Summary
Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.
Abstract
Para entender el papel de un gen en el desarrollo de colitis, se compararon las respuestas de los ratones de tipo salvaje y el gen de interés ratones knockout deficientes a colitis. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas del huésped, sin embargo, es posible diferenciar el papel de un gen de interés en células de médula ósea derivadas de médula y no óseo células derivadas mediante la técnica de trasplante de médula ósea. Para cambiar la médula ósea procedentes de células genotipo de los ratones, la médula ósea original de los ratones receptores fueron destruidas por irradiación y luego se sustituye por la nueva médula ósea del donante de genotipo diferente. Cuando de tipo salvaje ratones donantes de médula ósea se trasplantan a ratones knockout, se podría generar ratones knockout con la expresión del gen de tipo salvaje en células de médula ósea derivadas. Por otra parte, cuando los donantes ratones knockout médula ósea trasplantadas a ratones receptores de tipo salvaje, de tipo salvaje ratones sin el gen de interés expresarde la médula ósea células derivadas fueron producidos. Sin embargo, el trasplante de médula ósea puede no ser 100% completo. Por lo tanto, hemos utilizado cúmulo de diferenciación (CD) moléculas (CD45.1 y CD45.2) como marcadores de las células del donante y del receptor para realizar un seguimiento de la proporción de células de la médula ósea de un donante derivados en los ratones receptores y el éxito de los trasplantes de médula ósea. De tipo salvaje ratones con genotipo CD45.1 ratones knockout y con CD45.2 genotipo fueron utilizados. Después de la irradiación de ratones receptores, las células donantes de médula ósea de diferentes genotipos fueron infundidas en los ratones receptores. Cuando la nueva médula ósea regenerada para hacerse cargo de su inmunidad, los ratones se expusieron por agentes químicos (sulfato de dextrano sódico, DSS al 5%) para inducir la colitis. Aquí también mostró el método para inducir la colitis en ratones y evaluar la función del gen de interés expresado a partir de células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés a partir de las células óseas derivadas juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad (tal como Escherichiatis), el fenotipo de los ratones receptores con trasplante de médula ósea puede ser alterado de manera significativa. Al final de los experimentos de colitis, la médula ósea derivada células en la sangre y la médula ósea se marcaron con anticuerpos contra CD45.1 y CD45.2 y su proporción cuantitativa de la existencia podría ser usado para evaluar el éxito del transplante de médula ósea por citometría de flujo. Éxito del trasplante de médula ósea debe mostrar una gran mayoría de genotipo donante (en término de marcador molécula de CD) a lo largo genotipo receptor tanto en la médula ósea y la sangre de los ratones receptores.
Protocol
1. Antes-de-empezar Consideraciones técnicas
- Le recomendamos que use C57/BL6 ratones de tipo salvaje y ratones knockout para el experimento porque los ratones con moléculas de CD correspondientes pueden adquirirse de los proveedores más importantes del ratón.
- Puesto que es difícil realizar un seguimiento de los ratones de tipo salvaje y de ratones knockout derivados células del donante después del trasplante de médula ósea, es necesario utilizar CD45.1 ratones para representar ratones de tipo salvaje. (CD45.1 C57/SJL PESO ratones Jackson Laboratorios de stock # 002014).
- La mayoría de las colonias de ratones son CD45.2. Nuestros ratones knockout pertenecen a CD45.2 genotipo (o bien una fuente CD45.2 ratones WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La determinación de CD45.1 o CD45.2 genotipo se puede realizar mediante citometría de flujo de la médula ósea y la sangre periférica como se ha mencionado en la sección 7 de este protocolo.
- Los ratones después de la irradiación han puesto en peligro la inmunidad. Mantener los ratones en instalación libre de patógenos.
- Funcionamiento del irradiador requiere especial clearanc seguridade y formación. Para ahorrar tiempo en los procesos de formación y aprobación, lo mejor es colaborar con un laboratorio con personal cualificado que sea capaz de manejar el irradiador.
