Summary
Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen vermenigvuldigen
Abstract
Differentiatie van humane neurale stamcellen in neuronale en gliale celtypen een model te bestuderen en vergelijken moleculaire regulatie van neurale cellijn ontwikkeling. In vitro expansie van neurale voorlopercellen uit foetale CZS-weefsel is goed gekarakteriseerd. Ondanks de identificatie en isolatie van gliale voorlopercellen uit volwassen menselijk subcorticale witte stof en ontwikkeling van verschillende kweekomstandigheden direct differentiatie van neurale stamcellen in myeline producerende oligodendrocyten, het verkrijgen van voldoende menselijke oligodendrocyten in vitro experimenten blijft moeilijk. Differentiatie van galactocerebroside + (GalC) en O4 + oligodendrocyt precursor of progenitorcellen (OPC) van neurale precursoren is gemeld met behulp van het tweede trimester foetale hersenen. Echter, deze cellen niet prolifereren in afwezigheid van steuncellen zoals astrocyten en neuronen en worden snel verloren tijd in cultuur. De noodzaak de een kweeksysteem te produceren cellen van de oligodendrocyten lineage geschikt voor in vitro experimenten.
Kweek van primaire humane oligodendrocyten kan bijvoorbeeld een nuttig model voor de pathogenese van neurotrope ziekteverwekkers zoals het menselijk polyomavirus, JCV dat in vivo infecteert deze cellen te bestuderen. Deze gekweekte cellen kunnen ook modellen van andere demyeliniserende ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS). Primaire, foetale hersenen afgeleide, multipotentiële neurale progenitorcellen prolifereren in vitro terwijl de kunnen differentiëren tot neuronen (progenitor-afgeleide neuronen, PDN) en astrocyten (progenitor-afgeleide astrocyten, PDA) Dit onderzoek toont dat neurale stamcellen kunnen worden geïnduceerd om onderscheid te maken door veel van de stadia van oligodendrocytic afkomst ontwikkeling (progenitor-afgeleide oligodendrocyten, BOB). We cultuur neurale stamcellen in DMEM-F12 serumvrije media supaangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF), van bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrofische factor 3 (NT-3), N-2 en triiodothyronine (T3). De gekweekte cellen worden gepasseerd op 2.5e6 cellen per 75cm kolven ongeveer om de zeven dagen. Met deze omstandigheden is de meerderheid van de cellen in cultuur te behouden morfologie wordt gekenmerkt door een aantal processen en een automatische markers vooraf oligodendrocyt cellen, zoals A2B5 en O-4. Wanneer we de vier groeifactoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) verwijderen en toevoegen geconditioneerde media uit PDN, de cellen beginnen te meer processen en express markers specifiek voor oligodendrocyten differentiatie, als GalC en myeline verwerven basic protein (MBP). We fenotypische karakterisatie uitgevoerd met multicolor flowcytometrie unieke markers van oligodendrocyt identificeren.
Protocol
Opmerking: routine kweken van neurale voorlopercellen en oligodendrocytic lineage cellen incubatie wordt uitgevoerd bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Elke 2 dagen wordt het medium vervangen met 50 tot 100% vers medium als cultuur 40-70% confluent. Op het moment van bijna confluentie worden de kweken doorgekweekt op 2-2.5e6/T75 kolf meestal wekelijks schema.
1. Voorbereiden van de Coated Flask
- Te bereiden beklede flessen 5 mg van poly-D-lysine (PDL) verdund in 100 ml gedeïoniseerd water (DI-water), smeer T75 flessen met 50 ug / ml van PDL bij kamertemperatuur (RT) in het donker. Na 1 ½ uur, zuigen de PDL en een keer spoel de kolven met DI-water. Laat de kolven drogen voordat enten van de cellen (tabel 1).
2. Vanaf Differentiatie van neurale progenitor cellen in Progenitor afgeleide Oligodendrocyten (BOB)
Het protocol isolate menselijke CNS progenitorcellen beschreven in een eerdere publicatie en is geen onderdeel van dit protocol 1. Menselijke CNS progenitor cellen werden geïsoleerd uit de grote hersenen van een 8-week zwangerschap foetale hersenen, verkregen volgens NIH richtlijnen.
