Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stamfar-avledet Oligodendrocyte Kultur System fra Human fosterets hjerne

Published: December 20, 2012 doi: 10.3791/4274
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Primær, menneskelige hjernens-deriverte, multipotential stamceller sprer

Abstract

Differensiering av menneskelige nevrale stamceller i neuronal og glial celletyper tilbyr en modell for å studere og sammenligne molekylær regulering av neural celle avstamning utvikling. In vitro utvidelse av nevrale stamceller fra foster CNS vev har blitt godt karakterisert. Til tross for identifisering og isolering av glial stamfedre fra voksent menneske sub-kortikal hvit materie og utvikling av ulike kultur betingelser for direkte differensiering av fosterets nevrale stamceller i myelin produserende oligodendrocytes, anskaffe tilstrekkelige menneskelige oligodendrocytes for in vitro eksperimentering er fortsatt vanskelig. Differensiering av galactocerebroside + (GalC) og O4 + oligodendrocyte forløper eller stamceller (OPC) fra nevrale forløper celler er rapportert ved hjelp andre trimester fosterets hjerne. Men disse cellene ikke sprer i fravær av støtte celler inkludert astrocytes og nerveceller, og er tapt raskt over tid i kultur. Behovet fortsatt for en kultur-system for å produsere celler av oligodendrocyte avstamning egnet for in vitro forsøk.

Dyrkning av primære humane oligodendrocytes kunne, for eksempel, være en nyttig modell for å studere patogenesen av neurotropisk smittestoffer som menneskelige polyomavirus, JCV at in vivo infiserer disse cellene. Disse dyrkede celler kunne også gi modeller av andre demyeliniserende sykdommer i det sentrale nervesystemet (CNS). Primær, human fosterets hjerne-avledet, multipotential nevrale stamceller sprer in vitro og samtidig opprettholde evnen til å differensiere i nevroner (stamfar-avledet nevroner, PDN) og astrocytes (stamfar-avledet astrocytes, PDA) Denne studien viser at nevrale stamceller kan induseres å skille gjennom mange av de stadier av oligodendrocytic avstamning utvikling (stamfar-avledet oligodendrocytes, PUD). Vi kultur nevrale stamceller i DMEM-F12 serum-frie medier supiverksatt med grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), blodplate avledet vekstfaktor (PDGF-AA), Sonic pinnsvin (SHH), neurotrop faktor 3 (NT-3), N-2 og trijodtyronin (T3). Dyrkede celler passaged på 2.5e6 celler per 75cm kolber omtrent hvert sju dager. Ved hjelp av disse forhold, flertallet av celler i kultur opprettholde en morfologi preget av få prosesser og uttrykke markører av pre-oligodendrocyte celler, for eksempel A2B5 og O-4. Når vi fjerner de fire vekstfaktorer (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) og legge kondisjonert medium fra PDN, cellene begynner å anskaffe flere prosesser og uttrykke markører spesifikke for oligodendrocyte differensiering, for eksempel GalC og myelin grunnleggende protein (MBP). Vi utførte fenotypisk karakterisering ved hjelp av flerfarget flowcytometri å identifisere unike markører for oligodendrocyte.

Protocol

Merk: For rutine dyrkning av nevrale progenitor og oligodendrocytic avstamning celler, er inkubering utført ved 37 ° C i en fuktet 5% CO 2 atmosfære. Hver 2 dager, blir mediet erstattet med 50 til 100% av friskt medium hvis kulturen er 40-70% konfluent. På tidspunktet for nær sammenflyting, er kulturene passaged på 2-2.5e6/T75 kolbe vanligvis på en ukeplan.

1. Klargjøre Coated Flask

  1. Å tilberede belagte kolber fortynne 5 mg av poly-D-lysin (PDL) i 100 ml deionisert vann (DI-vann), og deretter belegge T75 kolber med 50 ug / ml av PDL ved romtemperatur (RT) i mørket. Etter 1 ½ time, suge PDL og skyll flaskene en gang med DI-vann. La kolbene tørr før såing cellene (tabell 1).