- Muchas instituciones cuentan con laboratorios de citometría de flujo con técnicos experimentados. Para minimizar los problemas de funcionamiento de citometría de flujo, es mejor discutir su plan de citometría de flujo experimentar con el técnico con experiencia antes de empezar.
- Los ratones fueron asignados de esta manera (10 ratones por grupo):
| Grupo | Donante de médula ósea para el destinatario | Tratamiento | |
| La | BM intercambio | CD45.1 WT KO CD45.2 | DSS colitis |
| B | Agua control normal | ||
| C | BM intercambio | CD45.2 KO a CD45.1 PESO | DSS colitis |
| D | Agua control normal | ||
| E | Falso | CD45.1 WT para CD45.1 PESO | DSS colitis |
| F | Agua control normal | ||
| G | Falso | CD45.2 KO KO a CD45.2 | DSS colitis |
| H | Agua control normal |
* Una breve ilustración del protocolo experimental se muestra en la figura 1.
2. Los ratones receptores irradiación
- Los ratones son criados y mantenidos en instalaciones libres de patógenos. Coloque los ratones en pie irradiación autoclave con filtro. Coloque un ratón en cada ranura de pastel de irradiación. Coloque el pastel en el irradiador y asegúrese de que el plato giratorio y el pastel está dando vuelta.
- Encienda la bomba de airepara la ventilación. Cierre la puerta del irradiador y bloquearlo.
- Irradiar a los ratones con 1.000 rad (que es equivalente a 10 Gy) alrededor de 10 min (dependiendo de la fuente de radiación y la vida media-). Desde este punto de tiempo, los ratones irradiados son inmunodeficientes y tienen inmunidad débil contra la infección. Después de la irradiación, tomar la tarta y colocar en un recipiente estéril para transportarlo al gabinete de bioseguridad en las instalaciones de los animales. Evite la exposición de los ratones con el medio ambiente externo para minimizar las posibilidades de infección.
- En gabinete de bioseguridad, la transferencia a las jaulas de los ratones del ratón autoclave autoclave con ropa de cama (4 ratones por jaula Agregue agua estéril nueva suspensión Sulfatrim -. 3,12 ml por 100 ml de agua).
- Envuelva la botella de agua con papel de aluminio, como los antibióticos son sensibles a la luz. Agitar para mezclar la botella de solución Sulfatrim bien antes de cargarlo a la jaula.
3. Donantes de Médula Ósea de extracción
- Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurmiento y luego sumergir en solución 1:200 Lysol. Rocíe los ratones con 70% de etanol para humedecer la piel y diseccionar huesos abiertos.
- Remojar los instrumentos de disección en 70% de etanol para la esterilización.
- Realizar la disección en un gabinete de bioseguridad. Utilizar los instrumentos de disección estéril para exponer el húmero, el fémur, la tibia y el peroné huesos, libre de fijación de los músculos y ligamentos.
- Cortar abrir ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Mantenga los huesos con fórceps. Lavar la médula ósea roja con PBS frío con jeringa de 3 ml y agujas de 25G a una placa de Petri. Enjuague de ambos extremos de los huesos para producir células de la médula ósea más.
- Use 6 ml jeringas y agujas 18G1 / 2 a romper los tapones rojos de médula ósea por aspiración repetida y expulsión. Transferencia de médula ósea con 50 ml tubos Falcon.
- Girar la médula ósea en 1.800 rpm durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento por agitación durante 5-10 segundos.
- Diluir el tampón de lisis de RBC 10 veces con agua estéril. Anunciod 1X tampón de lisis RBC (5 ml por ratón donante) y agitar de nuevo durante 5 segundos y mantener exactamente 3 minutos a temperatura ambiente.
