Summary
अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के जीनोटाइप को बदलने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है. अगर ब्याज की जीन दोनों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं और गैर अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया है, अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं गैर अस्थि मज्जा व्युत्पन्न सेल जीनोटाइप बदलने के बिना एक अलग जीनोटाइप बदल सकते हैं.
Protocol
1. इससे पहले कि आप शुरू तकनीकी कारणों से
- हम प्रयोग के लिए दोनों C57/BL6 जंगली प्रकार चूहों और पीटा चूहों का उपयोग करने की अनुशंसा क्योंकि इसी सीडी अणुओं के साथ चूहों प्रमुख माउस विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है.
- चूंकि यह मुश्किल है कि जंगली प्रकार चूहों और अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद दाता कोशिकाओं व्युत्पन्न पीटा चूहों ट्रैक है, यह जरूरी है कि CD45.1 चूहों का उपयोग प्रकार के जंगली चूहों का प्रतिनिधित्व करने के लिए. (CD45.1 C57/SJL WT चूहों जैक्सन प्रयोगशालाओं स्टॉक 002,014).
- अधिकांश माउस कालोनियों CD45.2 हैं. हमारे पीटा चूहों CD45.2 जीनोटाइप (जैक्सन लेबोरेटरीज स्टॉक 000664 वैकल्पिक रूप से एक CD45.2 WT चूहों स्रोत) हैं. अस्थि मज्जा और परिधीय रक्त के प्रवाह cytometry का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल में धारा 7 के रूप में उल्लेख किया है CD45.1 या CD45.2 जीनोटाइप का निर्धारण किया जा सकता है.
- विकिरण के बाद चूहे उन्मुक्ति समझौता किया है. रोगज़नक़ मुफ्त सुविधा में चूहों रखें.
- Irradiator के ऑपरेशन के लिए विशेष सुरक्षा की आवश्यकता है clearancई और प्रशिक्षण. प्रशिक्षण और अनुमोदन प्रक्रियाओं में समय बचाने के लिए, यह सबसे अच्छा है योग्य तकनीशियन के साथ एक प्रयोगशाला है जो irradiator संचालित करने में सक्षम है के साथ सहयोग.
- कई संस्थानों अनुभवी तकनीशियनों के साथ प्रवाह cytometry प्रयोगशालाओं है. प्रवाह cytometry आपरेशन के साथ समस्याओं को कम करने के लिए, यह बेहतर है अनुभवी तकनीशियन के साथ अपने प्रवाह cytometry प्रयोग योजना पर चर्चा के लिए इससे पहले कि आप शुरू.
- चूहे इस तरीके (समूह प्रति 10 चूहों) में सौंपा गया:
| समूह | अस्थि मज्जा प्राप्तकर्ता को दाता | उपचार | |
| एक | बी.एम. विनिमय | CD45.1 WT CD45.2 KO | DSS बृहदांत्रशोथ |
| बी | पानी सामान्य नियंत्रण | ||
| सी | बी.एम. विनिमय | CD45.2 CD45.1 WT KO | डी एसएस बृहदांत्रशोथ |
| डी | पानी सामान्य नियंत्रण | ||
| ए | दिखावा | CD45.1 WT CD45.1 WT | DSS बृहदांत्रशोथ |
| एफ | पानी सामान्य नियंत्रण | ||
| जी | दिखावा | CD45.2 CD45.2 KO KO | DSS बृहदांत्रशोथ |
| एच | पानी सामान्य नियंत्रण |
* प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त चित्रण चित्र 1 में दिखाया गया है.
2. प्राप्तकर्ता चूहे किरणन
- चूहे और नस्ल रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में रखा. फिल्टर के साथ प्लेस autoclaved विकिरण पाई में चूहों. विकिरण पाई का प्रत्येक स्लॉट में एक माउस रखें. Irradiator में पाई रखें और सुनिश्चित करें कि turntable और पाई बदल रहे हैं.
- एयर पंप पर मुड़ेंवेंटिलेशन के लिए. Irradiator दरवाजा बंद और यह ताला.