2. Starter Differensiering av Neural stamceller til progenitor-avledet oligodendrocytes (PUD)

Protokollen til erolate menneskelige CNS stamceller er beskrevet i en tidligere publikasjon og det er ikke en del av denne protokollen 1. Humane CNS progenitor celler ble isolert fra telencephalon av en 8-ukers svangerskap fosterets hjerne, oppnådd i samsvar med NIH retningslinjer.

  1. Grow multipotential populasjon av neural stamceller på PDL belagte kolber i neurobasal medium supplert med 25 ng / ml bFGF og 20 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF) (figur 1A). Ikke bruk dem hvis høyere enn passasje 11 (p11).
  2. Begynne å skille nevrale stamceller når kulturen er ca 70% confluent.
  3. Gjøre komplett differensiering oligodendrocyte mediet ved serumfritt DMEM / HAMS F12 01:01 medium supplert med bovint serumalbumin, L-glutamin, gentamicin, N2 komponenter, T3, Shh, NT-3, bFGF, og PDGF-AA (Tabell 1) . Dette mediet vil bli definert som oligo medium med vekstfaktorer (oligo middels + GF).
  4. Fjern progenitor medier fra kolbene, skyll celler en gang med fosfat-bufret saltvann (PBS), og deretter legge oligo medium + GF (detaljer beskrevet i 2.3) for å starte oligodendrocyte differensiering. Bare celler forpliktet til oligodendrocytic avstamning vil vokse (figur 1B). Kultur cellene i dette mediet for 3 uker.
  5. Hver uke, når cellene er ved 90-95% konfluens, passasje dem bruker trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml for en T75 kolbe). Overfør hele mediet fra cellene som skal passaged til en 50 ml konisk rør, dette kondisjonerte medium vil bli brukt for å slukke trypsin. Pass på å ikke tørke ut cellene. Deretter legge trypsin.
  6. Inkuber celler i trypsin i 5 min ved RT, forsiktig trykke på kolben flere ganger for å hjelpe celle avløsning.
  7. Slukke trypsin ved å legge 4-5 ml kondisjonerte medium til kolben med de løsnede celler.
  8. Overfør mediet og cellene til samme 50 ml koniske rør. Sentrifuger mediet og cellene ved 1200 rpm (~300 xg) i 5 min ved RT.
  9. Aspirer supernatant, resuspender cellepelleten forsiktig tipper røret, og deretter legge fersk oligo medium + GF. Forsiktig pipette medium og celler opp og ned for å gjøre en enhetlig cellesuspensjon.
  10. Telle celler og overføre 2.5e6 til alle nye PDL-belagt T75 kolbe.

3. Siste steg i Differensiering av oligodendrocytes

  1. Etter 3 uker med kultur i oligo medium + GF, når cellene er på 70-80% samløpet, starter den endelige prosessen med differensiering (Figur 1C).
  2. Forbered medium på samme måte som den oligo medium + GF men uten å legge til fire GF: Shh, NT-3, bFGF og PDGF-AA. Denne medium uten fire GF vil bli definert som oligo medium - GF.
  3. Aspirer oligo mediet + GF fra kolben, skyll gang med PBS og deretter legge til en totalvolum på 16 ml av medium, hvorav ¾ (12 ml) er oligo middels - GF og ¼ (4 ml) er PDN kondisjonerte medium, for 6-10 Dager). Bruken av kondisjonerte medium fra PDN er ikke kritisk for prosessen, eller differensiering til overlevelsen av cellene. Vi faktisk observert at bare direkte kontakt av PUD med PDN celler i co-culture eksperimenter hadde en effekt på lengden av PUD overlevelse. Overlevelse i oligo medium - GF kan forlenges til to eller tre uker dersom PUD cellene er co-dyrket med PDN celler. Protokollen å skille menneskelige nevrale stamceller til PDN er beskrevet i en tidligere publikasjon og det er ikke en del av denne protokollen 1. Vekstfaktor tilbaketrekning fra dyrkningsmediet resulterer i progressivt differensiert kultur av celler med flere prosesser (figur 1D).

