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Neuroscience

पूर्वज व्युत्पन्न मानव भ्रूण के मस्तिष्क से oligodendrocyte संस्कृति प्रणाली

Published: December 20, 2012 doi: 10.3791/4274
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

प्राथमिक, मानव भ्रूण के मस्तिष्क व्युत्पन्न, multipotential पूर्वज कोशिकाओं पैदा करना

Protocol

नोट: तंत्रिका पूर्वज और oligodendrocytic वंश कोशिकाओं की दिनचर्या संवर्धन के लिए, गर्मी 37 डिग्री पर एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण में सी में किया जाता है. हर 2 दिन, मध्यम ताजा माध्यम के 50 से 100% का उपयोग अगर संस्कृति 40-70% सहधारा है बदल दिया है. निकट confluency के समय, संस्कृतियों को आम तौर पर एक साप्ताहिक कार्यक्रम 2-2.5e6/T75 फ्लास्क में passaged हैं.

1. लेपित फ्लास्क की तैयारी

  1. तैयार लेपित बोतल विआयनीकृत पानी (डि पानी), तो साथ T75 बोतल के कोट की 100 मिलीलीटर में पाली - डी lysine (PDL) के 5 मिलीग्राम पतला 50 ग्राम / PDL के अंधेरे में कमरे के तापमान (आर टी) में मिली. 1 आधा घंटा के बाद, PDL aspirate और बोतल डि पानी के साथ एक बार कुल्ला. कोशिकाओं (1 टेबल) बोने से पहले सूखी बोतल चलो.

2. पूर्वज व्युत्पन्न oligodendrocytes (PDO) में तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के भेदभाव शुरू

करने के लिए प्रोटोकॉलमानव CNS पूर्वज कोशिकाओं olate पिछले एक प्रकाशन में वर्णित है और यह 1 इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है. मानव CNS पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं एक हमल आठ सप्ताह का भ्रूण के मस्तिष्क, NIH के दिशा निर्देशों के अनुसार प्राप्त की telencephalon से पृथक किया गया.

  1. 25 एनजी / एमएल bFGF और 20 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) (चित्रा 1 ए) के साथ पूरक neurobasal मध्यम में PDL लेपित बोतल पर तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की multipotential आबादी के लिए आगे बढ़ें. का उपयोग अधिक से अधिक 11 (p11) पारित होने अगर उन्हें नहीं है.
  2. शुरू तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को अलग जब संस्कृति लगभग 70% मिला हुआ है.
  3. पूरा भेदभाव oligodendrocyte मध्यम सीरम मुक्त / DMEM HAMS F12 01:01 गोजातीय सीरम albumin एल glutamine, gentamicin, N2 घटकों, T3, श्श्श, NT-3, bFGF, PDGF और ए.ए. (1 टेबल) के साथ पूरक माध्यम का उपयोग कर . इस माध्यम में वृद्धि कारकों (oligo मध्यम GF +) के साथ oligo माध्यम के रूप में परिभाषित किया जाएगा.
  4. Progen निकालेंबोतल से itor मीडिया, कोशिकाओं के साथ एक बार कुल्ला फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस), तो oligo मध्यम जोड़ + GF oligodendrocyte भेदभाव शुरू (2.3 में वर्णित विवरण). केवल oligodendrocytic वंश के लिए प्रतिबद्ध कोशिकाओं (चित्रा 1B) विकसित होगा. 3 सप्ताह के लिए इस माध्यम में कोशिकाओं संस्कृति.
  5. हर सप्ताह, जब कोशिकाओं को 90-95% संगम, मार्ग उन्हें trypsin (0.05%) EDTA (0.1%) (एक T75 कुप्पी के लिए 4 मिलीलीटर) का उपयोग कर रहे हैं. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में passaged कोशिकाओं से पूरे मध्यम स्थानांतरण, इस वातानुकूलित माध्यम trypsin बुझाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. सूखी नहीं बाहर कोशिकाओं के लिए सुनिश्चित करें कि. फिर trypsin जोड़ने के लिए.
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए trypsin में कोशिकाओं सेते हैं, धीरे कुप्पी दोहन कई बार सेल टुकड़ी मदद.
  7. अलग कोशिकाओं के साथ फ्लास्क वातानुकूलित माध्यम के 4-5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बुझा लेते हैं.
  8. एक ही 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब मध्यम और कोशिकाओं स्थानांतरण. (~ 1200 rpm पर मध्यम और कोशिकाओं अपकेंद्रित्र300 XG) आरटी पर 5 मिनट के लिए.
  9. तैरनेवाला Aspirate, सेल गोली resuspend, धीरे ट्यूब tipping, और फिर ताजा oligo + मध्यम GF जोड़ें. धीरे विंदुक मध्यम और कोशिकाओं को और नीचे एक समान सेल निलंबन बनाने के लिए.
  10. प्रत्येक नए PDL लेपित T75 फ्लास्क में कोशिकाओं, और हस्तांतरण 2.5e6 गिनो.