- Groeien multipotentiële populatie van neurale progenitorcellen op PDL beklede flessen in neurobasal medium aangevuld met 25 ng / ml bFGF en 20 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) (Figuur 1A). Gebruik ze niet als hoger dan passage 11 (p11).
- Beginnen de neurale stamcellen differentiëren wanneer de cultuur ongeveer 70% confluent.
- Maak volledige differentiatie van oligodendrocyten medium met serum-vrij DMEM / HAMS F12 01:01 medium aangevuld met bovine serum albumine, L-glutamine, gentamicine, N2 componenten, T3, Shh, NT-3, bFGF en PDGF-AA (Tabel 1) . Dit medium wordt gedefinieerd als oligo medium met groeifactoren (oligo medium + GF).
- Verwijder Progenitor media uit de kolven, eenmaal spoelen cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en oligo medium toe + GF (details beschreven in 2.3) tot oligodendrocyten differentiatie starten. Alleen cellen betrokken bij de oligodendrocytic lijn zal groeien (Figuur 1B). Cultuur de cellen in dit medium 3 weken.
- Elke week, wanneer de cellen bij 90-95% confluentie passage met behulp trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml voor een T75 kolf). Breng de hele medium van de cellen die moeten worden gepasseerd in een 50 ml conische buis, dit geconditioneerde medium wordt gebruikt om de trypsine te blussen. Zorg ervoor dat niet om uitdrogen van de cellen. Voeg dan trypsine.
- Incubeer cellen in trypsine gedurende 5 min bij kamertemperatuur voorzichtig tikken de kolf meerdere malen cel onthechting helpen.
- Quench de trypsine door het toevoegen van 4-5 ml van geconditioneerd medium aan de kolf met de vrijstaande cellen.
- Breng het medium en de cellen dezelfde 50 ml conische buis. Centrifugeer het medium en de cellen bij 1200 rpm (~300 g) gedurende 5 min bij RT.
- Zuig het supernatant, resuspendeer de celpellet voorzichtig kantelen van de buis en voeg verse oligo medium + GF. Voorzichtig pipet medium en cellen op en neer om een uniforme celsuspensie te maken.
- Tel de cellen en overdracht 2.5e6 in elke nieuwe PDL-coated T75 kolf.
3. Laatste stap in de differentiatie van oligodendrocyten
- Na 3 weken kweken in medium oligo + GF, wanneer de cellen bij 70-80% confluentie, start het uiteindelijke proces van differentiatie (figuur 1C).
- Bereid medium op dezelfde wijze als de oligo medium + GF maar zonder toevoeging van de vier GF: Shh, NT-3, bFGF en PDGF-AA. Dit medium zonder de vier GF zal worden gedefinieerd als oligo medium - GF.
- Zuig het medium oligo + GF uit de kolf eenmaal spoelen met PBS en dan een totaal volume van 16 ml medium, waarvan ¾ (12 ml) is oligo medium - GF en ¼ (4 ml) is PDN geconditioneerd medium, voor 6-10 Dagen). Het gebruik van geconditioneerde medium van PDN is niet kritisch voor het differentiatieproces of het overleven van de cellen. We in feite opgemerkt dat alleen direct contact van PDO met PDN cellen in co-cultuur experimenten effect van de lengte van de BOB overleving hadden. De overlevingstijd in oligo medium - GF kan worden verlengd tot twee of drie weken de PDO cellen samen gekweekt met cellen PDN. Het protocol voor de menselijke neurale stamcellen differentiëren in PDN wordt beschreven in een eerdere publicatie en het maakt geen deel uit van dit protocol 1. Groeifactor terugtrekking uit het kweekmedium resultaten geleidelijk gedifferentieerde kweken van cellen met meerdere processen (Figuur 1D).
