من الافتتاح الى الوراء. يتم إرفاق ماصة من النوع الثاني إلى آخر حقنة وإدخالها في النوع الأول عقد ماصة المسالك محواري أو جذر. استخدام الحقنة التي تعلق على ماصة النوع الثاني، نضح aCSF بحيث aCSF المتبقي يغطي فقط الجهاز محواري (Fig.1C؛ 2C-D). ثم سحب ماصة النوع الثاني من نوع ماصة-I. مراقبة مستوى aCSF لبضع دقائق للتحقق من ختم جيدة على المسالك محواري أو الأعصاب (انظر القسم 3 في حل لمشاكل تخص "ختم جيدة").
- حل الصبغة في aCSF أو 0.2٪ تريتون X-100 في الماء المقطر المزدوج واستدراجه الى ماصة من النوع الثاني في حين لا تولي اهتماما لتشمل فقاعات الهواء. إدراج ماصة النوع الثاني يحتوي على صبغ في ماصة من النوع الأول وإلى حل aCSF المتبقية (الشكل 2E). الافراج عن ببطءالصبغة في aCSF باستخدام ضغط إيجابي لطيف (الشكل 2F). يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء أو التسبب في نزوح النسيج المستهدف من داخل الحافة. سحب ماصة النوع الثاني بعد كمية كافية من صبغ لقد تم الافراج عن (3-5 ميكرولتر من محلول الصبغة).
4. حضانة
احتضان النسيج في الظلام ما بين 6 إلى 20 ساعة اعتمادا على نوع من التجربة. مرة واحدة ولم يسمح الوقت الكافي للتعبئة، وسحب بلطف بعيدا القطب من النسيج تاركا الأنسجة جاهزة للتصوير أو الأنسجة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
- إذا كان النسيج المستهدف لا يدخل بسهولة الى غيض من ماصة نوع من أنا أو هو فضفاض داخل مرة واحدة، ثم قطر طرف هو حجم الخطأ. إذا حدث هذا، سحب واستخدام ماصة مختلفة.
- قبل إضافة إلى صبغ aCSF في ماصة النوع الأول، تأكد من أنه لا يزال aCSF بما فيه الكفاية بحيث يمكن التوصل إليه معالنوع الثاني ماصة طرف (الشكل 2D). وإلا فإن وجود فجوة في الهواء مرة واحدة يضاف صبغ. إذا حدث هذا، لا تضيف الصبغة وإزالة الجهاز محواري من ماصة ثم استدراجه إلى الخلف في aCSF مع ما يكفي من التوصل إلى نوع من ماصة-II.
- إذا كان مستوى aCSF في الزيادات ماصة نوع من أنا بعد أن يستنشق ذلك مع ماصة من النوع الثاني، وهو ما يعني أن الختم مع النسيج ليست جيدة. استخدام القطب مختلفة، وإلا سيتم تخفيف الصبغة أثناء إجراء وضع العلامات.
- إذا تم إدخال أية فقاعة الهواء إلى ماصة نوع-I في حين حقن الصبغة، واستنزاف خارج الفقاعة من خلال دفع غيض ماصة النوع الثاني على مقربة من فقاعة وتطبيق بلطف ضغط سلبي ضعيف باستخدام محقنة المرفقة.
5. ممثل النتائج
لتوضيح تطبيق طريقة، ونحن تحميلها في وقت واحد العصبونات الحركية، الحسية وafferents interneurons الشوكي مع ثلاثة dext مختلفةركض، مترافق الأصباغ الفلورية (الشكل 3A). كما هو موضح في الشكل. وصفت 3B وثلاثة أنواع من الخلايا العصبية، الحسية afferents (الحمراء)، interneurons إسقاط في الحبلة بطني (الخضراء) والعصبونات الحركية (الأزرق).
الشكل 1. تخطيطي يظهر الماصة من النوع الأول ونوع التجمع الثاني. (أ) من النوع الأول يتم وضع ماصة (الضوء الأزرق) على حامل قطب كهربائي حتى أنه ظهر ويمكن فتح صلها بسهولة إلى الأنبوب الاستومر مرنة (B) والذي يمكن أن يتم إدخال ماصة من النوع الثاني (C).
الشكل 2. تخطيطي يظهر عملية التحميل من العصبونات الحركية مع الأصباغ الفلورية. (أ) يتم وضع ماصة نوع-I بالقرب من جذر بطني المراد ملؤها. (ب) يطبق شفط للماصة لرسم aCSF في ماصة تليها جذورها. (C-D) افصل أنابيب مرنة من المطاط الصناعي الخلفية من نوع-I ماصة وتقليل كمية aCSF من خلال تطبيق الشفط إلى ماصة من النوع الثاني. (ه) إدراج غيض من ماصة النوع الثاني يحتوي على صبغ المذابة إلى aCSF المتبقية في ماصة نوع-I. (EF) ملء ببطء ماصة نوع-I مع الصبغة ومن ثم إزالة ماصة من النوع الثاني.
الشكل 3. تطبيق إجراء تعبئة إلى الحبل الشوكي الماوس معزولة. (أ) تخطيطي يظهر ثلاثة أنواع من أنا الماصات المستخدمة لملء الطبقات المختلفة في الخلايا العصبية في النخاع الشوكي. تم ردم من خلال الجذور البطنية والظهرية، على التوالي العصبونات الحركية (الأزرق؛؛ تتالي ديكستران الأزرق) وafferents الحسية عجزي (تكساس الأحمر ديكستران الحمراء). وقد استخدم فلوريسئين ديكستران لتحميل interneurons الشوكي (الخضراء) التي تصعد من خلال محاور عصبية الحبلة بطني (VF). 1 ملغ من كل صبغة ديكستران (10،000 ميغاواط، المسابر الجزيئية)تم حله في 6 الماء المقطر ميكروليتر التي تحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 (B). مبائر صورة لمقطع من الحبل عجزية من الحبل الشوكي في الخلايا العصبية التي عادت المسمى كما هو موضح في الملاحظة أ أن afferents المسمى الحسية هي في المقام الأول المماثل مع التوقعات 1 المقابل قليلة. والعصبونات الحركية وصفت هي المماثل إلى الجذر بطني مليئة بينما interneurons صفت هي المقابل إلى جانب التعبئة (رأس السهم). شريط معايرة 200 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J.
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