3. Oligodendrocytes के भेदभाव में अंतिम चरण

  1. संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद oligo + मध्यम GF, जब कोशिकाओं को 70-80% के संगम पर हैं, भेदभाव (चित्रा 1C) की अंतिम प्रक्रिया शुरू करते हैं.
  2. Oligo + GF माध्यम के रूप में एक ही रास्ते में लेकिन चार GF जोड़ने के बिना मध्यम तैयार: श्श्श, NT-3, bFGF और PDGF ए.ए.. GF - चार GF बिना इस माध्यम oligo माध्यम के रूप में परिभाषित किया जाएगा.
  3. कुप्पी से oligo + GF मध्यम Aspirate, पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला और फिर जोड़ने के माध्यम की 16 मिलीलीटर की कुल मात्रा, जो ¾ (12 मिलीग्राम) की oligo मध्यम GF और ¼ (4 मिलीलीटर) PDN वातानुकूलित माध्यम है, के लिए 6-10) दिन. PDN से वातानुकूलित माध्यम के उपयोग भेदभाव प्रक्रिया या कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. हम वास्तव में देखा है कि केवल PDN कोशिकाओं के साथ PDO के प्रत्यक्ष सह संस्कृति प्रयोगों में संपर्क पीडीओ अस्तित्व की लंबाई पर एक प्रभाव पड़ा है. oligo मध्यम में अस्तित्व के समय - GF दो या तीन सप्ताह के लिए लंबे समय तक किया जा सकता है अगर PDO कोशिकाओं PDN कोशिकाओं के साथ सह सुसंस्कृत. PDN में मानव तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को अलग प्रोटोकॉल पिछले एक प्रकाशन में वर्णित है और यह 1 इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है. कई प्रक्रियाओं (चित्रा 1D) के साथ कोशिकाओं के उत्तरोत्तर विभेदित संस्कृति में संस्कृति के माध्यम परिणामों से विकास कारक वापसी.

4. प्रवाह cytometry परख

प्रवाह cytometry परख अपने अभिभावकों की आबादी के उन लोगों के साथ रिश्ते में भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान oligodendrocyte मार्करों के अधिग्रहण की तुलना करती है.

