Summary
Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.
Abstract
La perdita della vista colpisce circa 3,4 milioni di persone negli Stati Uniti e dovrebbe aumentare nei prossimi anni. 1 Recentemente, la terapia genica e trapianto di cellule staminali sono diventate fondamentali strumenti terapeutici per la cura della cecità derivante da malattie degenerative della retina. Diverse forme di trapianto autologo di età degenerazione maculare (AMD), come il trapianto di cellule del pigmento epiteliale dell'iride, hanno dato risultati incoraggianti, e studi clinici hanno iniziato ad altre forme di terapie geniche e cellulari staminali. 2 Questi includono RPE65 sostituzione del gene terapia in pazienti con amaurosi congenita di Leber e un trapianto di cellule RPE utilizzando umane staminali embrionali (ES) cellule nella malattia di Stargardt. 3-4 Ora che sono vettori di terapia genica e cellule staminali disponibili per il trattamento di pazienti con malattie retiniche, è importante verificare questi potenziali terapie in modelli animali prima di applicarezione in studi sull'uomo. Il mouse è diventato un importante modello scientifico per testare l'efficacia terapeutica di vettori di terapia genica e trapianto di cellule staminali negli occhi. 5-8 questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per iniettare vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico di l'occhio del mouse riducendo i danni al tessuto circostante.
Protocol
1. Montare dispositivi per l'iniezione sottoretinico
- Acquistare o fare un ago diametro 100 micron da un tubo capillare di vetro. Questo può essere fatto manualmente utilizzando un Sutter P-97 pipetta estrattore o altre apparecchiature simili. L'estremità del tubo capillare viene riscaldato e tirato fino a raggiungere il diametro desiderato (100 micron). Un ago di diametro più piccolo può essere utilizzato per vettori di terapia genica, tuttavia, questo è il diametro raccomandato per l'iniezione delle cellule senza danni alle cellule o l'occhio. Rispetto agli aghi di acciaio, l'ago capillare di vetro ha una punta molto fine, ma smussato, per consentire la visualizzazione del fluido di iniezione e l'accesso allo spazio sottoretinico senza provocare rotture retiniche. Pulire questi aghi tirati, se necessario, si usa il 70% di etanolo, e conservare in un contenitore sterile. A cm 15 sterile piatto di coltura tissutale con nastro per tenere gli aghi in posizione è un modo in cui per mantenere gli aghi di iniezione coperto e in ambiente sterile. A questo punto, complete il set-up all'interno della sala chirurgica in cui la procedura avrà luogo. E 'più facile mantenere tutte le apparecchiature in sala operatoria in ogni momento in modo che esso rimanga sterile, soprattutto se questa procedura viene effettuata all'interno di una struttura barriera.
- Aspirare silicone nell'ago iniezione ed espellere il silicone per lasciare un rivestimento lungo le pareti interne dell'ago. Il rivestimento siliconico massimizza il passaggio di cellule e virus attraverso il foro dell'ago, che altrimenti si attaccano alle pareti interne dei capillari di vetro.
- Ottenere un circa 8 cm di lunghezza del tubo di plastica sterile, tagliando a 25 ¾ calibro di raccolta del sangue insieme con luer-lock nel punto subito dopo l'ago (rimuovere l'ago dal tubo).
- Riempire una ml 1 Sub-Q 26 5/8-gauge slip-siringa con soluzione salina sterile e rimuovere l'ago dalla siringa.
- Attaccare l'ago dell'iniezione al fine taglio del tubo in plastica e collegare la siringa al luer-lock all'altrafine.
- Aspirare soluzione salina sterile per riempire lo spazio morto nel tubo dell'ago e capillare, espellendo alcuni salina attraverso l'ago per assicurare che esso sia collegato correttamente senza perdite. Successivamente, aspirare una piccola, circa 1 quantità microlitri di aria, nella punta dell'ago di iniezione. Questo separerà la soluzione salina dal fluido di iniezione e di fornire un segnale visivo che indica la fine del fluido di iniezione durante la procedura chirurgica. Il dispositivo di iniezione deve essere mantenuto su una superficie pulita pulito con etanolo al 70% durante la procedura chirurgica. Inoltre, tutte le attrezzature usate durante la procedura chirurgica deve essere pulito prima e dopo con etanolo 70%, per l'eccezione degli aghi di iniezione che dovrebbe già essere mantenuta sterile e pronta per l'uso. Questi aghi devono essere smaltiti dopo l'intervento chirurgico, e non riutilizzati.
