Summary
Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.
Abstract
Kolit gelişimi arasında bir genin rolünü anlamak için, wild-tip farelerden ve kolit gen-faiz eksik nakavt fareler yanıtları karşılaştırıldı. Gen-of-ilgi kemik iliğinden elde edilen ve konak hücreleri olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, fakat kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliği içinde bir ilgi geninin rol ayırt etmek mümkündür kemik iliği nakli tekniği ile elde edilen kök hücrelerin. Farelerin kemik iliği kaynaklı hücre genotipi değiştirmek için, alıcı fareler orijinal kemik iliği radyasyon tarafından tahrip ve daha sonra farklı genotip yeni donör kemik iliği tarafından değiştirildi. Wild-tip farelerden donör kemik iliği knockout farelerde transplante edildiğinde, kemik iliğinden elde edilen hücreleri vahşi tip gen ekspresyonu ile nakavt fareler yaratacaktır. Alternatif olarak, ne zaman nakavt fareler donör kemik iliği gen-faiz ifade vermeden yabani tip alıcı fareler, yabani tip farelere nakledildiKemik iliği kaynaklı hücre üretilmiştir. Bununla birlikte, kemik iliği nakli,% 100 eksik olabilir. Bu nedenle, alıcı fareler ve kemik iliği nakli başarı donör kemik iliğinden elde hücrelerinin oranını izlemek için verici ve alıcı hücre belirteçleri olarak farklılaşma (CD) moleküllerinin kümelenme (CD45.1 ve CD45.2) kullanılmıştır. CD45.2 genotipi ile CD45.1 genotip ve nakavt fareler Wild-tip fareler kullanılmaktadır. Alıcı fareler ışınlanması sonra, farklı genotiplerin donör kemik iliği hücreleri alıcı fareler infüze edildi. Yeni kemik iliği onun dokunulmazlığını devralmaya rejenere zaman, farelerin kolit oluşturulan kimyasal ajan (dekstran sodyum sülfat, DSS% 5) tarafından itiraz edildi. İşte biz de farelerde kolit oluşturulan ve kemik iliğinden elde edilen hücrelerden eksprese ilgilenilen genin rolünü değerlendirmek için yöntem gösterdi. Kemik türetilmiş hücrelerden gen-of-ilgi hastalığının gelişmesinde önemli bir rol (örneğin coli gibi yürütülürsetis), kemik iliği nakli ile alıcı farelerin fenotipi önemli ölçüde değiştirilebilir. Kolit deneyler sonunda, kemik iliği kan ve kemik iliği hücreleri CD45.1 ve CD45.2 karşı antikorlar ile etiketlenmiş edildi ve varoluş nicel oranı flow sitometri ile kemik iliği nakli başarısını değerlendirmek için kullanılan olabilir türetilmiştir. Başarılı kemik iliği nakli alıcı farelerin kemik iliği ve kan hem de alıcı genotip üzerinde donör genotipi (CD molekülünün marker vadede) büyük bir çoğunluğu göstermelidir.
Protocol
1. Önce-sen-start Teknik Hususlar
- Ilgili CD molekülleri ile farelerin büyük fare satıcılardan satın alınabilir çünkü deney için C57/BL6 wild-tip farelerden ve nakavt fareler hem kullanmanızı öneririz.
- Bunu wild-tip farelerden ve kemik iliği transplantasyonu sonrası donör hücreleri türetilmiş nakavt fareler izlemek zor olduğundan, wild-tip farelerden temsil CD45.1 fareler kullanmak gereklidir. (CD45.1 C57/SJL WT farelerde Jackson Laboratuvarları stok # 002014).
- En çok fare koloniler CD45.2 vardır. Bizim knockout farelerde CD45.2 genotipi (: Jackson Laboratuvarları stok # 000664 alternatif bir CD45.2 WT farelerde kaynağı) aittir. CD45.1 veya CD45.2 genotip tayini bu protokolde 7. bölümünde belirtildiği gibi kemik iliği ve periferik kan akım sitometri kullanılarak yapılabilir.
- Işınlama sonrasında Fare bağışıklık tehlikeye. Patojen free özelliği fareler tutun.
- Işınlayıcı Operasyonu özel güvenlik clearanc gerektirire ve eğitim. Eğitim ve onay süreçlerinde zamandan tasarruf etmek için, bu ışınlayıcı çalisabilir kalifiye bir teknisyen ile bir laboratuar ile işbirliği için en iyisidir.