  1. तंत्रिका समर्थक का प्रयोग करेंनियंत्रण के रूप में genitors. बीज 2.5x10 6 कोशिकाओं में दो T75 oligo मध्यम + GF में पाली-D-lysine के साथ लेपित बोतल में PDO कोशिकाओं.
  2. एक सप्ताह बाद, सेल व्यवहार्यता के लिए एक नियंत्रण संस्कृति के रूप में बोतल में ताजा oligo + मध्यम GF के साथ मध्यम, की जगह, जबकि अन्य बोतल oligo मध्यम था - GF.
  3. दोनों मीडिया में PDO कोशिकाओं को अलग कर देना 20 यू / मिलीलीटर papain और नहीं trypsin का उपयोग करें. इसका कारण यह है papain पृथक्करण के दौरान कोशिकाओं पर gentler प्रभाव सेलुलर आकारिकी संरक्षण है.
  4. Papain शीशी Earle बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए या जब तक papain पूरी तरह भंग कर रहा है और समाधान स्पष्ट प्रतीत होता है शीशी रखें. इस papain करने के लिए कोशिकाओं को अलग कर देना इस्तेमाल समाधान है.
  5. एक Deoxyribonuclease मैं (DNase) शीशी (1 टेबल) EBSS के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे मिलाएं. भंग papain की शीशी इस समाधान के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें. यह तैयारी लगभग 20 यू / मिलीलीटर papain और 0 के एक अंतिम एकाग्रता.005% DNase.
  6. कोशिकाओं और 15-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते प्लेस पर papain समाधान (जैसा कि ऊपर वर्णित है), एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की टुकड़ी की निगरानी. बंद के साथ या बिना GF और 7 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया.
  7. दोनों बोतल से सेल छर्रों दो अलग 5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूबों में स्थानांतरण और सामान्य शारीरिक मध्यम (एनपीएम: 145 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1.8 मिमी 2 CACL, 10 मिमी HEPES और 10 मिमी ग्लूकोज) के साथ उन्हें धो 1 मिलीग्राम / एमएल के साथ पूरक गोजातीय सीरम albumin (एनपीएम BSA +).
  8. 4 में सतह immunostaining प्रदर्शन ° सी 20 मिनट के लिए O4 A2B5, के लिए विशिष्ट और उचित titrated प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग, GalC (2 तालिका).
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर एनपीएम + BSA के साथ कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए और धो उन्हें विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 20 मिनट (2 तालिका) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  10. सहित nestin, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP), तृतीय वर्ग और intracellular प्रतिजनों दागटा, आरटी पर 20 मिनट के लिए, और ट्यूबिलिन myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) (2 तालिका), 2% paraformaldehyde (पीएफए) में कोशिकाओं और ठीक -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ठंड 70% इथेनॉल के साथ permeabilize
  11. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो और विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं (2 तालिका).
  12. प्रवाह cytometry विश्लेषण के दौरान बरकरार कोशिकाओं और subcellular मलबे के बीच भेदभाव करने के लिए, 4,6 - diamidino 2 - phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के साथ कोशिकाओं को दाग.
  13. ऊपर प्रोटोकॉल के अनुकूलन में, हम सभी उचित नियंत्रण प्रयोगों का प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक immunoreagent की विशिष्टता की पुष्टि. संक्षेप में, सीधे लेबल एंटीबॉडी के लिए, उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण ही immunoglobulin निर्धारण (या subclass) प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, निर्धारण नियंत्रण) के रूप में और fluorochrome संयुग्म वर्ग के एक सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी था. प्राथमिक एंटीबॉडी के अप्रत्यक्ष immunostaining, उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण wमाध्यमिक हित में है कि विशेष रूप से मेजबान जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी उत्पन्न किया गया (या subclass) के immunoglobulin वर्ग को लक्षित fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के रूप में. जब एकाधिक मेजबान (माउस, खरगोश, चिकन) से प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इस्तेमाल किया गया है, हम माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल आम तौर पर अन्य मेजबान से immunoglobulins के खिलाफ पार adsorbed पार करने के लिए कम से कम प्रत्येक मेजबान और प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल की प्राथमिक एंटीबॉडी लक्ष्यीकरण immunoreactivity मेजबानी. सकारात्मक नियंत्रण सेल ब्याज की एंटीजन व्यक्त प्राथमिक इन प्रतिजनों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ या तो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष immunoreactions का उपयोग ज्ञात तैयारी की प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष immunostaining शामिल हैं. ऊपर अनुकूलन तरीकों से बाहर किए गए प्रयोगों immunostaining के प्रत्येक प्रकार के लिए एक बार. नियंत्रण immunoreactions प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के बीच कोई महत्वपूर्ण immunoreactivity पार मिलान से पता चला. प्रवाह cytometry समान पर प्रदर्शन किया गया थानिलंबित fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग कर एक FACVantage एसई सेल सॉर्टर (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) तीन लेज़रों, जो उत्तेजना तरंगदैर्य 488 एनएम, 647 एनएम tuned प्रदान के साथ सुसज्जित है, और एक व्यापक यूवी (351-364 एनएम) (2 चित्रा) .