- Infine, aspirare soluzione iniettabile contenente il desiderato confezionato vettore terapia genica virale o cellule staminali. Questo può essere fattoriprendendo la soluzione iniettabile in una punta di pipetta sterile, quindi pipettare la soluzione sulla superficie di un recipiente sterile coltura cellulare. La soluzione può essere facilmente aspirato nel ago per iniezione con la siringa. La quantità necessaria varierà a seconda dell'età del mouse. Per i nostri scopi usiamo postnatali giorno 5 topi, che può essere iniettato con 0,5-0,8 ml di fluido di iniezione. Piccole quantità, 0,5 microlitri o meno, possono essere utilizzati per topi più giovani e grandi quantità, come 1 ml, può essere utilizzato per topi adulti. Il titolo virale o numero di celle deve essere determinato in base alle cellule / virus viene iniettato e il loro tessuto bersaglio desiderato, come troppe particelle virali o cellule in un piccolo volume può portare a tossicità per le cellule della retina. Nel video, per scopi di visualizzazione, abbiamo utilizzato 1,5 microlitri, una maggiore quantità di colorante del necessario per iniettare nell'occhio.
2. Accesso spazio sottoretinico
- All'interno della camera sterile chirurgica,stabilizzare o anestetizzare il mouse secondo il protocollo approvato animale localmente manipolazione, che variano per età del mouse. Anestesia comune per topi adulti include l'uso di gas isoflurano o una iniezione intraperitoneale di 0,1 peso corporeo ml/10g di ketamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) in soluzione fisiologica sterile. Per topi perinatali, tecniche di anestesia comuni includono l'uso di gas isoflurano o cryoanesthesia (ipotermia). Tutte le tecniche di anestesia deve essere approvato dal comitato locale IACUC prima dell'uso. Usiamo tipicamente post-natale giorni (P) 5 topi, sebbene le tecniche simili possono essere applicate a topi giovani come P0 o per topi adulti. La procedura chirurgica non può iniziare fino a quando il mouse ha smesso muovere gli arti e non risponde più ai piedi pizzichi. Per i topi perinatali, diventeranno notevolmente di colore più chiaro in quanto il flusso di sangue rallenta, un altro tasto per sapere che sono completamente sotto anestesia.
- Nei topi perinatali, usare le forbici Vännäs rette a make una incisione di circa 1,5 mm lungo la fessura coperchio chiuso. Fare attenzione a tagliare il rientro, dove l'occhio, naturalmente, aperto in futuro. Questo assicura che i coperchi guarirà e aprire correttamente durante lo sviluppo del mouse. Una lama chirurgica può essere usato per questo scopo, anche se preferiamo forbici Vännäs quanto riducono il rischio di puntura nell'occhio durante questa procedura. Nel video, le forbici sono state utilizzate per perforare e tagliare direttamente lungo il margine palpebrale. Quando imparare questa tecnica, pinza deve essere usato per sollevare la palpebra prima del taglio e ridurre il rischio di danneggiare l'occhio.
- Separare le palpebre con una pinza medicazione curve per proptose l'occhio e pizzicare le palpebre un po 'sotto l'occhio di tenerlo proptosed per l'iniezione. Se il coperchio incisione fatta nel passaggio due è troppo grande, l'occhio scivolare indietro sotto le palpebre e impedire l'esposizione adeguata durante la procedura di iniezione. Per i topi adulti, applicando una leggera pressione intorno all'occhio con il dressing pinza può tenere l'occhio proptosed per l'iniezione.