- 10 मिनट (विकिरण स्रोत और आधा जीवन पर निर्भर करता है) के आसपास 1,000 रेड (जो 10 Gy के बराबर है) के साथ चूहों चमकाना. इस समय बिंदु से विकिरणित चूहों इम्युनो - समझौता कर रहे हैं और संक्रमण के खिलाफ कमजोर प्रतिरक्षा है. विकिरण के बाद पाई बाहर ले और जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए परिवहन के लिए जानवरों की सुविधा में एक बाँझ कंटेनर में जगह. बाहरी वातावरण के लिए चूहों को उजागर करने के लिए संक्रमण की संभावना को कम करने से बचें.
- जैव सुरक्षा कैबिनेट में, autoclaved बिस्तर (3.12 मिलीग्राम प्रति 100 मिलीलीटर पानी पिंजरे प्रति 4 चूहों sulfatrim निलंबन के साथ नए बाँझ पानी जोड़ें) के साथ autoclaved माउस पिंजरों में चूहों को हस्तांतरण.
- लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पानी की बोतल के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं. पिंजरे में लोड करने से पहले sulfatrim समाधान की बोतल मिश्रण अच्छी तरह हिला.
3. दाता अस्थि मज्जा निष्कर्षण
- कार्बन डाइऑक्साइड या isoflur साथ चूहों बलिदानमंजूरी और फिर 1:200 Lysol समाधान में विसर्जित. 70% इथेनॉल के साथ चूहों स्प्रे त्वचा गीला और हड्डियों खुले टुकड़े करना.
- बंध्याकरण के लिए 70% इथेनॉल में विच्छेदन उपकरणों भिगोएँ.
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में विच्छेदन प्रदर्शन. बाँझ विच्छेदन उपकरणों का उपयोग humerus, फीमर, टिबिया और fibula हड्डियों, मांसपेशियों और स्नायुबंधन संलग्न से मुक्त बेनकाब.
- लाल अस्थि मज्जा दिखाने के हड्डियों के दोनों सिरों को खोलने कट. संदंश के साथ हड्डियों पकड़ो. 3 मिलीलीटर सिरिंज और एक पेट्री डिश 25G सुइयों के साथ ठंड पीबीएस के साथ लाल अस्थि मज्जा बाहर फ्लश. हड्डियों के दोनों सिरों से निकलवाने अधिक अस्थि मज्जा की कोशिकाओं उपज.
- 6 मिलीलीटर सीरिंज और 18G1 / 2 सुइयों प्रयोग दोहराया आकांक्षा और इंजेक्शन से लाल अस्थि मज्जा प्लग को तोड़ने के. 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों के साथ अस्थि मज्जा से स्थानांतरण.
- अस्थि मज्जा स्पिन 1,800 rpm में 5 मिनट के 4 डिग्री सेल्सियस नीचे के लिए 5-10 सेकंड के लिए vortexing द्वारा तैरनेवाला, resuspend गोली त्यागें.
- 10X आरबीसी lysis बफर बाँझ पानी के साथ पतला. विज्ञापनघ 1X आरबीसी lysis बफर (दाता माउस प्रति 5 मिलीग्राम), 5 सेकंड के लिए फिर भंवर और कमरे के तापमान पर वास्तव में 3 मिनट रखने.
- 3 मिनट के बाद, 20 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ ट्यूब भरने के लिए lysis और मिश्रण को रोकने. एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से एक नया 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में सीधे सामग्री डालो.
- पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ मूल ट्यूब कुल्ला और सेल झरनी के रूप में अच्छी तरह से हस्तांतरण. PBS और मिश्रण के साथ 50 मिलीलीटर शीर्ष.
4. अस्थि मज्जा दाता कोशिकाओं की गिनती
- एक Eppendorf ट्यूब और अस्थि मज्जा निलंबन के एक Eppendorf ट्यूब और मिश्रण करने के लिए 100 μl Trypan नीले रंग की 100 μl जोड़ें. एक hemocytometer दाग सेल मिश्रण विंदुक.