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख

नोट: immunofluorescence प्रयोगों के लिए, पीडीओ oligo मध्यम + GF या oligo मध्यम में चढ़ाया जाता है - GF 2.5e5 में 6 अच्छी तरह PDL साथ लेपित प्लेट में. कोशिकाओं को 2% पीएफए ​​में वृद्धि कारकों की वापसी के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर तय कर रहे हैं. दाग एंटीबॉडी प्लास्टिक 6 अच्छी तरह से करने के बजाय गिलास प्लेट coverslips पर किया जाता है.

  1. मीडिया निकालें और 2% पीएफए ​​जोड़ें. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. पीएफए ​​त्यागें. कोशिकाओं Pbs, 5 मिनट प्रत्येक समय के साथ 3 बार धोएं. सूखी नहीं कोशिकाओं सावधान रहो.
  2. Intracellular आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% Triton समाधान का उपयोग कर मार्करों के लिए कोशिकाओं Permeabilize.
  3. गैर विशिष्ट बंधन, ब्लॉक कोशिकाओं को रोकने के चया HHG (1 मिमी HEPES बफर, 2% घोड़े सीरम, और 10% हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल में बकरे सीरम) के साथ 10 मिनट. HHG में एक एकाग्रता पूर्व निर्धारित विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी (2 तालिका) पतला. कोशिकाओं पर पतला एंटीबॉडी रखें. हिलनेवाला पर या 4 ° C विकेट पर आरटी पर 1 घंटा सेते हैं.
  4. कोशिकाओं पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए हर बार 3 बार धो लें. उपयुक्त माध्यमिक (2 तालिका) एंटीबॉडी HHG में एक एकाग्रता पूर्व निर्धारित करने के लिए एक fluorochrome के साथ मिलकर पतला. कोशिकाओं पर पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण रखें. अंधेरे में एक प्रकार के बरतन पर सेते हैं 1 घंटा आरटी पर.
  5. कोशिकाओं पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए हर बार 3 बार धो लें.
  6. Photobleaching से बचने के लिए कोशिकाओं को लम्बा DAPI के साथ गोल्ड और उनमें से शीर्ष पर एक गिलास coverslip जगह के 10 μl जोड़ने. लेबल एक Axiovert 200M प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (Zeiss, Thornwood, एनवाई) (3 चित्रा) कोशिकाओं का उपयोग कर कल्पना.

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Representative Results

यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए एक 70% -80% संगामी तंत्रिका पूर्वज सेल संस्कृति (चित्रा 1 ए) से भेदभाव प्रक्रिया शुरू है. कई कोशिकाओं बाहर पूर्वज से oligo मध्यम मध्यम संस्कृति को बदलने के बाद से यह विशिष्ट विकास कारकों में शामिल करने के बाद मर जाएगा. यह इंगित करता है कि तंत्रिका पूर्वज एक oligodendrocytic phenotype के लिए प्रतिबद्ध नहीं है कोशिकाओं के विकास नए मध्यम (चित्रा 1B) द्वारा समर्थित नहीं किया जाएगा. Oligo + मध्यम GF में एक सप्ताह के लिए ऊष्मायन एक मध्यवर्ती संस्कृति में एक संकीर्ण, द्विध्रुवी आकारिकी (चित्रा 1 बी) का प्रदर्शन. कोशिकाओं oligo + (चित्रा 1C) 3-4 सप्ताह के लिए GF मध्यम में रखा जाता है. विकास संस्कृति के माध्यम से वापसी कारक कोशिकाओं की उत्तरोत्तर विभेदित संस्कृति में कई प्रक्रियाओं (चित्रा 1D) के साथ हुई. प्रवाह cytometry डेटा के मात्रात्मक प्रतिनिधित्व के लिए प्रयोग किया जाता है.