- Fai una piccola incisione sclerale uguale o posteriore al equatore del globo da parte di graffiare la superficie con una lama di 15 gradi microchirurgia. Questa incisione dovrebbe essere solo abbastanza grande per passare la punta dell'ago di iniezione, ma non più grande di questo. Se preferito, un piccolo ago appuntito come un ago di agopuntura può essere usato per fare questa incisione nello spazio sottoretinico posto della lama microchirurgia. Negli animali scura, un marrone scuro pigmentato tessuto (coroide-dell'epitelio pigmentato retinico) diventerà visibile nel punto di incisione. In più leggeri topi pigmentati o albino, una penna chirurgica marcatura può essere applicato alla punta della lama microchirurgia lasciare un posto inchiostro indica il sito di incisione. Se chiare (vitreo) riflussi di fluido dal sito di incisione, la lama è stata posta troppo in profondità ed è entrato nella cavità vitrea e il virus terapeutico o cellule possono entrare nello spazio durante l'iniezione intravitreale. Per visualizatisulla scopi, abbiamo fatto l'incisione a questo punto del video. È ancora possibile eseguire una iniezione sottoretinico in questo caso però il distacco di retina causato dalla presenza del liquido di iniezione non può guarire completamente in questo mouse. Pertanto, occorre prestare attenzione a tagliare solo la superficie esterna dell'occhio e non attraverso la retina prima dell'iniezione.
- Inserire con attenzione l'ago iniezione nel sito di incisione e farlo avanzare parallelamente alla parete esterna dell'occhio per entrare nello spazio sottoretinico. Avanzando troppo vicino alla parete esterna o troppo in profondità all'interno dell'occhio dirigerà l'iniezione nella posizione sbagliata. Il metodo migliore per capire se l'ago si trova nella posizione corretta è quello di praticare la tecnica. Praticare su topi leggermente pigmentate o albino può contribuire a rendere iniezioni precisi ed accurati nello spazio sottoretinico. Questo perché il fluido dell'ago e l'iniezione è visibile all'interno di questi occhi.
- Applicare una leggera pressione lo stantuffo della siringa e di esseregin iniezione del fluido desiderato. Se l'ago è posizionato correttamente nello spazio sottoretinico, contropressione moderato si faranno sentire. Se l'ago si trova all'interno del vitreo, ci sarà significativamente meno contropressione e potenzialmente alcuni riflusso del fluido durante l'iniezione. In caso di contropressione significativa, tenere l'ago in posizione per almeno altri 15 secondi prima di estrarre l'ago lentamente. Ciò permetterà l'alta pressione intraoculare per equalizzare anziché riflusso del virus o cellule iniettate indietro il sito di incisione. Parte dell'aria e soluzione salina può essere iniettato nello spazio sottoretinico a causa della maggiore pressione richiesta durante la procedura di iniezione. Si deve prestare attenzione a non sovra iniettare aria o soluzione salina, poiché può scovare iniettato il virus o cellule dall'occhio. È anche possibile far sì permanenti distacco di retina dalla presenza di liquidi troppo iniettato nello spazio sottoretinico. Per scopi di visualizzazione, il colorante in eccesso e l'aria è stata iniettata into spazio sottoretinico nel video. Si vede chiaramente come alcuni del colorante viene lavata posteriore dallo spazio sottoretinico se troppo è iniettato, ma anche come la bolla d'aria rimane all'interno dello spazio sottoretinico e non scompare nel vitreo. Questo è stato usato per sottolineare che queste iniezioni erano tutti nella corretta posizione degli occhi, così si può visualizzare come l'ago deve entrare nel sito di incisione. Tutte le iniezioni nello spazio sottoretinico provocare un distacco della retina temporanea per la presenza del liquido di iniezione. Se la procedura di iniezione è completato correttamente, questo distacco di retina temporanea guarirà entro 24 ore e topi possono essere utilizzati per tutti i successivi esperimenti. L'occhio può rimanere morbido per circa una settimana a causa della procedura chirurgica, quindi una seconda iniezione deve essere evitato durante questo periodo di tempo.