- कुल रहने वाले फाल्कन ट्यूबों में अस्थि मज्जा कोशिका गिनती = अस्थिर सेल नंबर 2 (x Trypan नीले कमजोर पड़ने के कारण) 16 वर्गों में सौ सौ एक्स 50 मिलीलीटर से कोशिकाओं की मात्रा की गणना की है
- 5 मिनट के 4 डिग्री सेल्सियस नीचे के लिए अस्थि मज्जा की कोशिकाओं स्पिन 2,000 rpm पर 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में
- तैरनेवाला निकालें. आधारितकुल सेल की गिनती पर, 1 x 10 मिलीलीटर प्रति 8 कोशिकाओं पीबीएस के साथ गोली resuspend
5. प्राप्तकर्ता चूहे के लिए आसव
- एक गर्मी पैड पर प्राप्तकर्ता और एक वार्मिंग दीपक के तहत चूहों गर्म. Restrainer में प्राप्तकर्ता चूहों रखो. नसों के 100-200 μl में 1 एक्स माउस प्रति 10 7 कोशिकाओं इंजेक्षन.
- दाता अस्थि मज्जा का इंजेक्शन विकिरण के बाद 4-24 घंटे के बीच किया जाना चाहिए.
- 4 पिंजरे प्रति चूहों अंतःक्षिप्त करने के लिए रखें. रोगज़नक़ नि: शुल्क पशु सुविधा में पहले 4 सप्ताह के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का इलाज पानी के साथ इंजेक्शन autoclaved पिंजरों में चूहों प्राप्तकर्ता को बनाए रखने और चूहों उन्मुक्ति हासिल. बदले पिंजरों, एंटीबायोटिक इलाज के पानी और भोजन स्वच्छता बनाए रखने के लिए हर 4 दिनों के लिए.
6. बृहदांत्रशोथ और कोलाइटिस के मूल्यांकन की प्रेरण
- विकिरण और अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना नियमित रूप से पानी के लिए स्विच और 2 सप्ताह के लिए चूहों को बनाए रखने के लिए अपने सामान्य हासिलmicroflora आंत.
- अस्थि मज्जा इंजेक्शन 6 सप्ताह के बाद, प्रारंभिक शरीर के वजन को मापने के. कुछ चूहों पानी यथेच्छ पीने के लिए बृहदांत्रशोथ प्रेरित में 5% dextran सल्फेट दिया जाता है. कुछ चूहों सामान्य नियंत्रण समूहों के रूप में ही नियमित रूप से पीने का पानी दिया जाता है.
- 5 दिन बाद, परिधीय रक्त निकालने, हेपरिन लेपित ट्यूब (Vacutainer) स्थानांतरण और बर्फ में रखना. 4 चूहों से 1 ट्यूब रक्त पूल. रक्त की 300 μl सेल धुंधला हो जाना = 600 μl बफर के 300 μl के साथ जुडा है. 5 Eppendorf ट्यूब, प्रत्येक के 100 μl साथ रक्त फूट डालो.
- कार्बन डाइऑक्साइड या isoflurane के साथ चूहों बलिदान. मूल्यांकन macroscopic क्षति स्कोर (कृपया 1 जानकारी के लिए एक और जौव वीडियो प्रकाशन देखें). शरीर के वजन को बदलने के उपाय. उपाय आंत्र और डिजिटल कैलिपर के साथ लंबाई और मोटाई. मल बनावट (कठोर या खूनी) को ध्यान से देखें. Hemooccult साथ मल में मनोगत खून का निर्धारण करते हैं. बृहदान्त्र ऊतकों को काटना और एच एंड ई धुंधला हो जाना के लिए formalin में तय.
- 1 फीमर टुकड़े करना बोne माउस प्रति, अस्थि मज्जा निकालने और 25G सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से ठंड पीबीएस के साथ अस्थि मज्जा फ्लश. पूल 4 अस्थि मज्जा 1 ट्यूब प्लग और बर्फ में रहते हैं.
- पेट्री डिश, कतरनी 18G सुई और 5 मिलीलीटर सिरिंज कई बार साथ अस्थि मज्जा प्लग अस्थि मज्जा डालो जब तक कोई अस्थि मज्जा प्लग मौजूद है.
- 5 मिनट के लिए 1,500 rpm के साथ नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन तैरनेवाला और 600 μl सेल धुंधला हो जाना बफर के साथ resuspend निकालें. 5 Eppendorf ट्यूब, प्रत्येक के लिए 100 μl के साथ resuspended अस्थि मज्जा विभाजित करते हैं.
7. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के प्रवाह cytometry द्वारा गुणवत्ता निरीक्षण
- रक्त या अस्थि मज्जा # 1-5 से प्रत्येक नमूना ट्यूब लेबल:
- अंधेरे में प्रत्येक संबंधित ट्यूब के लिए एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें.
# कोई एंटीबॉडी 1
# 2 30 μl FITC निर्धारण नियंत्रण + 30 μl पीई निर्धारण नियंत्रण + 15 μl CD16/32 अवरुद्ध
# 30 3 μl FITC CD45.1 अब + 15 μl CD16/32 अवरुद्ध
# 30 μl पीई 4CD45.2 AB + 15 μl CD16/32 अवरुद्ध
# 30 5 μl FITC CD45.1 अब + 30 μl पीई CD45.2 अब + 15 μl CD16/32 अवरुद्ध
| रक्त या अस्थि मज्जा नमूना # 1 के लिए कुछ भी नहीं जोड़ें |
| प्रत्येक रक्त या अस्थि मज्जा नमूना # 2 एंटीबॉडी # 2 मिश्रण के 5 μl जोड़ें |
| प्रत्येक रक्त या अस्थि मज्जा नमूना # 3 एंटीबॉडी # 3 मिश्रण के 3 μl जोड़ें |
| प्रत्येक रक्त या अस्थि मज्जा नमूना # 4 # 4 एंटीबॉडी मिश्रण के 3 μl जोड़ें |
| प्रत्येक रक्त या अस्थि मज्जा नमूना # 5 # 5 एंटीबॉडी मिश्रण के 5 μl जोड़ें |
- अंधेरे में बर्फ में 30 मिनट के लिए रखें.
- प्रत्येक ट्यूब 2 मिलीलीटर 1X आरबीसी lysis बफर जोड़ें. अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए रखें.
- Rpm 1500 कोशिकाओं स्पिन, 5 मिनट के 4 डिग्री सेल्सियस (GH 3.8 रोटर, पन्द्रह सौ rpm = 350 XG) तैरनेवाला निकालें. अंधेरा है, तो भंवर संक्षेप में 500 μl सेल धुंधला हो बफर के साथ गोली Resuspend. और प्रवाह cytometry द्वारा immunostained रक्त अस्थि मज्जा के नमूनों में CD45.1 (WT प्रतिनिधित्व) और CD45.2 (KO प्रतिनिधित्व) की जाँच करें. FITC का चयन करें WT CD45.1 और पीई प्रतिनिधित्व KO CD45.2 का प्रतिनिधित्व.
- प्रवाह cytometry FlowJo सॉफ्टवेयर से परिणामों का विश्लेषण. पीई अनुपात या पीई: FITC के अनुपात की गणना FITC अनुपात निर्धारित करने के लिए कि दाता जीनोटाइप रक्त और अस्थि मज्जा में प्रमुख जीनोटाइप है.
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Representative Results
यदि जीन की ब्याज बृहदांत्रशोथ के विकास के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, चूहों अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (WT KO या WT के लिए KO) के माध्यम से अलग जीनोटाइप के अस्थि मज्जा DSS बृहदांत्रशोथ के लिए एक बदल प्रतिक्रिया प्राप्त होना चाहिए. बृहदांत्रशोथ की गंभीरता का निर्धारण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों में से एक colonic ऊतकों के एंड एच ई धुंधला हो जाना है. Colonic ऊतक संरचना में परिवर्तन और सूजन के लक्षण मात्रात्मक एच एंड ई ऊतक विज्ञान स्कोरिंग प्रणाली द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. मानदंड एच एंड ई DSS बृहदांत्रशोथ मॉडल के लिए ऊतक विज्ञान स्कोरिंग के लिए 2 यहां पाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, रासायनिक प्रेरित बृहदांत्रशोथ भी trinitrobenzene सल्फोनिक एसिड (TNBS) द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. TNBS बृहदांत्रशोथ प्रेरण और एच एंड ई ऊतक विज्ञान स्कोरिंग मापदंड के तरीके एक पिछले 3 प्रकाशन में पाया जा सकता है. प्रोटोकॉल के समूहों के बीच अंतर स्कोर छात्र टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
चूहों काफी हो सकता हैameliorated या बृहदांत्रशोथ बिगड़ गई जब नकली अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (WT या KO KO के लिए WT) के साथ चूहों की तुलना में. यदि जीन की ब्याज अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के माध्यम से कोलाइटिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, विमर्श अस्थि मज्जा के साथ चूहों काफी दिखावा अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के साथ चूहों से अलग जवाब देना चाहिए.