- Después de 3 min, llenar los tubos con 20 ml de PBS frío para detener la lisis y mezclar. Verter el contenido a través de un filtro de células 40 micras directamente en un nuevo tubo Falcon de 50 ml.
- Enjuague los tubos originales con 5 ml de PBS y transferir a filtro de células así. Completar hasta 50 ml con PBS y mezclar.
4. Contando Bone Marrow Donor células
- Añadir 100 l de azul de tripano a un tubo Eppendorf y 100 l de suspensión de médula ósea a un tubo Eppendorf y se mezcla. Pipetear la mezcla de células teñidas con un hemocitómetro.
- La cantidad de células se calcula por recuento total de células de médula ósea de estar en los tubos Falcon = número de células sin teñir en 16 cuadrados x 2 (debido a la dilución Trypan azul) x 10.000 x 50 ml
- Decantar las células de médula ósea en 50 ml en tubos Falcon de 2.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante. Basadoen el total de células, se resuspende el pellet con PBS a 1 x 10 8 células por ml
5. Infusión a ratones receptores
- Calentar los ratones receptores sobre una almohadilla de calor y bajo una lámpara de calentamiento. Ponga los ratones receptores de inmovilización. Inyectar 1 x 10 7 células por ratón en 100-200 l por vía intravenosa.
- La inyección de médula ósea de un donante se debe hacer entre 4-24 horas después de la irradiación.
- Manténgase 4 ratones inyectados por jaula. Mantener los ratones receptores inyectados en jaulas autoclave con agua tratada con antibióticos durante las primeras 4 semanas en las instalaciones patógeno animal libre y dejar que los ratones recuperar la inmunidad. Cambio jaulas, tratado con antibióticos en aguas y alimentos cada 4 días para mantener la higiene.
6. La inducción de la colitis y la evaluación de la colitis
- 4 semanas después del trasplante de médula ósea y la irradiación, cambiar a agua normal sin antibióticos y mantener los ratones durante 2 semanas más para recuperar su normalidadla microflora intestinal.
- 6 semanas después de la inyección de médula ósea, medir el peso corporal inicial. Algunos ratones se les da 5% de sulfato de dextrano en beber agua ad libitum para inducir la colitis. Algunos ratones se les da agua potable regular sólo como grupos de control normales.
- 5 días después, extraer sangre periférica, traslado a tubos recubiertos de heparina (Vacutainer) y mantener en hielo. Piscina de la sangre de los ratones 4 a 1 metro. Combine 300 l de sangre con 300 l de buffer de tinción celular = 600 l. Divida la sangre a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l.
- Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurano. Evaluar resultados macroscópicos daños (por favor refiérase a otra publicación vídeo JOVE para obtener más información 1). Medir el cambio de peso corporal. Medir la longitud del intestino grueso y con calibrador digital. Observe textura heces (dura, blanda o con sangre). Determinar sangre oculta en las heces con Hemooccult. Disecciona tejidos de colon y fijar en formol para H & E tinción.
- Disecciona un fémur bone por ratón, se extrae médula ósea y enjuagar la médula ósea con PBS frío a través de aguja 25G y una jeringa de 1 ml. De 4 estrella médula ósea se conecta a un tubo y mantener en hielo.
- Verter la médula ósea a una placa de Petri, la cizalladura del tapón de médula ósea con aguja 18G y 5 ml jeringa varias veces hasta que no enchufe médula ósea está presente.
- Decantar con 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Remover el sobrenadante y resuspender con 600 l tampón de tinción celular. Divida la médula ósea se resuspendieron a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l.
7. Inspección de Calidad de Trasplante de Médula Ósea por citometría de flujo
- Etiquete cada tubo de muestra de sangre o de médula ósea # 1-5:
- Preparar la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad.