2A आंकड़े, 2बी और 2C दिखाना है कि तंत्रिका progenitors के बहुमत neuroepithelial स्टेम सेल मार्कर nestin व्यक्त की है, जबकि केवल छोटे subpopulations astrocyte मार्कर (2A चित्रा) GFAP, neuronal मार्कर वर्ग β-ट्यूबिलिन III (चित्रा 2B) के रूप में वंश प्रतिबंधक मार्करों व्यक्त , या oligodendrocyte O4 मार्कर (चित्रा 2C). जब संस्कृति के माध्यम oligo मध्यम + GF के साथ बदल दिया गया था और 1 सप्ताह के लिए कोशिकाओं सुसंस्कृत थे, nestin अभिव्यक्ति की कमी हुई और वृद्धि हुई अभिव्यक्ति A2B5 (चित्रा 2 डी) देखा जा सकता है. A2B5 एक neuroglial अग्रदूत मार्कर है. इसकी तुलना में, मध्यम बदलने के बाद 2 सप्ताह, nestin अभिव्यक्ति आगे भी कमी आई थी और A2B5 अकेले अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ई) के रूप में एक और oligodendrocyte मार्कर, O4 (चित्रा 2 एफ) की अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि हुई है. दो दिनों के बाद वृद्धि कारक वापसी, O4 अभिव्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GalC की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है, एकदेर oligodendrocyte मार्कर (चित्रा 2 जी). छह दिनों के बाद वृद्धि कारक वापसी, O4 और GalC के सह अभिव्यक्ति (2H चित्रा) में वृद्धि हुई है और सह GalC और MBP (चित्रा 2I) के अभिव्यक्ति के लिए बराबर है. immunostaining बहु मिलान से पता चलता है कि संस्कृति में कोशिकाओं की तुलना में आधे से अधिक MBP (2j चित्रा) व्यक्त कर रहे हैं. PDO भेदभाव के आगे सबूत विशेषता है, एक immunofluorescence परख का उपयोग MBP अभिव्यक्ति के अस्थायी वृद्धि कारक वापसी (चित्रा 3A सी) के बाद इन कोशिकाओं में वृद्धि से. सारांश में, मानव भ्रूण तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए इन विट्रो में पैदा जबकि क्षमता को बनाए रखने के लिए 3 प्रमुख मस्तिष्क कोशिका प्रकार (4 चित्रा) में अंतर करने में सक्षम हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी ओ.च (ए) तंत्रिका पूर्वज पूर्वज माध्यम में संवर्धित कोशिकाओं, (बी) के तंत्रिका पूर्वज एक सप्ताह के लिए oligo + मध्यम GF में विकसित कोशिकाओं एक बदल संकीर्ण, द्विध्रुवी morphology प्रदर्शन, (सी) विभेदित पूर्वज व्युत्पन्न oligodendrocytes oligo मध्यम में 3 दिन के लिए बढ़ी वृद्धि कारक वापसी प्रदर्शनी oligodendrocyte आकारिकी के बाद कई प्रक्रियाओं के द्वारा होती है. 20x बढ़ाई.