4. Flow Cytometry Assay
De flowcytometrie test vergelijkt de overname van oligodendrocyt markers tijdens de differentiatie proces in relatie met die van hun ouders bevolking.
- Gebruik neurale progenitors als controle. Seed PDO cellen op 2.5x10 6 cellen in twee T75 kolven bekleed met poly-D-lysine in oligo medium + GF.
- Een week later, vervang medium met verse oligo medium + GF in flessen als controle cultuur voor levensvatbaarheid van de cellen, terwijl andere kolven had oligo medium - GF.
- Om PDO cellen dissociëren in beide media gebruikt 20 U / ml papaïne en niet trypsine. Dit komt omdat papaïne een zachter effect op de cellen tijdens de dissociatie behoud van de cellulaire morfologie.
- Voeg 5 ml Balanced Salt Solution Earle's (EBSS) een papaïne flesje. Plaats het flesje bij 37 ° C gedurende 10 minuten of totdat de papaïne volledig opgelost en de oplossing wordt helder. Dit is de papaïne oplossing gebruikt om de cellen te scheiden.
- Voeg 0,5 ml van EBSS een desoxyribonuclease I (DNase) flacon (tabel 1). Meng voorzichtig. Voeg 0,25 ml van deze oplossing aan de flacon van opgeloste papaïne. Dit preparaat bevat een eindconcentratie van ongeveer 20 U / ml papaïne en 00,005% DNase.
- Place papaïne oplossing (zoals hierboven beschreven) op de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 15-30 min, volgen het losmaken van de cellen met behulp van een microscoop. Stop de reactie met 5 ml medium met of zonder GF en centrifugeer bij 1200 rpm gedurende 7 minuten.
- Transfercel pellets van beide kolven in twee verschillende 5 ml polypropyleenbuisjes en wassen met normale fysiologische medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM Hepes en 10 mM glucose) aangevuld met 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA + NPM).
- Voer oppervlak immunokleuring bij 4 ° C gedurende 20 min met specifieke en adequate getitreerd primaire antilichamen voor A2B5, O4, GalC (tabel 2).
- Was de cellen met NPM + BSA bij 4 ° C gedurende 5 min en incubeer met specifieke secundaire antilichamen bij 4 ° C gedurende 20 min (tabel 2).
- Om intracellulaire antigenen waaronder nestine, gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP), klasse III & zijn vlekkenta,-tubuline en myeline basisch eiwit (MBP) (Tabel 2), vast cellen in 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur en doorlaatbaar met koude 70% ethanol gedurende 15 min bij -20 ° C.
- Was de cellen met 1x PBS en incubeer met specifieke secundaire antilichamen (Tabel 2).
- Tussen intacte cellen en subcellulaire afval discrimineren tijdens flowcytometrieanalyse, vlek cellen met 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
- In het bovenstaande protocol optimaliseren, voerden we alle geschikte controle-experimenten om de specificiteit van elke immunoreagent bevestigen. Kort voor het direct gelabelde antilichamen, de juiste negatieve controle was een direct geconjugeerd antilichaam van hetzelfde isotype immunoglobuline klasse (of subklasse) en fluorochroom conjugaat als het primaire antilichaam (de isotype controle). Voor indirecte immunokleuring van primaire antilichamen, de juiste negatieve controle wals het secundaire antilichaam geconjugeerd aan het fluorochroom plaats die specifiek de immunoglobuline klasse (of subklasse) bij de gastheer waarin het primaire antilichaam werd gegenereerd gericht. Als primaire antilichamen van meerdere hosts (muis, konijn, kip) samen werden gebruikt, gebruikten we het secundaire antilichaam gericht het primaire antilichaam van elke host en elk secundair antilichaam gebruikt werd kenmerkend cross-geadsorbeerd tegen de Immunoglobulinen van de andere gastheren cross-minimaliseren hosten immunoreactiviteit. De positieve controles opgenomen direct of indirect immunokleuring van celpreparaten waarover de antigenen van interesse met behulp van directe of indirecte afweerreacties met de primaire antilichamen specifiek voor deze antigenen. De bovenstaande optimaliseringsmethoden uitgevoerd eenmaal voor elk type immunokleuring experimenten. Afweerreacties controle toonde geen significante cross-epitoop immunoreactiviteit tussen primaire en secundaire antilichamen. Flowcytometrie werd uitgevoerd op uniformeopgeschort fluorescent gelabelde cellen door een FACVantage SE cell sorter (BD Biosciences, San Jose, CA) uitgerust met drie lasers die golflengten afgestemd 488 nm, 647 nm verschaffen en een brede UV (351-364 nm) (figuur 2) .