# 1 No anticuerpo
# 2 30 l control de isotipo FITC + 30 mu l PE control de isotipo + 15 mu l CD16/32 bloqueo
# 3 30 l FITC CD45.1 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo
# 4 30 l PECD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo
# 5 30 l FITC CD45.1 Ab + 30 l PE CD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo
| Añadir a nada muestra de sangre o de médula ósea # 1 |
| Añadir 5 l de mezcla de anticuerpos # 2 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 2 |
| Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 3 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 3 |
| Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 4 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 4 |
| Añadir 5 l de mezcla de anticuerpo n º 5 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 5 |
- Mantener en la oscuridad en hielo durante 30 min.
- Añadir 2 ml de tampón de lisis 1X RBC a cada tubo. Mantener en la oscuridad en hielo durante 15 min.
- Decantar las células a 1.500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Remover el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 500 l tampón de tinción de las células en la oscuridad brevemente, a continuación, vórtice. Ver el CD45.1 (representando WT) y CD45.2 (representando KO) en la sangre inmunoteñida y muestras de médula ósea por citometría de flujo. Seleccione FITC para representar PESO CD45.1 y PE para representar KO CD45.2.
- Analizar los resultados de la citometría de flujo por software FlowJo. Calcular la relación de FITC: PE o PE relación: relación de FITC para determinar si el genotipo donante es el genotipo predominante en la sangre y la médula ósea.
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Representative Results
Si el gen de interés desempeña un papel significativo en las células inmunes durante el desarrollo de la colitis, los ratones que recibieron médula ósea de genotipo diferente a través de trasplante de médula ósea (WT a KO o KO a WT) debería tener una respuesta alterada a la colitis DSS. Uno de los parámetros más importantes para la determinación de la gravedad de la colitis es la tinción H & E de los tejidos de colon. Colon cambios en la estructura de tejido y los signos de la inflamación pueden evaluar cuantitativamente por H & E sistema de puntuación histología. Criterios para H & E histología de puntuación para el modelo colitis DSS puede encontrar aquí 2. Alternativamente, química colitis inducida también puede ser inducida por ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS). Los métodos de inducción de la colitis TNBS y H & E criterios de puntuación histológicos se puede encontrar en una publicación anterior 3. Diferencia Histología puntuación entre los grupos pueden ser analizados por la t de Student pruebas.
Los ratones pueden tener significativamentemejorado o empeorado colitis en comparación con ratones con sham trasplante de médula ósea (WT a WT o KO a KO). Si el gen de interés desempeña un papel significativo en la colitis a través de células de médula ósea derivados, los ratones con médula ósea intercambiada debe responder significativamente diferente de los ratones con transplante de médula ósea simulada.
Para el modelo de colitis DSS, el cambio histología puede ser evaluado mediante puntuación histología (véase la Figura 4). Cambio significativo de valor histológico puede indicar el desarrollo de la colitis mediada por el gen de interés en células de médula ósea derivadas. Por ejemplo, catelicidina es un gen del péptido antimicrobiano y antiinflamatorio-(gen de interés en nuestro caso) 4. Sin el trasplante de médula ósea, catelicidina ratones KO desarrollado generalmente peor colitis de tipo salvaje ratones hizo en respuesta a DSS. La transfusión de tipo salvaje médula ósea (WT) para cathelicidin nocaut (KO) ratones conduce a la colitis mejorado mientras transfusien la médula ósea de catelicidina knockout (KO) ratones a los ratones de tipo salvaje (WT) conduce a la colitis empeoró cuando se expone a DSS (Figura 2).
Para verificar la expresión del gen de interés, la expresión de ARNm del gen de interés (p. ej. Catelicidina) de la médula ósea del donante de tipo salvaje debe ser detectable en el colon (o de otro tipo) los tejidos de la catelicidina ratones knockout deficientes en receptores después de hueso trasplante de médula. También es interesante saber si la expresión del gen de interés en los ratones receptores de tipo salvaje se reduce después de la donación de médula ósea ratones knockout.