- Birçok kurum deneyimli teknisyenler ile akım sitometri laboratuvarları vardır. Akım sitometri işlemi ile ilgili sorunları en aza indirmek için, başlamadan önce deneyimli teknisyen ile akım sitometri deneme planı tartışmak daha iyidir.
- Fare bu şekilde (grup başına 10 fare) ayrıldılar:
| Grup | Alıcıya Kemik iliği donör | Tedavi | |
| A | BM döviz | CD45.1 WT CD45.2 KO | DSS kolit |
| B | Su normal kontrol | ||
| C | BM döviz | CD45.1 WT CD45.2 KO | DSS kolit |
| D | Su normal kontrol | ||
| E | Sahte | CD45.1 WT CD45.1 WT | DSS kolit |
| F | Su normal kontrol | ||
| G | Sahte | CD45.2 KO CD45.2 KO | DSS kolit |
| H | Su normal kontrol |
Deneysel protokol * Bir kısa açıklama Şekil 1 'de gösterilmiştir.
2. Alıcı Fare Işınlama
- Fare yetiştirilen ve patojen-free özelliği tutulur. Filtre ile otoklavlanmış ışınlama pasta koyun fareler. Işınlama pasta her yuvaya bir fare yerleştirin. Işınlayıcı içine pasta yerleştirin ve pikap ve pasta dönüm emin olun.
- Hava pompasını açınhavalandırma için. Işınlayıcı kapağını kapatın ve kilitleyin.
- 10 dk (radyasyon kaynağı ve yarılanma ömrü bağlı olarak) yaklaşık 1,000 rad (10 Gy eşdeğer) sahip fareler ışın. Bu sefer noktadan itibaren, ışınlanmış farelerde immün yetmezlikli ve enfeksiyona karşı zayıf dokunulmazlığım var. Radyasyon sonrası, pasta almak ve hayvan tesis biyogüvenlik kabini ulaşım için steril bir kap içinde yerleştirin. Enfeksiyon riskini en aza indirmek için dış ortama farelerin maruz bırakmaktan kaçının.
- Biyogüvenlik kabini içinde, otoklava yatak (. - 100 ml su başına 3.12 ml kafes başına 4 fare sulfatrim süspansiyon ile yeni steril su ekleyin) ile otoklavlanmış fare kafesleri içine fare aktarın.
- Antibiyotikler ışığa duyarlı olarak alüminyum folyo ile su şişesi sarın. Kafesine yerleştirmeden önce iyice sulfatrim solüsyonu şişesi karıştırmak için sallayın.
3. Donör Kemik İliği Ekstraksiyon
- Karbon dioksit ya da isoflur ile fareler kurban edinmesafeler ve 1:200 Lysol çözeltisi daha sonra batırmayın. Deri ıslak ve açık kemikleri incelemek için% 70 etanol ile farelerin püskürtün.
- Sterilizasyon için% 70 etanol içinde diseksiyon aletleri bekletin.
- Bir biyogüvenlik kabine diseksiyon gerçekleştirin. Kaslar ve bağlar ekleme ücretsiz humerus, femur, tibia ve fibula kemikleri açığa çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın.
- Kırmızı kemik iliği göstermek için kemiklerin iki ucu açık kesin. Forseps ile kemikleri tutun. Bir Petri kabı 3 ml şırınga ve 25G iğne ile soğuk PBS ile kırmızı kemik iliği çalkalayın. Daha fazla kemik iliği hücreleri elde etmek için kemik her iki ucundan yıkayın.
- Tekrarlanan aspirasyon ve ejeksiyon tarafından kırmızı kemik iliği fişleri kırmak için 6 ml şırınga ve 18G1 / 2 iğne kullanın. 50 ml Falcon tüpleri ile kemik iliği aktarın.
- 5 dakika 4 ° C için 1,800 rpm kemik iliği aşağı Spin 5-10 sn vorteks süpernatant, tekrar süspansiyon pelet atın.
- Steril su ile 10X RBC lizis tamponu ile seyreltilir. Iland 1X RBC lizis tamponu (donör fare başına 5 mi), 5 saniye süreyle yeniden girdap ve oda sıcaklığında tam olarak 3 dakika tut.
- 3 dakika sonra, lizis ve karışım durdurmak için 20 ml soğuk PBS ile boru doldurun. Doğrudan yeni bir 50 ml Falcon tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden içerik dökün.
