Summary
Descriviamo una tecnica semplice ea basso costo per introdurre alta concentrazione di coloranti fluorescenti e calcio-sensibili in neuroni o qualsiasi tratto neuronale mediante una pipetta di aspirazione polietilene.
Abstract
Etichettatura retrograda di neuroni è uno standard 1,2 metodo anatomica che è stata anche utilizzata per caricare e calcio voltaggio-coloranti sensibili in neuroni 3-6. Generalmente, i coloranti vengono applicate come cristalli solidi o mediante iniezione a pressione locale utilizzando pipette di vetro. Tuttavia, ciò può causare diluizione della intensità etichettatura colorante e ridotta, in particolare quando sono necessarie diverse ore per diffusione colorante. Qui mostriamo una tecnica semplice e di basso costo per l'introduzione coloranti fluorescenti e ioni sensibile in neuroni con una pipetta di aspirazione polietilene riempito con la soluzione colorante. Questo metodo offre un modo affidabile per mantenere un'elevata concentrazione del colorante in contatto con assoni tutta la procedura di caricamento.
Protocol
Destrani fluorescenti sono stati utilizzati come strumenti anatomici e per l'imaging attività neuronale 1-4. Campi et al. (2009) 4 pubblicato un protocollo per l'applicazione di ioni e della tensione di coloranti sensibili ai tratti assonali con un focus sul midollo spinale come sistema modello. Qui si descrive una procedura più dettagliata per l'applicazione colorante fluorescente e / o ione-sensibile alle radici taglio ventrali, radici dorsali o qualsiasi tratto neuronale del midollo spinale per studi in vitro optophysiological e morfologiche.
1. Di tipo I e tipo II Pipettes
Avviare tirando due brevi tratti di tubazione in polietilene (PE90, Clay marca Adams) sulla fiamma di una lampada ad alcool 7 per la produzione di pipette con puntali conici. Una pipetta (Type-I) deve essere breve (3-7 mm) con una piccola punta che può ben tenere la radice di destinazione o del tratto (diametro esterno: 0,2-0,4 mm, diametro interno: 0,1-0,3 mm). Quindi tirare una pipetta secondo (Type-II) con un più lungo (8-12 cm) più sottile, albero e una punta molto fine (diametro esterno: 0,2-0,3 mm, diametro interno: 0.1-0.2 mm) che può essere inserito nel tipo I pipettare fino la sua punta. La seconda pipetta sottile verrà utilizzato per aspirare ed introdurre fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) e la soluzione colorante, rispettivamente, dal tipo I pipetta.
2. Posizionamento di tipo-I Pipettare
Staccare ed isolare il midollo spinale 8,9 e collocarlo in un bagno, con superfuso refrigerate ACSF (~ 16 ° C) durante tutto il processo di caricamento. Posizionare il Type-I pipettare su un portaelettrodo (H1/12 portaelettrodo, Narishige) in modo che la sua apertura posteriore può essere facilmente collegato ad una siringa (1 ml U-100 siringa da insulina, Becton Dickinson o comparabili) tramite un tubo flessibile (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Fig.1A-B).
3. Dye Application
- Usando la siringa, prima disegnareACSF nel tipo I pipetta (Fig.1B; 2A) seguita dal tratto assonale o radice da riempire (Fig. 2B). Il tubo flessibile deve quindi essere rimosso dalla apertura posteriore. Il Tipo II-pipetta è attaccata ad un'altra siringa e inserito nel tipo I pipettare premuto il tratto assonale o radice. Usando la siringa collegata al tipo II pipetta, aspirare ACSF in modo che il residuo ACSF copre appena il tratto assonale (Fig.1C; 2C-D). Poi ritirare il tipo II pipetta dal tipo I pipetta. Monitorare il livello ACSF per qualche minuto per verificare una buona tenuta sul tratto assonale o nervi (vedi sezione 3 Risoluzione dei problemi di "buona tenuta").
- Sciogliere il colorante in ACSF o 0,2% di Triton X-100 in acqua bidistillata e renderlo il Type-II pipetta facendo attenzione a non includere bolle d'aria. Inserire il Tipo II-pipetta contenente il colorante nel tipo I pipetta e nella soluzione residua ACSF (Fig. 2E). Rilasciare lentamenteil colorante nella ACSF mediante una leggera pressione positiva (Fig. 2F). Fare attenzione a non introdurre eventuali bolle d'aria o di provocare lo spostamento del tessuto bersaglio dall'interno della punta. Ritirare il tipo II pipetta dopo sufficiente quantità di colorante è stata rilasciata (3-5 ml di soluzione colorante).