DSS बृहदांत्रशोथ मॉडल के लिए, ऊतक विज्ञान परिवर्तन ऊतक विज्ञान स्कोरिंग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 4 देखें). ऊतक विज्ञान स्कोर के महत्वपूर्ण परिवर्तन अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं में जीन की ब्याज द्वारा मध्यस्थता बृहदांत्रशोथ के विकास का संकेत हो सकता है. उदाहरण के लिए, cathelicidin एक विरोधी माइक्रोबियल और विरोधी भड़काऊ पेप्टाइड (हमारे मामले में जीन की ब्याज) जीन 4 है. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बिना, cathelicidin KO चूहों आम तौर पर विकसित बदतर बृहदांत्रशोथ से जंगली प्रकार चूहों DSS के लिए प्रतिक्रिया में किया. जंगली प्रकार (WT) अस्थि मज्जा की cathelicidin (KO) पीटा चूहों रक्ताधान ameliorated बृहदांत्रशोथ के लिए होता है, जबकि transfusicathelicidin पीटकर से अस्थि मज्जा (KO) जंगली प्रकार चूहों (WT) करने के लिए चूहों के बदतर बृहदांत्रशोथ के लिए जाता है जब DSS (2 चित्रा) संपर्क.
जीन के ब्याज की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए, जीन के ब्याज की mRNA दाता अस्थि मज्जा से जंगली प्रकार (जैसे. Cathelicidin) अभिव्यक्ति हड्डी के बाद colonic (या अन्य) के cathelicidin कमी पीटा प्राप्तकर्ता चूहों के ऊतकों में detectable होना चाहिए मज्जा प्रत्यारोपण. यह भी पता करने के लिए है कि जंगली प्रकार प्राप्तकर्ता चूहों में जीन की ब्याज की अभिव्यक्ति पीटा चूहों अस्थि मज्जा के दान के बाद कम हो जाता है दिलचस्प है.
दाता अस्थि मज्जा का सफल engraftment प्राप्तकर्ता दोनों परिधीय रक्त कोशिकाओं और प्राप्तकर्ता चूहों की अस्थि मज्जा में सीडी निर्धारण पर दाता सीडी निर्धारण की प्रमुख अनुपात द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. अस्थि मज्जा से पता चलता है कि सबसे अच्छा प्रवाह cytometry में CD45.1 और CD45.2 की लेबलिंग के रूप में रक्त अस्थिर कोशिकाओं (2 चित्रा और 3) के एक बहुत कुछ है.
चित्रा 1. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल.
चित्रा 2. प्रवाह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों की अस्थि मज्जा का cytometry डेटा. Y-अक्ष से पता चलता है संकेत CD45.1 और X-अक्ष से पता चलता है कि पीई CD45.2 संकेत लेबल FITC लेबल. सफल अस्थि प्रत्यारोपण दोनों की हड्डी और प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त मज्जा में CD45.1 या CD45.2 जीनोटाइप के परिवर्तन से परिभाषित किया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त के प्रवाह cytometry डेटा. Y-अक्ष से पता चलता है FITC लेबल संकेत CD45.1 और X-अक्ष से पता चलता है कि पीई CD45.2 संकेत लेबल. सफल अस्थि प्रत्यारोपण दोनों की हड्डी और प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त मज्जा में CD45.1 या CD45.2 जीनोटाइप के परिवर्तन से परिभाषित किया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. N के साथ कोलन की अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद चूहों में बृहदांत्रशोथ का मूल्यांकन (ए) नमूना एच एंड ई छवियोंormal ऊतक विज्ञान और DSS बृहदांत्रशोथ. (बी) प्रोटोकॉल के स्कोर. DSS बृहदांत्रशोथ के सफल प्रेरण DSS उपचार के 5 दिन से ऊतक विज्ञान स्कोर उल्लेखनीय वृद्धि की पुष्टि की जा सकती है. अलग जीनोटाइप के लिए अस्थि मज्जा के आदान - प्रदान के बाद, ऊतक विज्ञान स्कोर काफी बदलना चाहिए. बृहदांत्रशोथ के जीन अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त की ब्याज से बदल पाठ्यक्रम से पता चलता है. डेटा मतलब ± का मतलब है की मानक त्रुटि से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.