5. Immunofluorescentietest
Opmerking: Voor immunofluorescentie experimenten, BOB worden uitgeplaat in oligo medium + GF of oligo medium - GF op 2.5e5 in 6 well platen bekleed met PDL. De cellen gefixeerd in 2% PFA op verschillende tijdstippen na intrekking van groeifactoren. Het antilichaam vlek wordt uitgevoerd op plastic 6 well platen in plaats van dekglaasjes.
- Verwijder het afdrukmateriaal en voeg de 2% PFA. Incubeer gedurende 10 min bij RT. Gooi PFA. Was de cellen drie keer met PBS, 5 min per keer. Wees voorzichtig niet om uitdrogen van de cellen.
- Permeabiliseren cellen voor intracellulaire markers van 0,25% triton oplossing in PBS gedurende 10 minuten bij RT.
- Om niet-specifieke binding, blok cellen te voorkomen fof 10 min met HHG (1 mM HEPES buffer, 2% paardenserum en 10% geitenserum in Hanks gebalanceerde zoutoplossing). Verdun specifieke primaire antilichamen (Tabel 2) een vooraf bepaalde concentratie in HHG. Plaats verdunde antilichamen op cellen. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur op de shaker of bij 4 ° C overnacht.
- Was de cellen drie keer met PBS, gedurende 5 minuten elke keer. Verdun geschikte secundaire antilichamen (Tabel 2) gekoppeld aan een fluorochroom een vooraf bepaalde concentratie in HHG. Plaats het mengsel van verdunde secundaire antilichamen op cellen. Incubate 1 uur bij kamertemperatuur op een schudder in het donker.
- Was de cellen drie keer met PBS, gedurende 5 minuten elke keer.
- Om te voorkomen dat fotobleken voeg 10 ul van Verleng Gold met DAPI aan de cellen en plaatst u een glas dekglaasje op de top van hen. Visualiseren gemerkte cellen met een Axiovert 200M fluorescentiemicroscoop (Zeiss, Thornwood, NY) (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het is zeer belangrijk om de differentiatie starten vanaf een 70% -80% confluent neurale stamcellen kweek (Figuur 1A). Veel cellen zullen sterven na het wijzigen van het kweekmedium van stamvader tot oligo medium, omdat het voorziet in specifieke groeifactoren. Dit betekent dat de groei van neurale progenitorcellen niet gebonden aan een oligodendrocytic fenotype niet wordt ondersteund door het nieuwe medium (Figuur 1B). Incubatie in oligo medium + GF gedurende een week resulteerde in een tussenproduct cultuur vertoont een smalle, bipolaire morfologie (figuur 1B). De cellen worden gehouden in medium oligo + GF 3-4 weken (figuur 1C). Groeifactor terugtrekking uit het kweekmedium resulteerde in geleidelijk gedifferentieerde kweken van cellen met meerdere processen (Figuur 1D). Flowcytometrie wordt gebruikt voor de kwantitatieve weergave van de gegevens.