4. Incubazione
Incubare il tessuto al buio tra 6 e 20 ore a seconda del tipo di esperimento. Una volta che un tempo sufficiente è stato consentito per il riempimento, tirare delicatamente l'elettrodo lontano dal tessuto lasciando il tessuto pronto per l'imaging e l'istologia.
Risoluzione dei problemi
- Se il tessuto bersaglio non entra facilmente nella punta della pipetta di tipo I o è sciolto una volta dentro, allora il diametro della punta è la dimensione sbagliata. In questo caso, tirare e utilizzare una pipetta differente.
- Prima di aggiungere il colorante alla ACSF del tipo I pipetta, assicurarsi che ACSF sia sufficiente in modo che possa essere raggiunto con laType-II puntale (Fig. 2D). Altrimenti, un traferro esisterà una volta che il colorante viene aggiunto. Se questo accade, non aggiungere il colorante e rimuovere il tratto assonale dalla pipetta e poi tirarla indietro con ACSF sufficiente per essere raggiunto dalla Type-II pipetta.
- Se il livello ACSF in tipo I aumenta pipette dopo che è stato aspirato con il Tipo II-pipetta, significa che il sigillo con il tessuto non è buona. Utilizzare un elettrodo diverso, altrimenti il colorante viene diluito nel corso della procedura di etichettatura.
- Se una bolla d'aria viene introdotta nel tipo I pipetta mentre iniettando il colorante, defluire la bolla facendo avanzare il tipo-II vicino punta della pipetta per la bolla e delicatamente applicando una pressione negativa debole usando la siringa attaccata.
5. Risultati rappresentativi
Motoneuroni Per illustrare l'applicazione del metodo, caricati contemporaneamente, le afferenze sensoriali e interneuroni spinali con tre differenti Dextcorse di coniugati coloranti fluorescenti (Fig. 3A). Come illustrato in fig. 3B, tre classi di neuroni sono etichettati; afferenze sensoriali (rosso), interneuroni sporgenti all'interno del funicolo ventrale (verde) e motoneuroni (blu).
Figura 1. Schema che mostra Pipettare di tipo I e tipo II montaggio. (A) Un tipo I pipetta (luce blu) è posto su un portaelettrodo in modo che sia indietro apertura può essere facilmente collegata al tubo elastomero flessibile (B) e in cui uno di tipo II pipetta può essere inserito (C).
Figura 2. Schematico che mostra il processo di caricamento dei motoneuroni con coloranti fluorescenti. (A) di tipo A-I pipetta si trova vicino alla radice ventrale da riempire. (B) di aspirazione viene applicata alla pipetta per disegnare ACSF nella pipetta seguita dalla radice. (C-D) Staccare il tubo flessibile in elastomero dal backend di tipo-I pipetta e ridurre la quantità di ACSF applicando aspirazione alla Type-II pipetta. (E) Inserire la punta della pipetta Type-II contenente il colorante dissolto nel ACSF rimanente nel tipo I pipetta. (EF) Lentamente riempire la Type-I pipetta con il colorante e quindi rimuovere la Type-II pipetta.
Figura 3. Applicazione della procedura di riempimento al midollo spinale topo isolato. (A) schematico che mostra tre tipo I pipette per riempire diverse classi neuronali nel midollo spinale. Motoneuroni (blu, blu destrano Cascade) e sacrale afferenze sensoriali (rosso, Texas-Red destrano) sono stati riempita attraverso le radici ventrali e dorsali, rispettivamente. Fluoresceina destrano è stato utilizzato per caricare interneuroni spinali (verde) i cui assoni salire attraverso il funicolo ventrale (VF). 1 mg di ciascun colorante destrano (10.000 MW; Molecular Probes)è stato sciolto in 6 microlitri di acqua distillata contenente 0,2% Triton X-100 (B). Immagine confocale di una sezione del midollo sacrale di un midollo spinale in cui i neuroni sono stati retro-etichettato come descritto in A. Si noti che le afferenti etichettate sensoriali sono principalmente omolaterale con alcune sporgenze poco controlaterali. I neuroni motori sono etichettati omolaterale alla radice ventrale riempita mentre le interneuroni sono etichettati controlaterale al lato del riempimento (testa freccia). Calibrazione bar 200 micron.
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Discussion
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Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J.
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