चित्रा 2
(बी) neuronal मार्कर β III ट्यूबिलिन, और (सी) oligodendrocytic (ए) astrocytic मार्कर GFAP: 2 तंत्रिका कोशिकाओं के पूर्वज प्रवाह cytometry विश्लेषण सह व्यक्त अग्रदूत सेल मार्कर के साथ (सभी ऊर्ध्वाधर axes) Nestin चित्रा O4 मार्कर, (डी) तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं oligo मीडिया में एक सप्ताह के लिए हो + GF nesti सह एक्सप्रेसn और A2B5, (ई) nestin और A2B5 सह - अभिव्यक्ति oligo + (एफ) GF A2B5 और O4 oligo मध्यम + GF में तंत्रिका progenitors विकास के दो सप्ताह के बाद सह - अभिव्यक्ति मध्यम में तंत्रिका progenitors विकास के दो सप्ताह के बाद, दो (G) वृद्धि कारक वापसी के बाद दिन, भेदभाव के विशिष्ट oligodendrocyte मार्करों, O4 और GalC, व्यक्त कर रहे हैं. वृद्धि कारक वापसी के बाद छह दिन (एच) कोशिकाओं का एक बढ़ा अनुपात O4 और GalC के लिए डबल पॉजिटिव हैं, (मैं) डबल सकारात्मक GalC और MPB के लिए, और (जे) O4 और MBP लिए डबल सकारात्मक. ए जे चार स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 अप्रत्यक्ष immunofluor.MBP (एक) 2 दिन, (बी) 5 दिन, और (सी, डी) 9 वृद्धि कारक की वापसी के बाद दिन के लिए पूर्वज व्युत्पन्न oligodendrocytes escence धुंधला हो जाना. (डी) 9 oligo मध्यम दिनों में संस्कृति के चरण छवि का प्रतिनिधित्व करता है - GF और (ई) एक ही छवि के सफेद बॉक्स के एक इज़ाफ़ा है (ए, बी) 20x बढ़ाई, (सी, डी) 32x बढ़ाई.

चित्रा 4
चित्रा 4 हमारे सेल संस्कृति मॉडल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्राथमिक, मानव भ्रूण के मस्तिष्क व्युत्पन्न, multipotential तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में इन विट्रो पैदा जबकि उनके plasticity बनाए रखने अलग संस्कृति शर्तों का प्रयोग., तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (PDN) न्यूरॉन्स, astrocytes (पीडीए) और oligodendrocyte में अंतर कर सकते हैं (PDO) के रूप में विशिष्ट द्वारा दिखाया differentiatआयन मार्करों.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्राथमिक मानव तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं से भ्रूण oligodendrocytes प्राप्त करने के लिए और उनके phenotype विशेषताएँ दोनों प्रवाह cytometry और immunofluorescence धुंधला हो जाना का उपयोग. और भ्रूण सीएनएस से तंत्रिका progenitors के विस्तार के विकास में बहुत अच्छी तरह से किया गया है 1-4 में वर्णित है. हालांकि, इन विट्रो प्रयोग में लिए पर्याप्त मानव oligodendrocytes प्राप्त करने के लिए मुश्किल बना हुआ है, भले ही यह संभव है की पहचान करने और वयस्क मानव सफेद बात 5-13 से glial व्यापारियों को अलग. Myelin में भ्रूण तंत्रिका progenitors oligodendrocytes 14-21 उत्पादन के प्रत्यक्ष भेदभाव विभिन्न संस्कृति शर्तों के विकास में अलग करने का प्रयास किया गया है. इस प्रोटोकॉल को आगे वर्णन nestin सकारात्मक तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं व्यक्त O4 मार्कर (2 चित्रा) जब एक सीरम मुक्त का चयन विकास (PDGF ए.ए., bFGF, श्श्श, और NT -3) कारकों, टी के साथ पूरक मध्यम में 3 सप्ताह के लिए होटोपी oligodendrocyte 22-24 व्यापारियों के प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं. O4 + कोशिकाओं में इन वृद्धि कारकों के हटाने के आगे और myelin घटकों (galactocerebroside और एमबी) के भेदभाव अभिव्यक्ति में हुई. इसके अलावा, oligodendrocyte भेदभाव मार्कर की अभिव्यक्ति कोशिकाओं है कि पहले से कम संकीर्ण और कोशिकाओं है कि अच्छी तरह से विकसित प्रक्रियाओं (चित्रा 1C) के साथ बहुध्रुवीय हो दिखाई द्विध्रुवी (चित्रा 1B) से morphological परिवर्तन के साथ मेल खाता है. वृद्धि कारकों को हटाने के लिए आगे भेदभाव के अंतिम चरणों की अनुमति दोनों माउस और मानव 15,25 अध्ययन किया पर आधारित था. ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3) की उपस्थिति 26 oligodendrocytes के अस्तित्व और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि हम ने कहा कि चार वृद्धि कारकों को हटाने के भेदभाव के अंतिम मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए जरूरी हो गया था. इस के साथ कोशिकाओं oligo मध्यम + GF में रखा तुलना में किया गया थासा नियंत्रण.