Figuren 2A, 2B en 2C tonen aan dat de meeste neurale stamcellen het neuroepitheel stamcel marker nestine tot expressie, terwijl slechts kleine subpopulaties uitgedrukt afstammings-beperkende markers zoals astrocyten marker GFAP (figuur 2A), het neuronale marker klasse III β-tubuline (Figuur 2B) of de oligodendrocyt marker O4 (figuur 2C). Als kweekmedium werd vervangen door oligo medium + GF en cellen werden gedurende 1 week, daalde nestine expressie en verhoogde expressie A2B5 worden waargenomen (Figuur 2D). A2B5 is een neuroglial voorloper marker. In vergelijking 2 weken na medium vervangen werd nestine expressie nog verder omlaag en A2B5 expressie alleen gegroeid (figuur 2E) en de expressie van een ander oligodendrocyten marker, O4 (figuur 2F). Twee dagen na de groeifactor terugtrekking, O4 uitdrukking, evenals het aantal als de uitdrukking van GalC, eenlaat oligodendrocyt marker (figuur 2G). Zes dagen na de groeifactor terugtrekking, de co-expressie van O4 en GalC gegroeid (figuur 2H) en is vergelijkbaar met de co-expressie van GalC en MBP (figuur 2I). De multi-epitoop immunokleuring blijkt dat meer dan de helft van de cellen in cultuur MBP (figuur 2J) expressie. Verder bewijs van PDO differentiatie werd gekenmerkt met behulp van een immunofluorescentie assay, de temporele toename van MBP-expressie in deze cellen na intrekking groeifactor (Figuur 3A-C). Samengevat menselijke foetale neurale progenitorcellen kunnen prolifereren in vitro terwijl de kunnen differentiëren tot 3 grote hersenen celtypen (figuur 4).
Figuur 1. Fasecontrastmicroscopie of (A) neurale stamcellen gekweekt in progenitor medium; (B) neurale stamcellen gekweekt in medium oligo + GF voor een week vertonen een veranderde smalle bipolaire morfologie; (C) gesplitste progenitor afgeleide oligodendrocyten 3 dagen gekweekt in medium oligo na groeifactor onttrekking tentoonstelling oligodendrocyt morfologie gekenmerkt door meerdere processen. Vergroting van 20x.
Figuur 2 Flow cytometrie analyse van neurale progenitorcellen co-expressie van de precursor-celmarker Nestin (alle verticale assen) met:. (A) de astrocytische marker GFAP; (B) de neuronale marker β tubuline III en (C) de oligodendrocytic marker O4; (D) neurale progenitor cellen gekweekt voor een week in oligo media + GF co-express Nestin en A2B5; (E) nestine en A2B5 co-expressie na twee weken van neurale voorlopercellen groei oligo medium + GF (F) A2B5 en O4 co-expressie na twee weken van neurale voorlopercellen groei oligo medium + GF; (G) twee dagen na de groeifactor terugtrekking, worden verschillende oligodendrocyt markers van differentiatie, O4 en GalC, uitgedrukt. Zes dagen na groeifactor intrekking (H) een groter deel van de cellen zijn dubbel positief voor O4 en GalC, (I) dubbel positief voor GalC en MPB, en (J) dubbel positief voor O4 en MBP. AJ zijn representatief voor vier onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Indirecte immunofluorescence kleuring van progenitor afgeleide oligodendrocyten voor MBP (A) 2 dagen (B) 5 dagen en (C, D) 9 dagen na groeifactor terugtrekking. (D) Vertegenwoordigt de fase beeld van de 9 dagen cultuur in oligo medium - GF en (E) is een uitbreiding van de witte doos van hetzelfde beeld (A, B) 20x vergroting, (C, D) 32x vergroting..