Éxito del injerto de médula ósea del donante se representa por la relación dominante de donante isotipo CD sobre destinatario isotipo CD tanto en las células de sangre periférica y la médula ósea de los ratones receptores. La médula ósea muestra mejor etiquetado de CD45.1 y CD45.2 en citometría de flujo como sangre, tiene una gran cantidad de células no teñidas (Figura 2 y 3).
Figura 1. El protocolo experimental de trasplante de médula ósea.
Figura 2. Datos de citometría de flujo de la médula ósea de ratones receptores después del trasplante de médula ósea. El eje Y muestra marcado con FITC CD45.1 señal y el eje X muestra marcado con PE CD45.2 señal. Exitoso trasplante de médula se define por el cambio de CD45.1 o CD45.2 genotipo en la médula ósea y sangre de los ratones receptores. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Datos de citometría de flujo de sangre de los ratones receptores después del trasplante de médula ósea. El eje Y muestra marcado con FITC CD45.1 señal y el eje X muestra marcado con PE CD45.2 señal. Exitoso trasplante de médula se define por el cambio de CD45.1 o CD45.2 genotipo en la médula ósea y sangre de los ratones receptores. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 4. Evaluación de la colitis en ratones después de trasplante de médula ósea. (A) Muestra H & E imágenes de dos puntos con normal histología y la colitis DSS. (B) resultados histológicos. Éxito en la inducción de la colitis DSS se puede confirmar por un aumento significativo de la puntuación de la histología por día 5 de tratamiento con DSS. Tras el intercambio de médula ósea para el genotipo diferente, el valor histológico debería cambiar significativamente. Esto sugiere el curso de la colitis alterado por el gen de interés expresa en las células de médula ósea derivadas. Los datos se representan por medio ± error estándar de las medias.
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Discussion
Este enfoque trasplante de médula ósea es adecuado para la investigación de la inmunología colitis, infección, cáncer, obesidad y otras enfermedades. Este experimento de trasplante de médula ósea es necesaria cuando el gen de interés se expresa en tanto derivadas de médula ósea y no células de la médula ósea derivados y el gen de interés se sospecha para mediar la enfermedad por células de cualquiera de la población. Por ejemplo, péptido antimicrobiano de catelicidina está demostrado que modulan la colitis aguda. Pero se expresa tanto en las células epiteliales y las células inmunitarias (tales como macrófagos). Luego se utilizó el trasplante de médula para definir qué población de células modula colitis aguda en ratones. La gravedad de la colitis se modificó significativamente después del cambio de médula ósea genotipos catelicidina a través de trasplante de médula ósea. Entonces, podemos concluir que catelicidina expresado en células de médula ósea derivadas juega un papel importante en la modulación de la colitis aguda en respuesta a DSS.
Bone marrow células derivadas típicamente incluyen glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Trasplante de médula ósea cambia el genotipo de estas células pero no en otras. Lateralmente hablando, este experimento sólo se puede diferenciar el papel del gen de interés en células de médula ósea derivadas frente a células no derivadas de la médula ósea. Pero este experimento no puede definir además que la población de médula ósea derivada media células se derivan de la colitis como todas las células rojas de la sangre, glóbulos blancos y plaquetas de la médula ósea. El destino de las células derivadas de médula ósea emigraron a dos puntos durante colitis es un área activa de investigación y polémica. Después de un trasplante de médula ósea y la inducción de la colitis murina, es probable que algunos de células de médula ósea derivados existen como células linfoides y miofibroblastos en el colon 5. Otro informe sugirió que las células derivadas de médula ósea servir como células progenitoras endoteliales de la neovascularización en proceso de recuperación 6. También hay evidencE mostrando células derivadas de médula ósea se asocia con diferenciación de células epiteliales en pacientes con colitis 7. No podemos excluir la posibilidad de que algunas de las células derivadas de médula ósea pueden diferenciarse a células que no sean típicas de las células inmunes y desempeñan un papel en el desarrollo de moduladores colitis. Sin embargo, la médula ósea derivada de monocitos / macrófagos población es importante para la protección contra la química inducida por daño de la mucosa colónica 8,9. Este informe es consistente con nuestra conclusión de que cathelicidin expresa a partir de células de la médula ósea derivados modula la colitis DSS mientras cathelicidin es secretada por monocitos / macrófagos 4.