- 5 ml PBS ile durulayın ve orijinal tüpler gibi bir hücre süzgecinden transfer. PBS ve karışımı ile 50 ml kadar ekleyiniz.
4. Kemik İliği Donör Hücreleri Sayma
- Bir Eppendorf tüp ve bir Eppendorf tüp ve karıştırmak için kemik iliği süspansiyon 100 ul Tripan mavisi 100 ul ekleyin. Hemasitometre için lekeli hücre karışımı pipet.
- Hücrelerin miktarı Falcon tüpleri içinde toplam canlı kemik iliği hücre sayısı = boyanmamış hücre sayısı 16 kareler x 2 (Tripan mavi seyreltme bağlı olarak) x 10,000 x 50 ml hesaplanır
- 5 dakika 4 ° C için 2,000 rpm'de 50 ml Falcon tüpleri içinde kemik iliği hücreleri aşağı Spin
- Süpernatantı. Merkezlitoplam hücre sayıları, ml başına 1 x 10 8 hücre PBS ile pelet tekrar süspansiyon
5. Alıcı Fare için İnfüzyon
- Bir ısı pedi ve bir ısınma lamba altında alıcı fareler ısıtın. Süzgeç, alıcı fareler koyun. Intravenöz 100-200 ul fare başına 1 x 10 7 hücre enjekte edilir.
- Donör kemik iliği enjeksiyonu ışınlama sonrasında 4-24 saatleri arasında yapılmalıdır.
- Kafes başına 4 enjekte edilmiş farelere kadar tutun. Patojen ücretsiz hayvan tesisi ilk 4 hafta boyunca antibiyotik ile tedavi edilen su ile otoklava kafeslerde enjekte alıcı fareler Bakım ve farelerin bağışıklık kazanmak izin. Değişim kafesleri, antibiyotik ile tedavi edilen su ve gıda her 4 günde bir hijyen sağlamak için.
6. Kolit Kolit ve Değerlendirme İndüksiyon
- 4 hafta radyoterapi ve kemik iliği nakli sonrası, normal yeniden antibiyotik vermeden düzenli su geçiş ve 2 hafta daha farelerin korumakmikroflora gut.
- 6 hafta kemik iliği enjeksiyonu sonrası, başlangıç vücut ağırlığı ölçmek. Bazı farelerde kolit indüklemek için su ad libitum içme içinde% 5 dekstran sülfat verilmiştir. Bazı fareler sadece normal kontrol grubu olarak normal içme suyu verilir.
- 5 gün sonra, periferik kan geri heparin kaplı borular (Vacutainer) aktarmak ve buz tutmak. 1 tüp 4 farelerden alınan kan Sandalye. Hücre boyama tampon = 600 ul 300 ul kan 300 ul birleştirin. 100 ul 5 Eppendorf tüpleri, her kan bölün.
- Karbon dioksit ya da izofluran ile fareler kurban edin. Makroskopik hasar skorları (ayrıntılar için 1 için başka JOVE video yayın bakınız) değerlendirin. Vücut ağırlığı değişimi ölçün. Dijital kumpas ile ölçün barsak uzunluğu ve kalınlığı. Dışkı dokusu (sert, yumuşak veya kanlı) gözlemleyin. Hemooccult ile dışkıda gizli kan belirleyin. Kolon dokularında inceleyin ve H & E boyama için formalin düzeltin.
- 1 femur bo teşrihne başı fare kemik iliği ayıklamak ve 25G iğne ve 1 ml şırınga ile soğuk PBS ile kemik iliği yıkayın. Havuz 4 kemik iliği 1 tüp takılır ve buz tutmak.
- Hiçbir kemik iliği fişi kalkıncaya kadar Petri, makaslama 18G iğne ve 5 ml şırınga ile birkaç kez kemik iliği fişine kemik iliği dökün.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 devir ile aşağı Spin Süpernatant ve 600 ul hücre boyama tamponu ile tekrar süspansiyon çıkarın. 100 ul 5 Eppendorf tüpleri, her yeniden süspanse kemik iliği bölün.
7. Akış sitometri yöntemi ile Kemik İliği Transplantasyonu Kalite Kontrol
- Kan veya kemik iliği # 1-5 her numune tüpleri Etiket:
- Karanlık olarak her bir ilgili tüp için antikor karışım hazırlayın.