Figuur 4. Schematische weergave van onze celcultuur model. Primaire, foetale hersenen afgeleide, multipotentiële neurale progenitorcellen prolifereren in vitro behoud van hun plasticiteit. Behulp van verschillende kweekomstandigheden, neurale progenitorcellen kunnen differentiëren tot neuronen (PDN), astrocyten (PDA) en oligodendrocyten (BOB), zoals door specifieke differentiation markers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe u foetale oligodendrocyten ontlenen primaire menselijke neurale stamcellen en karakteriseren hun fenotype met behulp van zowel flowcytometrie en immunofluorescentie kleuring. De uitbreiding en groei van neurale voorlopercellen uit foetale centrale zenuwstelsel is zeer goed beschreven 1-4. Echter, om voldoende menselijke oligodendrocyten in vitro experimenten blijft moeilijk, hoewel het mogelijk om voorlopers en gliale isoleren van volwassen menselijke witte stof 5-13. Er zijn verschillende pogingen in de ontwikkeling van verschillende kweekomstandigheden direct differentiatie van neurale stamcellen in myeline producerende oligodendrocyten 14-21. Dit protocol beschrijft verder nestin positieve neurale progenitor cellen die de marker O4 (Figuur 2) bij kweek gedurende 3 weken in een serum-vrij medium aangevuld met bepaalde groeifactoren (PDGF-AA, bFGF, Shh, en NT-3), that zijn essentieel voor de proliferatie en overleving van oligodendrocyten precursors 22-24. Verwijdering van deze groeifactoren in het O4 + cellen resulteerde in verdere differentiatie en expressie van myeline componenten (galactocerebroside en MB). Bovendien, de expressie van oligodendrocyten differentiatiekenmerken samenvalt met morfologische veranderingen van cellen die in eerste verscheen smalle en bipolaire (Figuur 1B) om cellen die meerpolige met goed ontwikkelde processen (Figuur 1C). De verwijdering van groeifactoren om tijdens de laatste stappen van differentiatie is gebaseerd op studies gedaan, zowel in muis en mens 15,25. De aanwezigheid van triiodothyronine (T3) is belangrijk voor de overleving en differentiatie van oligodendrocyten 26 terwijl we vast dat het verwijderen van de vier groeifactoren nodig was om de expressie van markers uiteindelijke differentiatie. Dit werd vergeleken met cellen bewaard in oligo medium + GF eensa controle.
Wij niet de eersten die de differentiatie van multipotente neurale progenitorcellen beschrijven oligodendrocyt cellen in reactie op signalen zoals Shh en bFGF 24. Eerdere rapporten toonden aan dat corticale oligodendrogenesis begint rond 10 weken zwangerschapsduur bij de mens 24 met de capaciteit van de menselijke foetale oligodendrocyten te myelinate toenemende proportioneel toe met de zwangerschapsduur 22. Differentiatie van galactocerebroside + en O4 + oligodendrocyt voorloper cellen van neurale stamcellen werd gerapporteerd met behulp van het tweede trimester foetale hersenen 21,27. Echter, deze cellen niet prolifereren in afwezigheid van steuncellen zoals astrocyten en neuronen en worden snel verloren tijd in cultuur 21. Ons systeem ondersteunt de vorming van GalC + en MBP + cellen uit humane foetale kweek van 8 weken zwangerschapsduur. Verder hebben we beschreven dat de differentiated oligodendrocyten kunnen worden gekweekt in vitro zonder de noodzaak van ondersteunende cellen astrocyten en neuronen, hoewel de cocultivatie met neuronen de overleving van de gedifferentieerde oligodendrocyten verlengen. Nog een voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om een groot aantal cellen die de marker O4 + die kunnen worden gekweekt en passage in kweek weken behoud van hun fenotype cultiveren. Op dat moment de O4 + cellen kunnen worden doorgezet in de laatste stap van differentiatie wanneer de groeifactoren uit het medium. Het protocol beschreven in dit document richt zich op de behoefte aan oligodendrocyt lineages die geschikt zijn voor in-vitro-experimenten. Bovendien geloven we dat de identificatie van specifieke factoren die de differentiatie van neurale voorlopercellen cascade veroorzaken in de richting van progenitor-derived oligodendrocyt belangrijk is voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van ontwikkelingsovergangen. Het kan ook dienen als een belangrijk instrument voor het bestuderen demyelinisatie en virus-gastheercel interacties betrekking op de pathogenese van neurotrope virussen zoals JCV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, NINDS. De auteurs willen graag alle leden van het Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde en Neuroscience, Rick Dreyfuss bedanken voor het helpen met microscopie en Pamela C. Zeven voor het helpen met de redactie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H.
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