Por otra parte, hay muchas maneras de controlar el éxito de los trasplantes de médula ósea. El análisis de citometría de flujo de CD45.1 y CD45.2 genotipos pueden proporcionar un método cuantitativo para determinar la proporción de células de médula ósea de donantes de células madre derivadas de los ratones receptores. Médula ósea procedentes de célulass pueden diferenciarse en múltiples tipos de células 10. Cuando el análisis de citometría de flujo no es factible, es posible utilizar macho (XY cromosoma) de ratones donantes y hembra (cromosoma XX) ratones receptores 11. Los ratones donantes se llevan cromosomas únicos Y en el cuerpo de los ratones receptores XX sólo hembra. Cromosoma Y puede ser identificado por hibridación fluorescente in situ 11. Además, la inmunohistoquímica de CD45.1, CD45.2 y / o el gen de interés en los tejidos puede ser necesaria para visualizar las células donantes de médula ósea derivados.
Pero CD45 análisis de citometría de flujo y cromosoma Y en procedimientos de hibridación in situ se realiza después de que los ratones fueron sacrificados. Para controlar la ubicación de las células donantes en los ratones receptores que se utilizan para estudiar las enfermedades crónicas como el cáncer, sin sacrificar los ratones, es posible utilizar verdes ratones transgénicos proteínas fluorescentes como 12 ratones donantes. Por lo tanto, el hueso de donante estropearceldas de fila derivados pueden ser rastreados en el cuerpo de los ratones receptores bajo no invasiva de imágenes de alta resolución óptica bajo anestesia transitoria y esto se puede hacer varias veces.
No todos los ratones tienen éxito trasplante de médula ósea 13. Hemos observado ~ 10-20% de los ratones mueren en las primeras 2 semanas después de la irradiación debido a la anemia o infección. Por lo tanto, más ratones de los necesarios deben estar preparados en el comienzo del experimento. Por ejemplo, se debe preparar 10 ratones por grupo en el inicio del experimento si espera 8 ratones por grupo disponible al final del experimento colitis. También, asegúrese de eliminar los ratones muertos tan pronto como sea posible. La velocidad de reconstitución inmune se correlaciona con el número de células madre hematopoyéticas en la médula ósea infundidas en los 14 ratones receptores. Por lo tanto, es crucial tener un número suficiente de células vivas de médula ósea (1 x 10 7 células por ratón) infundidas en ratones receptores para tr éxito médula óseaansplantation.
Los ratones receptores después de la irradiación han puesto en peligro la inmunidad. Donantes de disección ratones y los procedimientos de preparación de la médula ósea se debe hacer en el mismo nivel que los experimentos de cultivo celular. El uso de instrumentos estériles y contenedores, técnicas asépticas de manipulación deberán ser aplicadas. A lo largo de todos los experimentos, PBS contiene 1% de penicilina-estreptomicina y 10 U de heparina / ml debe utilizarse durante la manipulación de médulas óseas. Todos los reactivos son de grado de cultivo celular. Discusión técnica adicional se puede encontrar en la referencia 13.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el piloto y la subvención Estudio de Viabilidad de la UCLA-CURE Center, la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America Award de Desarrollo Profesional (# 2691) y el Instituto Nacional de Salud NIDDK K01 (DK084256) la financiación a Hon Wai Koon.
La médula ósea operación irradiación fue asistido por Bernard Levin y Cocina Scott de UCLA Center for AIDS Research Mouse / instalaciones Humanos Core Chimera. Operación de citometría de flujo fue asistido por instalaciones UCLA Core Vector.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
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