4. Flowcytometri analyse

Den flowcytometri analyse sammenligner oppkjøpet av oligodendrocyte markører under differensiering prosessen i forhold til de av foreldrehjemmet befolkningen.

  1. Bruk nevrale progenitors som kontroll. Seed PDO cellene ved 2.5x10 6 celler i to T75 kolber belagt med poly-D-lysin i Oligo medium + GF.
  2. En uke senere, erstatte medium med frisk oligo medium + GF i flasks som en kontroll kultur for celleviabilitet, mens andre kolber hadde oligo medium - GF.
  3. Å dissosiere PDO celler i begge medier bruker 20 U / ml av papain og ikke trypsin. Dette er fordi papain har et mildere effekt på cellene under dissosiasjons bevare cellulære morfologi.
  4. Tilsett 5 ml av Earles Balanced Salt Solution (EBSS) til en papain hetteglass. Plasser hetteglasset ved 37 ° C i 10 min eller inntil papain er fullstendig oppløst og løsningen vises klart. Dette er den papainpreparat løsning brukt å dissosiere cellene.
  5. Tilsett 0,5 ml av EBSS til Deoxyribonuclease I (DNase) hetteglass (Tabell 1). Bland forsiktig. Legg 0,25 ml av denne løsningen til glasset med oppløst papain. Dette preparatet inneholder en endelig konsentrasjon på omtrent 20 U / ml papain og 00.005% DNase.
  6. Plass papain løsning (som beskrevet ovenfor) på cellene og inkuber ved 37 ° C i 15-30 min, overvåke avløsning av cellene ved hjelp av et mikroskop. Stopp reaksjonen med 5 ml medium med eller uten GF og sentrifuger ved 1200 rpm i 7 minutter.
  7. Overfør celle pellets fra begge kolbene i to forskjellige 5 ml polypropylenrør og vask dem med normal fysiologisk medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM HEPES og 10 mM glukose) supplert med 1 mg / ml bovint serumalbumin (NPM + BSA).
  8. Utfør overflaten farging ved 4 ° C i 20 min med bestemte og hensiktsmessig titreres primære antistoffer for A2B5, O4, GalC (tabell 2).
  9. Vask celler med NPM + BSA ved 4 ° C i 5 min og inkuber dem med spesifikke sekundære antistoffer ved 4 ° C i 20 min (Tabell 2).
  10. Å farge intracellulære antigener inkludert nestin, glial fibrillary sure protein (GFAP), klasse III og væreTA;-tubulin og myelin basisk protein (MBP) (tabell 2), fikse celler i 2% paraformaldehyd (PFA) i 20 min ved RT og permeabilize med kald 70% etanol i 15 min ved -20 ° C.
  11. Vask celler med 1x PBS og inkuber med spesifikke sekundære antistoffer (Tabell 2).
  12. Å diskriminere mellom intakte celler og subcellulære rusk under flowcytometri analyse, flekken celler med 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydroklorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. I optimalisere ovennevnte protokoll, utførte vi alle de aktuelle kontroll eksperimenter for å bekrefte spesifisitet av hver immunologisk. Kort fortalt, for direkte merkede antistoffer, var egnet negativ kontroll en direkte konjugert antistoff av samme immunoglobulin isotype klasse (eller subklasse) og fluorokrom konjugat som det primære antistoff (dvs. isotype kontroll). For indirekte farging av primære antistoffer, egnet negativ kontroll wsom sekundær antistoff konjugert til fluorkrom av interesse at spesifikt målrettet immunoglobulin klasse (eller subklasse) av verten som det primære antistoff ble generert. Når primære antistoffer fra flere verter (mus, kanin, kylling) ble anvendt sammen, vi brukte sekundært antistoff rettet mot primære antistoff av hver vert og hver sekundære antistoff som brukes var typisk kryss-adsorbert mot immunoglobuliner fra andre verter for å minimalisere kryss- vert immunoreaktivitet. De positive kontrollene inkluderte direkte eller indirekte farging av cellepreparater kjent å uttrykke antigenene av interesse ved hjelp av enten direkte eller indirekte immunoreaksjoner med primære antistoffer som er spesifikke for disse antigener. Ovennevnte optimeringsmetoder ble utført en gang for hver type farging eksperimenter. Kontroll immunoreaksjoner viste ingen signifikant kryssresistens epitop immunoreaktivitet blant primære og sekundære antistoffer. Strømningscytometri ble utført på jevntsuspendert fluorescensmerkede celler ved hjelp av en FACVantage SE celle sorter (BD Biosciences, San Jose, CA) er utstyrt med tre lasere, som gir eksitasjonsbølgelengdene innstilt til 488 nm, 647 nm, og en bred UV (351-364 nm) (figur 2) .