हम श्श्श और bFGF 24 जैसे संकेतों के जवाब में oligodendrocyte कोशिकाओं multipotent तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के भेदभाव का वर्णन करने के लिए पहली बार नहीं कर रहे हैं. पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि cortical oligodendrogenesis आनुपातिक गर्भावधि 22 साल की उम्र के साथ बढ़ रही है myelinate मानव भ्रूण oligodendrocytes की क्षमता के साथ 24 मनुष्यों में 10 सप्ताह gestational उम्र के आसपास शुरू होती है. Galactocerebroside के भेदभाव और O4 + तंत्रिका कोशिकाओं से पूर्वज oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं दूसरी तिमाही भ्रूण 21,27 मस्तिष्क का उपयोग बताया गया है. हालांकि, इन कोशिकाओं astrocytes और न्यूरॉन्स सहित समर्थन कोशिकाओं के अभाव में नहीं पैदा करना है, कर रहे हैं और 21 संस्कृति में समय पर जल्दी खो दिया. हमारी प्रणाली GalC के गठन और MBP + 8 सप्ताह gestational उम्र से मानव भ्रूण संस्कृति से कोशिकाओं का समर्थन करता है. इसके अलावा हम वर्णित है कि differentiated oligodendrocytes astrocytes या न्यूरॉन्स के रूप में कोशिकाओं का समर्थन करने की जरूरत के बिना इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है, हालांकि न्यूरॉन्स के साथ सह - खेती विभेदित oligodendrocytes के अस्तित्व को लंबा कर सकता है. इस प्रोटोकॉल के O4 + मार्कर है कि और विकसित किया जा सकता है सप्ताह के लिए संस्कृति में passaged जबकि उनके phenotype बनाए रखने व्यक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या को खेती के लिए और अधिक लाभ की संभावना है. उस पल में उन O4 + कोशिकाओं भेदभाव के अंतिम चरण में जब वृद्धि कारकों के माध्यम से हटा रहे हैं आगे धक्का दिया जा सकता है. इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल oligodendrocyte इन विट्रो प्रयोग में लिए उपयुक्त प्रजातियों के लिए की जरूरत है पते. इसके अलावा, हमें विश्वास है कि विशिष्ट कारकों की पहचान है कि पूर्वज व्युत्पन्न oligodendrocyte की ओर तंत्रिका progenitors के भेदभाव झरना प्रेरित विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैसंक्रमण. यह भी demyelinating विकारों और वायरस मेजबान सेल बातचीत के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है JCV के रूप में मानव neurotropic वायरस के रोगजनन से संबंधित हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस अनुसंधान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, NINDS पर अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों के लिए संपादन के साथ मदद करने के लिए माइक्रोस्कोपी और पामेला सी. sieving के साथ मदद करने के लिए आण्विक चिकित्सा और तंत्रिका विज्ञान, रिक Dreyfuss की प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

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References

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Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

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