# 1 Hayır antikoru
# 2 30 ul FITC izotip kontrol + 30 ul PE izotip kontrol + 15 ul CD16/32 engelleme
# 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme
# 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme
# 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme
| Kan veya kemik iliği örneği # 1 şey ekle |
| Her kan veya kemik iliği örneği # 2 antikor karışımı arasında 2. 5 ul ekleyin |
| Her kan veya kemik iliği örneği # 3 antikor karışımı 3. 3 ul ekleyin |
| Her kan veya kemik iliği örneği # 4 antikor karışımı 4. 3 ul ekleyin |
| Her kan veya kemik iliği örneği # 5 antikor karışımı # 5 5 ul ekleyin |
- 30 dakika buz içinde karanlıkta saklayın.
- Her tüpe 2 ml 1X eritrosit lizis tamponu ekleyin. 15 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta saklayın.
- 5 dakika 4 ° C'de 1,500 rpm'de hücreleri aşağı Spin (GH 3.8 rotor 1.500 rpm = 350 xg) Süpernatantı. Koyu, daha sonra girdaplı kısa bir süre içinde 500 ul hücre boyama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin. Flow sitometri ile immunohistokimyasal kan ve kemik iliği örneklerinde CD45.1 (WT temsilen) ve CD45.2 (KO temsilen) kontrol edin. KO CD45.2 temsil WT CD45.1 ve PE temsil FITC seçin.
- FlowJo yazılım tarafından flow sitometri sonuçları analiz edin. PE oranı veya PE: FITC oranını hesaplayın FITC oranı donör genotipi kan ve kemik iliğinde baskın genotip olup olmadığını belirlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gen-faiz kolit gelişimi sırasında bağışıklık hücrelerinin önemli bir rol oynarsa, farelerin kemik iliği transplantasyonu (WT KO veya WT KO) aracılığıyla farklı genotip kemik iliği alma DSS kolit değiştirilmiş bir yanıtı olmalıdır. Kolit şiddetini belirleyen en önemli parametrelerden biri kolon dokularında H & E boyama olduğunu. Kolon doku yapısı değişiklikleri ve inflamasyon belirtileri kantitatif H & E histolojisi skorlama sistemi ile değerlendirilebilir. H & DSS kolit modeli için E histoloji puanlama ölçütleri burada 2 bulunabilir. Alternatif olarak, kimyasal indüklenen kolit da trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS) ile indüklenebilir. TNBS kolit indüksiyonu ve H & E histoloji puanlama kriterleri Yöntemleri önceki bir yayında 3 bulunabilir. Gruplar arasındaki Histoloji skor farkı öğrenci t-testi ile analiz edilebilir.
Farelerde önemli ölçüde olabiliriyileştirilemez veya sham kemik iliği nakli (KO WT veya KO WT) ile farelere kıyasla kolit kötüleşti. Gen-faiz kemik iliğinden elde edilen hücreler yoluyla kolit önemli bir rol oynar varsa, değiş tokuş kemik iliği ile farelerin sham kemik iliği nakli ile farelerde anlamlı olarak farklı yanıt vermelidir.
DSS kolit modeli için, histoloji değişimi (bkz. Şekil 4) histoloji skorlama ile değerlendirilebilir. Histolojik skoru önemli bir değişiklik kemik iliğinden elde edilen hücrelerinde gen-of-ilgi aracılı kolitin gelişimi gösterebilir. Örneğin, katelisidin bir anti-mikrobik ve anti-inflamatuar peptid gen (burada gen-of-çıkar) 4'tür. Kemik iliği nakli olmadan, cathelicidin KO fareler genellikle wild-tip farelerden DSS yanıt olarak yaptım daha kötü kolit geliştirdi. Cathelicidin nakavt (KO) farelerde yabani tip (WT) kemik iliği nakli döküntü kolite neden olurken transfusiDSS (Şekil 2) maruz kaldıklarında cathelicidin nakavt kemik iliği (KO) (WT) wild-tip fareler fareler üzerinde kötüleşti kolite yol açar.
Gen-of-ilgi ifade doğrulamak için, verici yabani-tip kemik iliğinden gen-of-ilgi mRNA ifadesi (örneğin,. Katelisidin), kemik sonra katelisidin eksik nakavt alıcı farelerde kolon (veya diğer) dokularda tespit edilememiş iliği transplantasyonu. Ayrıca yabani tip alıcı farelere gen-faiz ifade knockout farelerde kemik iliği bağışı sonrasında azalır olup olmadığını bilmek ilginç.