5. Immunfluorescens Assay

Merk: For immunofluorescence eksperimenter, er PUD belagt i oligo medium + GF eller oligo medium - GF på 2.5e5 i 6 brønners plater belagt med PDL. Cellene blir fiksert i 2% PFA ved forskjellige tidspunkter etter tilbaketrekking av vekstfaktorer. Antistoffet flekken er utført på plast 6 brønners plater i stedet for glass dekkglass.

  1. Fjern utskriftsmaterialet og legge til 2% PFA. Inkuber i 10 min ved RT. Kast PFA. Vask cellene 3 ganger med PBS, 5 minutter hver gang. Vær forsiktig så du ikke tørker ut cellene.
  2. Permeabilize celler for intracellulære markører for 0,25% Triton løsning i PBS i 10 minutter ved RT.
  3. Å hindre ikke-spesifikk binding, blokk celler feller 10 min med HHG (1 mM HEPES buffer, 2% hest serum, og 10% geit serum i Hanks 'balanserte saltløsning). Fortynn spesifikke primære antistoffer (Tabell 2) til en forhåndsbestemt konsentrasjon i HHG. Plasser utvannet antistoffer mot cellene. Inkuber 1 time ved RT på shaker eller ved 4 ° C over natten.
  4. Vask cellene 3 ganger med PBS, i 5 min hver gang. Fortynne egnede sekundære antistoffer (tabell 2) kombinert med en fluorokrom til en forhåndsbestemt konsentrasjon i HHG. Plasser blandingen av utvannet sekundære antistoffer på celler. Inkuber 1 time ved RT på en ristemaskin i mørket.
  5. Vask cellene 3 ganger med PBS, i 5 min hver gang.
  6. Å unngå photobleaching legge 10 pl Forleng Gold med DAPI til cellene og legg et dekkglass på toppen av dem. Visualisere merkede celler ved hjelp av en Axiovert 200M fluorescensmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det er svært viktig å starte differensiering prosessen fra en 70% -80% confluent nevrale stamceller kultur (figur 1A). Mange celler vil dø ut etter å endre kulturen medium fra stamfar til oligo medium siden det omfatter bestemte vekstfaktorer. Dette indikerer at veksten av nevrale stamceller ikke forpliktet til en oligodendrocytic fenotype ikke vil bli støttet av det nye mediet (figur 1B). Inkubering i Oligo medium + GF for en uke ga en mellomliggende kultur oppviser en smal, bipolare morfologi (figur 1B). Cellene blir holdt i oligo medium + GF i 3-4 uker (figur 1C). Vekstfaktor tilbaketrekning fra dyrkningsmediet resulterte i progressivt differensiert kultur av celler med flere prosesser (figur 1D). Strømningscytometri brukes for kvantitativ representasjon av dataene.