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Discussion
यह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण दृष्टिकोण इम्यूनोलॉजी बृहदांत्रशोथ के अनुसंधान, संक्रमण, कैंसर, मोटापा और अन्य बीमारियों के लिए उपयुक्त है. यह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के प्रयोग की जरूरत है जब जीन की ब्याज दोनों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न और गैर अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं और जीन के हित के लिए या तो आबादी से कोशिकाओं द्वारा रोग मध्यस्थता संदेह है में व्यक्त किया जाता है. उदाहरण के लिए, रोगाणुरोधी पेप्टाइड cathelicidin तीव्र बृहदांत्रशोथ मिलाना दिखाया गया है. लेकिन यह दोनों उपकला कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे मैक्रोफेज रूप में) में व्यक्त किया जाता है. तो फिर हम अस्थि प्रत्यारोपण इस्तेमाल को परिभाषित करने के लिए कक्षों की आबादी है जो चूहों में तीव्र बृहदांत्रशोथ modulates. बृहदांत्रशोथ गंभीरता काफी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के माध्यम से अस्थि मज्जा cathelicidin जीनोटाइप के बदलाव के बाद बदल गया था. फिर हम निष्कर्ष है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त cathelicidin DSS के लिए प्रतिक्रिया में modulating तीव्र बृहदांत्रशोथ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.
अस्थि माRROW व्युत्पन्न कोशिकाओं आम तौर पर लाल रक्त कोशिकाओं, सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स शामिल हैं. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण इन कोशिकाओं को नहीं बल्कि दूसरों के जीनोटाइप बदलता है. बोल रहा हूँ, laterally इस प्रयोग केवल गैर अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं बनाम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं में जीन के ब्याज की भूमिका अंतर कर सकते हैं. लेकिन इस प्रयोग आगे जो अस्थि मज्जा की आबादी कोशिकाओं mediates सभी लाल रक्त कोशिकाओं, सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स के रूप में बृहदांत्रशोथ अस्थि मज्जा से प्राप्त कर रहे हैं व्युत्पन्न परिभाषित नहीं कर सकते. अस्थि मज्जा व्युत्पन्न बृहदांत्रशोथ दौरान कोलन के लिए चले गए कोशिकाओं के भाग्य अनुसंधान के एक सक्रिय और विवादास्पद क्षेत्र है. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण और murine बृहदांत्रशोथ के शामिल होने के बाद, यह संभावना है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के कुछ lymphoid कोशिकाओं और पेशीतंतुकोशिकाओं कोलन में 5 के रूप में मौजूद है. एक अन्य रिपोर्ट में सुझाव दिया है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं वसूली प्रक्रिया 6 में neovascularization के लिए endothelial पूर्वज कोशिकाओं के रूप में सेवा करते हैं. वहाँ भी evidencई दिखा अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं 7 बृहदांत्रशोथ के साथ रोगियों में उपकला सेल भेदभाव के साथ जुड़े रहे हैं. हम संभावना है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के कुछ विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना में अन्य कोशिकाओं को अलग और बृहदांत्रशोथ विकास में modulating भूमिका निभा सकते हैं बाहर नहीं कर सकते. फिर भी, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न आबादी / monocyte बृहतभक्षककोशिका रासायनिक प्रेरित colonic mucosal 8,9 क्षति के खिलाफ संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है. इस रिपोर्ट हमारा लग रहा है कि cathelicidin अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं से व्यक्त DSS बृहदांत्रशोथ modulates जबकि cathelicidin monocytes / मैक्रोफेज 4 से secreted है के साथ संगत है.
दूसरी ओर, अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण की सफलता को ट्रैक करने के लिए कई तरीके हैं. CD45.1 और CD45.2 जीनोटाइप के प्रवाह cytometry विश्लेषण का एक मात्रात्मक विधि प्राप्तकर्ता चूहों में दाता अस्थि मज्जा स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं का अनुपात निर्धारित प्रदान कर सकते हैं. अस्थि मज्जा सेल व्युत्पन्नएस 10 कोशिकाओं के कई प्रकार में अंतर कर सकते हैं. प्रवाह cytometry विश्लेषण संभव नहीं है, यह संभव है कि पुरुष (XY गुणसूत्र) दाता चूहों और महिला (XX गुणसूत्र) प्राप्तकर्ता 11 चूहों का उपयोग. दाता चूहों XX केवल महिला प्राप्तकर्ता चूहों के शरीर में अद्वितीय वाई क्रोमोसोम ले जाएगा. वाई गुणसूत्र स्वस्थानी संकरण 11 में फ्लोरोसेंट से पहचाना जा सकता है. इसके अलावा, CD45.2 CD45.1, और / या ऊतकों में जीन के ब्याज के immunohistochemistry दाता अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं कल्पना के लिए आवश्यक हो सकता है.
लेकिन CD45 प्रवाह cytometry और स्वस्थानी संकरण प्रक्रियाओं में वाई गुणसूत्र विश्लेषण आम तौर पर कर रहे हैं के बाद चूहों बलिदान किया गया. प्राप्तकर्ता चूहों का त्याग किए बिना कैंसर जैसे पुराने रोगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है चूहों में दाता कोशिकाओं के स्थान पर नजर रखने, यह संभव है कि दाता 12 चूहों के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग. इसलिए, दाता हड्डी मार्चक्षणिक संज्ञाहरण के तहत गैर इनवेसिव उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग के तहत प्राप्तकर्ता चूहों के शरीर में पंक्ति ली गई कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है और इस बार बार किया जा सकता है.
नहीं सभी चूहों सफल अस्थि मज्जा 13 प्रत्यारोपण है. हमने देखा ~ चूहों की 10-20% एनीमिया या संक्रमण की वजह से विकिरण के बाद पहले 2 हफ्तों में मर जाते हैं. इसलिए, जरूरत से ज्यादा चूहों को प्रयोग के शुरू में तैयार किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, आप प्रयोग के शुरू में समूह प्रति 10 चूहों को तैयार अगर आप समूह प्रति 8 चूहों कोलाइटिस प्रयोग के अंत में उपलब्ध की उम्मीद करना चाहिए. इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि आप संभव के रूप में मृत चूहे के रूप में जल्द ही दूर कर सकते हैं. प्रतिरक्षा पुनर्गठन की गति hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को अस्थि मज्जा में प्राप्तकर्ता 14 चूहों में संचार संख्या सहसंबद्ध है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है लाइव अस्थि मज्जा कोशिकाओं (1 x 10 माउस प्रति 7 कोशिकाओं) सफल अस्थि मज्जा tr के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में संचार के लिए पर्याप्त संख्याansplantation.
विकिरण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों उन्मुक्ति समझौता किया है. दाता चूहों विच्छेदन और अस्थि मज्जा तैयारी प्रक्रियाओं सेल संस्कृति प्रयोगों के रूप में एक ही मानक में किया जाना चाहिए. बाँझ उपकरणों और कंटेनरों के प्रयोग, सड़न रोकनेवाला हैंडलिंग तकनीक लागू किया जाना चाहिए. सभी प्रयोगों के दौरान, Pbs शामिल है 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 यू / मिलीलीटर हेपरिन हड्डी marrows की हैंडलिंग के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए. सभी अभिकर्मकों सेल संस्कृति ग्रेड. अतिरिक्त तकनीकी चर्चा 13 संदर्भ में पाया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम पायलट और केंद्र UCLA इलाज Crohn है और बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन अमेरिका कैरियर विकास पुरस्कार (2691 #) और स्वास्थ्य NIDDK K01 के राष्ट्रीय संस्थान (DK084256) के लिए धन माननीय वाई Koon से व्यवहार्यता अध्ययन अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
अस्थि मज्जा विकिरण आपरेशन बर्नार्ड लेविन और एड्स अनुसंधान माउस / मानव कल्पना कोर सुविधा के लिए UCLA केंद्र के स्कॉट रसोई द्वारा सहायता प्रदान की थी. प्रवाह cytometry आपरेशन UCLA वेक्टर कोर सुविधा द्वारा सहायता प्रदान की थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
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