Donor kemik iliği başarılı bir şekilde uyumunu periferik kan hücrelerini ve alıcı farelerde kemik iliği hem de alıcı CD izotip fazla verici CD izotipinin baskın oran ile ifade edilir. Kemik iliğinde kan hücrelerini boyanmamış (Şekil 2 ve 3) bir sürü var olarak en iyi flow sitometri de CD45.1 ve CD45.2 etiketlenmesi gösterir.
Şekil 1. Kemik iliği nakli deneysel protokol.
Şekil 2. Kemik iliği transplantasyonu sonrası alıcı farelere kemik iliği Flow sitometri veri. Y-ekseni CD45.1 sinyal ve X-ekseni CD45.2 sinyal PE-etiketli gösterir FITC-etiketli gösterir. Başarılı kemik nakli alıcı farelerin kemik iliği ve kan hem de CD45.1 veya CD45.2 genotip değişikliği ile tanımlanır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Kemik iliği transplantasyonundan sonra alıcı farelerde kan akış sitometrik veriler. Y-ekseni CD45.1 sinyali ve X-ekseni CD45.2 sinyal PE-etiketli göstermektedir FITC-etiketli göstermektedir. Başarılı kemik nakli alıcı farelerin kemik iliği ve kan hem de CD45.1 veya CD45.2 genotip değişikliği ile tanımlanır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. N kolonların kemik iliği transplantasyonu sonrası farelerde kolit Değerlendirilmesi. (A) Örnek H & E görüntüleriormal histoloji ve DSS kolit. (B) Histoloji puanları. DSS kolit başarılı indüksiyon DSS tedavi günde 5 ile histoloji skoru anlamlı artış ile teyit edilebilir. Farklı genotip kemik iliği değişimi sonra, histoloji skoru değiştirmek gerekir. Bu, kemik iliği hücrelerinde eksprese edilen gen-of-ilgi yoluyla kolit değişmiş öneride bulunur. Veri araçlarının ortalama ± standart hata ile temsil edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu, kemik iliği transplantasyonu yaklaşım immünoloji kolit araştırma, enfeksiyon, kanser, aşırı şişmanlık ve diğer hastalıklar için de uygundur. Bu kemik iliği nakli deneyi gen-faiz hem de kemik iliğinden elde edilen ve non-kemik iliğinden elde edilen hücreleri ve gen-faiz ya nüfus hücreleri tarafından hastalık arabuluculuk şüphelenilen ifade edildiğinde gereklidir. Örneğin, antimikrobiyal peptit katelisidin akut kolit modüle etmek için gösterilir. Ancak epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri (örneğin makrofajlar gibi) hem de ifade edilir. Sonra farelerde akut kolit modüle hücrelerin hangi nüfusu tanımlamak için kemik nakli kullanılır. Kolit şiddeti belirgin kemik iliği nakli ile kemik iliği cathelicidin genotiplerinin değişiklikten sonra değişmiş oldu. Sonra biz DSS yanıt olarak modüle akut kolit önemli bir rol oynar kemik iliğinden elde edilen hücrelerde eksprese olduğunu cathelicidin sonucuna varabiliriz.
Kemik marrow türetilen hücreler tipik kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve trombosit içerir. Kemik iliği nakli bu hücrelerin ancak başkalarının genotipi değiştirir. Yanal konuşma, bu deney sadece non-kemik iliğinden elde edilen hücreleri karşı kemik iliğinden elde edilen hücrelerde gen-faiz rolü ayırt edebilirsiniz. Ama bu deney, ayrıca tüm kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve trombositler gibi kolit Kemik iliği kaynaklı hücrelerin aracılık kemik iliğinden elde edilen hangi nüfus tanımlayamazsınız. Kolit sırasında kolonların göç kemik iliğinden elde edilen hücrelerin kaderini aktif bir araştırma ve tartışmalı bir alandır. Kemik iliği transplantasyonu ve murin kolit oluşturulduktan sonra, kemik iliği kaynaklı hücrelerin bazı kolonlar 5 lenfoid hücreler ve miyofibroblastlar olarak var olması muhtemeldir. Başka bir rapor kemik iliğinden elde edilen hücreleri kurtarma işlemi 6 neovaskülarizasyon için endotel progenitör hücrelerin görevi önerdi. Ayrıca evidenc vardırE arası kemik iliğinden elde edilen hücreler kolit 7 hastalarda epitel hücre farklılaşmasının ile ilişkilidir. Biz kemik iliği kaynaklı hücrelerin bazı tipik bağışıklık hücreleri dışındaki hücrelere farklılaştırmak ve kolit gelişiminde modüle rol oynayabileceği olasılığını göz ardı edemeyiz. Bununla birlikte, kemik iliği kaynaklı monosit / makrofaj nüfus kimyasal indüklenen kolonik mukozal hasar 8,9 karşı koruma için önemlidir. Bu rapor bizim cathelicidin monositler / makrofajlar 4 salgılanan ise DSS kolit modüle cathelicidin kemik iliğinden elde edilen hücrelerden eksprese bulgu ile tutarlıdır.