Fig. 2a, 2B og 2C viser at majoriteten av nevrale stamceller uttrykte neuroepithelial stamcelle markør nestin, mens bare små subpopulasjoner uttrykte avstamning-restriktive markører som astrocyte markør GFAP (figur 2a), neuronal markør klasse III β-tubulin (figur 2B) eller oligodendrocyte markør O4 (figur 2C). Når kulturmediet ble erstattet med oligo middels + GF og celler ble dyrket i 1 uke, nedsatt nestin uttrykk og økte A2B5 ekspresjon kan observeres (figur 2D). A2B5 er en neuroglial forløper markør. I sammenligning, 2 uker etter middels erstatning ble nestin uttrykk redusert ytterligere og A2B5 ekspresjon alene økte (figur 2E) samt uttrykk av et annet oligodendrocyte markør, O4 (figur 2F). To dager post vekstfaktor tilbaketrekning, økte O4 uttrykket samt ekspresjon av GalC, etsent oligodendrocyte markør (figur 2G). Seks dager etter vekstfaktor tilbaketrekning, økte co-uttrykk for O4 og GalC (figur 2H) og kan sammenlignes med co-uttrykk for GalC og MBP (figur 2I). Den multi-epitop farging avslører at mer enn halvparten av cellene i kultur uttrykker MBP (figur 2J). Ytterligere bevis på PDO differensiering ble karakterisert ved hjelp av en assay immunfluorescens, etter den temporale økning av MBP uttrykk i disse cellene etter vekstfaktor tilbaketrekning (figur 3A-C). Oppsummert, humane føtale nevrale stamceller er i stand til å spre seg i vitro mens opprettholde evnen til å differensiere i 3 store hjernen celletyper (figur 4).

Figur 1
Figur 1. Fase kontrast mikroskopi of (a) neural progenitor celler dyrket i stamfar medium, (B) neural progenitor celler dyrket i oligo medium + GF for en uke oppviser en endret smale, bipolar morfologi, (C) differensierte progenitor-avledede oligodendrocytes vokst for 3 dager i oligo medium etter vekstfaktor tilbaketrekning utstillingen oligodendrocyte morfologi preget av flere prosesser. 20x forstørrelse.

Figur 2
Figur 2 Strømningscytometri analyse av neural stamceller co-uttrykkende forløperen-celle markør Nestin (alle vertikale akser) med:. (A) astrocytic markør GFAP, (B) den neuronale markør β III tubulin, og (C) den oligodendrocytic markør O4, (D) nevrale stamceller dyrkes i en uke i oligo media + GF co-express Nestin og A2B5, (E) nestin og A2B5 co-uttrykk etter to uker med nevrale stamceller vekst i oligo medium + GF (F) A2B5 og O4 co-uttrykk etter to uker med nevrale stamceller vekst i oligo medium + GF, (G) to dager etter vekstfaktor tilbaketrekning, er distinkte oligodendrocyte markører for differensiering, O4 og GalC, uttrykt. Seks dager etter vekstfaktor tilbaketrekking (H) en økt andel av cellene er dobbelt positive for O4 og GalC; (I) dobbel-positive for GalC og MPB, og (J) dobbel-positive for O4 og MBP. AJ er representative for fire uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Indirekte immunofluorescence farging av progenitor-avledede oligodendrocytes for MBP (A) 2 dager, (b) 5 dager, og (C, D) 9 dager etter vekstfaktor tilbaketrekning. (D) utgjør fase bildet av 9 dager kultur i Oligo medium - GF og (E) er en forstørrelse av den hvite boksen på det samme bildet (A, B) 20x forstørrelse, (C, D) 32x forstørrelse..