- Per i topi neonati, utilizzare le pinze medicazione curve per spingere delicatamente l'occhio dietro le palpebre e nell'orbita. Può essere utileattendere per un minuto al fine di consentire al virus di stabilirsi nello spazio sottoretinico e non farla essere lavata dal sito di incisione quando spingendo leggermente l'occhio nella sua orbita. Dopo l'intervento chirurgico, una goccia di bupivacaina 0,5% (Marcaine) diluito al 0,25% in soluzione salina sterile da un ago calibro 25 può essere posizionato nel sito di iniezione. I topi non mostrano evidenti segni di sofferenza dopo l'intervento chirurgico sottoretinico e l'uso di bupivacaina come una lunga durata d'azione analgesico topico è stato sufficiente per i tre anni precedenti. I topi devono sempre essere monitorati dopo l'intervento chirurgico alla ricerca di eventuali segni di sofferenza, come infezioni, gonfiore, o una diminuzione delle attività quotidiane del mouse. Se questi si verificano, il veterinario deve essere notificata e altri farmaci per il dolore come la buprenorfina (0,05 mg / kg) può essere somministrato con una iniezione intraperitoneale.
- Wake il mouse dall'anestesia secondo il protocollo animale localmente riconosciuto. Il mouse deve essere mantenuto su una p riscaldamentoannuncio a mantenere la temperatura corporea normale, come si sveglia dall'anestesia. La procedura chirurgica dovrebbe richiedere meno di cinque minuti per completare, senza contare il tempo per il mouse a subire l'anestesia. Pertanto, una piastra elettrica non è necessario durante la procedura attuale, ma può essere necessaria quando si sta imparando la tecnica come la procedura potrebbe richiedere un periodo di tempo più lungo. Il mouse non deve essere rimesso in una gabbia pulita fino a quando non ha cominciato a muoversi da solo. Per i neonati, pizzichi punta dolci per aiuterà a recuperare pienamente l'anestesia, e dovrebbero riprendere il loro colore rosa e il movimento prima di essere indietro con la madre. I topi devono essere monitorati nel tempo per rilevare eventuali segni di sofferenza come indicato in precedenza.
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Representative Results
Un disegno dell'occhio del mouse viene visualizzata con le strutture principali etichettati come riferimento, con le frecce che mostrano le posizioni per le procedure di iniezione sia intravitreali e sottoretinico chirurgici (punte di freccia, figura 1). Vettori di terapia genica, quali il vettore lentivirale lacZ (Figura 2), può essere iniettato usando queste posizioni. Inoltre, le cellule staminali di topo, come le cellule staminali embrionali (Figura 3), possono anche essere trapiantate in questi siti nell'occhio mouse.
1 ml di un vettore lentivirale porta il gene reporter lacZ guidata dal promotore del citomegalovirus (CMV) (1x10 8 TU / ml, Lentigen Corporation, Figura 2A) è stato iniettato nello spazio sottoretinico di topi C57BL/6J. Occhi sono stati enucleati a sei settimane di età per via smussa e immerso in 1 mg / ml di X-gal soluzione (5 mM K 3 Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP 40, e 0.1% di sodio desossicolato) notte a 37 ° C. Occhi sono stati fissati in glutaraldeide al 2% formaldehyde/0.2% per 30 min e sezionata con un microtomo. Espressione gene reporter lacZ è stato rilevato come X-gal prodotto (blu) in circa il 10% delle cellule fotorecettrici (Figura 2B). La presenza di espressione intracellulare lacZ e dei tessuti circostanti intatti l'iniezione di successo sottoretinico nell'occhio mouse.
C57BL/6J topo staminali embrionali (ES), le cellule sono state marcate con una proteina fluorescente verde (eGFP, Wellcome Trust Sanger Institute). Queste cellule sono state quindi raccolte e sospese in sterile PBS e trapiantati nello spazio sottoretinico di post-natale giorni (P) 5 topi C57BL/6J, con circa 1x10 5 cellule iniettate per 1 pl. Gli occhi sono stati enucleati a due settimane di età per via smussa, fissato in un gradiente di saccarosio e congelato nel mezzo di inclusione OCT (Tissue-Tek). Gli occhi sono stati sezionati e vis ualized al microscopio a fluorescenza (Zeiss). La presenza di GFP marcati cellule ES si trovano nello spazio sottoretinico dell'occhio topo iniettato (Figura 3A). Inoltre, C57BL/6J-Tyr c-2j / J (C2J) topo staminali embrionali (ES) cellule sono state elettroporate con giallo proteina fluorescente (YFP) e differenziato in pigmenti retinici epiteliali (RPE) cellule in vitro. Dopo un mese di differenziazione, le YFP-RPE-etichettati come C2J cellule ES sono state sospese in sterile PBS e iniettato nello spazio sottoretinico di topi C57BL/6J P5. A 15 settimane di età, un topo è stata visualizzata usando vivo-imaging di autofluorescenza per la presenza di YFP all'interno della retina (Scanning Laser Spectralis Oftalmoscopio confocale, Heidelberg Engineering, Figura 3B).
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Figura 1. Schematica della Eye Mouse. Un disegno vignetta raffigurante le strutture dell'occhio mouse con i siti per le procedure di iniezione sia intravitreali e sottoretinico contrassegnati con (punte di freccia).
Figura 2. Iniezione sottoretinico di un vettore terapia genica virale. A. Lentivirus vettore planimetrico gene reporter lacZ guidata dal promotore del citomegalovirus (CMV). B. Espressione del gene reporter lacZ nella retina in un topo sei C57BL/6J settimana fa dopo l'iniezione sottoretinico al post-natale cinque giorni. RGC, le cellule gangliari retiniche, INL, strato nucleare interno, IS, segmenti interni dei fotorecettori (freccia); ONL, strato esterno nucleare (fotorecettori) (punta di freccia), sistema operativo, dei fotorecettori segmenti esterni.
Figura 3. Iniezione sottoretinico mouse embrionali staminali (ES) cellule. A. A due C57BL/6J topo settimana fa dopo l'iniezione sottoretinico proteina verde fluorescente (GFP) marcate con cellule staminali embrionali a livello post-natale di cinque giorni. GFP-positive cellule sono visibili nello spazio sottoretinico dell'occhio iniettato mediante microscopia a fluorescenza (Zeiss). Green, GFP-etichettata cellule ES (frecce), RGL, strato della retina ganglio, INL, strato interno nucleare; ONL, strato nucleare esterno (fotorecettori), IS / OS, i segmenti fotorecettori interni ed esterni, RPE, l'epitelio pigmentato retinico. B. A 15 settimana fa C57BL/6J retina di topo mostrato con autofluorescenza live-imaging (Spectralis oftalmoscopio laser a scansione confocale, Heidelberg Engineering) per la presenza di giallo proteina fluorescente (YFP) marcati con RPE-come C2J cellule staminali embrionali di topo all'interno della retina.Iniezione sottoretinico delle RPE-come YFP-ES cellule è stata effettuata a livello post-natale di cinque giorni.
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Discussion
Questa tecnica video fornisce istruzioni su come completare la procedura chirurgica sottoretinico iniezione successo, e garantire che il vettore terapia genica o le cellule staminali sono collocati nella posizione necessaria per trattare efficacemente la malattia oftalmica. Questa tecnica permette di targeting di cellule retiniche quali la RPE o fotorecettori, in quanto pone i vettori per terapia genica o cellule staminali derivate da tessuti in prossimità di queste cellule. I metodi precedenti coinvolti iniezioni intravitreali, dove si trova il fluido all'interno della cavità vitreale e deve migrare attraverso la retina, al fine di indirizzare queste aree specifiche. Iniezione intravitreale riduce la trasduzione di vettori di terapia genica che i fotorecettori di destinazione o l'RPE, dal momento che non tutte le particelle virali migrerà nella posizione corretta. Inoltre, le cellule staminali stanno diventando sempre più popolare per sostituire RPE malato o fotorecettori, e queste cellule differenziate devono essere trapiantate all'interno del subspazio retinica. 5
Il passaggio critico in questa procedura è entrata nello spazio sottoretinico, poiché garantisce la corretta posizione di vettori di terapia genica o cellule staminali derivate da tessuti per avere efficacia terapeutica, insieme riducendo il potenziale per distacco di retina o danni all'occhio circostante tessuto. Si deve prestare attenzione per risolvere in anticipo, per essere in grado di individuare e iniettare il liquido nello spazio sottoretinico. Questo può essere fatto attraverso la pratica utilizzando colorante e topi albini, come mostrato nel video, in quanto l'ago di iniezione non saranno visibili all'interno dell'occhio di topi pigmentate. Dopo la pratica, il ricercatore, di imparare a sentire la differenza di pressione quando il fluido è posizionato correttamente nello spazio sottoretinico e stare bene con la procedura chirurgica per completarla in modo tempestivo.
Vi sono alcune modifiche potenziali per questa procedura chirurgica. Queste iniezioni possono effettuareed in topi di età diverse, anche se la quantità di vettori di terapia genica o cellule staminali derivate da tessuti iniettati potrebbe variare a seconda dell'età del mouse. Si deve prestare attenzione per determinare la quantità di fluido promuoverà trattamento per la malattia oftalmica, ma non prolungare distacco e danni alla retina. L'ago tirato capillare può essere modificato per avere diametri diversi. Piccoli aghi sono sufficienti per iniezioni virali, ma che diametri maggiori possono essere meglio per il trapianto cellulare. Inoltre, l'intervento può essere eseguito su topi adulti. La densità del tessuto oculare sarà molto maggiore, così fresche, lame taglienti chirurgiche sono necessari per penetrare nello spazio sottoretinico. In tutti i casi, le modifiche possono essere effettuate sulla base di questo protocollo per completare una iniezione di successo sottoretinico un vettore terapia genica o cellule staminali tessuto-derivato.
Tutte le iniezioni sottoretiniche provoca un distacco di retina temporanea per la presenza del fluido iniettato all'internospazio sottoretinico, ma questo distacco dovrebbe guarire entro 24 ore dalla procedura chirurgica. Topi possono essere accuratamente controllate sotto un microscopio per qualsiasi distacco rimanente. E 'possibile che alcuni tipi di mouse potrebbero non guarire naturalmente anche dopo un ben piazzato iniezione. Tutti i topi sono in grado di subire l'esame e seguenti esperimenti presente 24 ore periodo di tempo, tuttavia l'occhio può essere molle a causa di un cambiamento nella pressione dalla procedura di iniezione fino ad una settimana. Pertanto, una limitazione di questa tecnica è la capacità di eseguire iniezioni secondarie durante la prima settimana postoperatoria. Un'altra iniezione può non essere possibile durante il periodo postoperatorio, poiché l'incidenza di distacco retinico che non guarisce dopo chirurgia è aumentata. Si consiglia di attendere per un periodo di tempo più lungo, finché un mese, prima della re-iniettare l'occhio mouse.
Il mouse è diventato un importante organismo modello per studiare le malattie oftalmiche e potenziali terapie tcappello porterà a test clinici. 9-12 Una seconda limitazione di questa procedura è che non tutte le cellule vengono trasfettate con vettori di DNA dopo l'iniezione sottoretinico, come sarebbero in un modello di topo transgenico. Tuttavia, questa procedura può più simile a procedura clinica nell'uomo dove non trasfettate ogni cellula. Pertanto, questa tecnica può aiutare a stabilire la fattibilità di vettori di terapia genica virale o di cellule staminali di derivazione terapia il trapianto di tessuti per il trattamento di età degenerazione maculare e altre malattie vitreoretinica negli esseri umani. Le future applicazioni possono includere l'uso di diversi promotori di cellule della retina e le cellule staminali differenziate, o anche iniezioni multiple utilizzando una combinazione di trattamenti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La ricerca per prevenire la cecità, l'assistenza sperimentale da Takayuki Nagasaki; Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva. KJW è supportato da sovvenzioni NIH 5T32EY013933 e 5T32DK007647-20. VBM è sostenuto da NIH sovvenzione K08EY020530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
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