Öte yandan, kemik iliği nakli başarısını izlemek için birçok yol vardır. CD45.1 ve CD45.2 genotiplerinin akış sitometri analizi alıcı verici farelerde kemik iliği kök hücre kaynaklı hücrelerin oranını saptamak için nicel bir yöntem sağlar. Kemik iliği hücresi eldes hücreleri 10 çoklu türlü içine ayırt edebilirsiniz. Flow sitometri analizi mümkün değildir, bu erkek (XY kromozomu) donör fare ve 11 dişi (XX kromozom) alıcı fareler kullanmak mümkündür. Donör fareler XX sadece dişi alıcı farelerin vücut benzersiz Y kromozomları taşıyacaktır. Y kromozomu situ hibridizasyon 11 floresan tespit edilebilir. Buna ek olarak, CD45.1, CD45.2 ve / veya dokularda gen-of-ilgi immünohistokimya donor kemik iliğinden elde edilen hücreler görselleştirmek için gerekli olabilir.
Fareler sakrifiye edildi Ama sonra situ hibridizasyon işlemlerinde CD45 akım sitometri analizi ve Y kromozomu genellikle yapılır. Fareler feda etmeden kanser gibi kronik hastalıklardan incelemek için kullanılmakta olan alıcı farelerde verici hücre konumunu izlemek için, verici fareler 12 olarak yeşil floresan protein transjenik farelerin kullanılması mümkündür. Bu nedenle, verici kemik iliğisıra edilen hücre geçici anestezi altında invaziv olmayan yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme altına alıcı farelerde vücut izlenebilir ve bu tekrar tekrar yapılabilir.
Tüm fareler başarılı kemik iliği nakli 13 var. Biz ~ farelerin% 10-20 anemi veya enfeksiyon nedeniyle radyoterapi sonrası ilk 2 hafta içinde ölür görülmektedir. Bu nedenle, gerekli olandan daha fazla fareler deney başında hazırlanması gerekmektedir. Eğer kolit deneme sonunda her bir grup 8 farelerde mevcuttur düşünüyorsanız Örneğin, denemenin başında grubun başına 10 fare hazırlamalıdır. Ayrıca, mümkün olan en kısa sürede ölü fareler kaldırmak emin olun. Immün rekonstitüsyon ve hız alıcı fareler 14 infüze kemik iliğinde hematopoietik kök hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişkilidir. Bu nedenle, başarılı bir kemik iliği tr için alıcı farelere infüze canlı kemik iliği hücreleri (fare başına 1 x 10 7 hücre) yeterli sayıda olması çok önemlidiransplantation.
Işınlama sonrasında Alıcı fareler bağışıklık tehlikeye. Donör fareler disseksiyon ve kemik iliği hazırlama prosedürleri hücre kültürü deneyleri gibi aynı standart olarak yapılmalıdır. Steril alet ve kaplar kullanın, aseptik işleme teknikleri uygulanmalıdır. Tüm deneyler süresince PBS,% 1 penisilin-streptomisin ve 10 U / ml heparin kemik iliği ve taşıma sırasında kullanılmalıdır içerir. Tüm reaktifler hücre kültürü sınıf vardır. Ek teknik tartışma başvuru 13 bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma UCLA-CURE Merkezi, Crohn ve Amerika Kariyer Geliştirme Ödülü (# 2691) ve Sağlık NIDDK K01 Ulusal Enstitüsü (DK084256) Hon Wai Koon finansman Kolit Vakfı Pilot ve Fizibilite Çalışması hibe ile finanse edildi.
Kemik iliği ışınlama işlemi Bernard Levin ve AIDS Araştırma Fare / İnsan Chimera Çekirdek tesisi için UCLA Merkezi'nde Scott Mutfak tarafından yardım edildi. Flow sitometri çalışması UCLA Vektörel Çekirdek tesisi tarafından yardım edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