Figur 4
Figur 4. Skjematisk fremstilling av vår cellekultur modell. Primær, human fosterets hjerne-avledet, multipotential nevrale stamceller sprer in vitro og samtidig opprettholde sin plastisitet. Bruke ulike kultur forhold, kan nevrale stamceller differensiere i nevroner (PDN), astrocytes (PDA) og oligodendrocyte (PUD), som vist ved spesifikk differentiation markører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan man utlede fosterets oligodendrocytes fra primære humane nevrale stamceller og karakterisere deres fenotype med både flowcytometri og immunfluorescens flekker. Utvidelsen og vekst av nevrale stamceller fra foster CNS har vært veldig godt beskrevet 1-4. Imidlertid, å skaffe tilstrekkelige menneskelige oligodendrocytes for in vitro eksperimentering fortsatt vanskelig, selv om det er mulig å identifisere og isolere glial forløpere fra voksen human hvit substans 5-13. Det har vært ulike forsøk i utviklingen av ulike kultur forhold til direkte differensiering av fosterets nevrale stamceller i myelin produserende oligodendrocytes 14-21. Denne protokollen beskriver ytterligere nestin positive nevrale stamceller uttrykker O4 markør (figur 2) når dyrket i 3 uker i et serumfritt medium supplert med utvalgte vekstfaktorer (PDGF-AA, bFGF, Shh og NT-3), that er avgjørende for spredning og overlevelse av oligodendrocyte forløpere 22-24. Fjerning av disse vekstfaktorer i O4 + celler resultert i ytterligere differensiering og uttrykk for myelin komponenter (galactocerebroside og MB). I tillegg sammenfaller uttrykk for oligodendrocyte differensiering markører med morfologiske endringer fra celler som ved første dukket smal og bipolar (figur 1B) til celler som blir multipolar med velutviklede prosesser (figur 1C). Fjerning av vekstfaktorer til ytterligere tillate de siste trinnene av differensiering var basert på studier gjort både i mus og menneske 15,25. Tilstedeværelsen av trijodtyronin (T3) er viktig for overlevelsen og differensiering av oligodendrocytes 26 mens vi observert at fjerning av de fire vekstfaktorene var nødvendig til uttrykk av endelige markører av differensiering. Dette ble sammenlignet med celler holdt i oligo medium + GF etSA kontroll.

Vi er ikke den første til å beskrive den differensiering av multipotent neural stamcellers oligodendrocyte cellene i respons til signaler som Shh og bFGF 24. Tidligere rapporter viser at kortikal oligodendrogenesis begynner rundt 10 uker gestasjonsalder hos mennesker 24 med kapasitet på menneskelige foster oligodendrocytes å myelinate økende proporsjonalt med gestasjonsalder 22. Differensiering av galactocerebroside + og O4 + oligodendrocyte forløper celler fra neural stamceller har vært rapportert med andre trimester fosterets hjerne 21,27. Men disse cellene ikke sprer i fravær av støtte celler inkludert astrocytes og nerveceller, og er tapt raskt over tid i kultur 21. Vårt system støtter dannelsen av GalC + og MBP + celler fra menneskelige foster kultur fra 8 uker svangerskapslengde. Videre kan vi beskrevet at differentiated oligodendrocytes kunne dyrkes in vitro uten behov for støtte celler som astrocytes eller nevroner, men ko-dyrking med nevroner kunne forlenge overlevelsen av de differensierte oligodendrocytes. Enda en fordel av denne protokollen er muligheten for å dyrke en stort antall celler som uttrykker O4 + markør som kan dyrkes og passaged i kultur i uker samtidig som deres fenotype. I dette øyeblikk disse O4 + celler kan skyves videre i det siste trinnet av differensiering når vekstfaktorer fjernet fra mediet. Protokollen er skissert i denne artikkelen tar for seg behovet for oligodendrocyte linjene egnet for in vitro eksperimentering. Dessuten tror vi at identifisering av spesifikke faktorer som induserer differensiering kaskade av nevrale stamceller mot stamfar-avledet oligodendrocyte er viktig for å forstå de cellulære og molekylære mekanismer for utviklingoverganger. Det kan også være et viktig verktøy for å studere demyeliniserende lidelser og virus-vertcellens interaksjoner relatert til patogenesen av menneskelige neurotropisk virus som JCV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program ved National Institutes of Health, NINDS. Forfatterne ønsker å takke alle medlemmene av Laboratory of Molecular Medicine og nevrovitenskap, Rick Dreyfuss for å hjelpe med mikroskopi og Pamela C. sikting for å hjelpe med redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

Tags

Nevrovitenskap utviklingsbiologi medisin Stem Cell Biology Molecular Biology cellebiologi fysiologi avstamning karakterisering nevrale stamceller differensiering cellekultur-modell
Stamfar-avledet Oligodendrocyte Kultur System fra Human fosterets hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monaco, M. C. G., Maric, D.,… More

Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter