Summary
Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.
Abstract
La pérdida de visión afecta aproximadamente a 3,4 millones de personas en los Estados Unidos y se espera que aumente en los próximos años. 1 Recientemente, la terapia génica y el trasplante de células madre se han convertido en importantes herramientas terapéuticas para el tratamiento de la ceguera como resultado de las enfermedades degenerativas de retina. Varias formas de trasplante autólogo para la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), como iris trasplante de células del epitelio pigmentario, han generado resultados alentadores, y los ensayos clínicos humanos han comenzado a otras formas de terapias con células madre y genes. 2 Estos incluyen RPE65 sustitución de genes terapia en pacientes con amaurosis congénita de Leber y un trasplante de células RPE humanas usando madre embrionarias (ES) de células en la enfermedad de Stargardt. 3-4 Ahora que hay vectores de terapia génica y células madre disponibles para el tratamiento de pacientes con enfermedades de la retina, es importante verificar estas terapias potenciales en modelos animales antes de aplicarIng. ellos en estudios con humanos. El ratón se ha convertido en un importante modelo científico para probar la eficacia terapéutica de los vectores de terapia génica y trasplante de células madre en el ojo. 5-8 En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para inyectar vectores de terapia génica o células madre en el espacio subretiniano de el ojo del ratón mientras que minimiza el daño al tejido circundante.
Protocol
1. Montar dispositivos para la inyección subretiniana
- Compre o haga una aguja de 100 m de diámetro de un tubo capilar de vidrio. Esto se puede hacer manualmente mediante el uso de un Sutter P-97 extractor de pipeta u otro equipo similar. El extremo del tubo capilar se calienta y se retiró hasta que alcanza el diámetro deseado (100 micras). Una aguja de diámetro más pequeño se puede utilizar para vectores de terapia génica, sin embargo, este es el diámetro recomendado para la inyección de células sin daño a las células o al ojo. En comparación con agujas de acero, la aguja capilar de vidrio tiene una punta muy fina, pero romo, para permitir la visualización de la inyección de fluido y el acceso al espacio subretiniano sin causar la rotura retiniana. Limpie estas agujas tiradas si es necesario el uso del 70% de etanol, y guárdelo en un recipiente estéril. A 15 cm estéril placa de cultivo de tejido con cinta adhesiva para sujetar las agujas en su lugar es una forma en que para mantener las agujas de inyección cubierto y en un ambiente estéril. En este punto, complete la puesta a punto dentro de la sala de operaciones donde el procedimiento se llevará a cabo. Es más fácil mantener todo el equipo en la sala quirúrgica en todo momento con el fin de que siga siendo estéril, sobre todo si este procedimiento se realiza dentro de una instalación de barrera.
- Aspirar de silicona a la aguja de inyección y expulsar la silicona para dejar un revestimiento a lo largo de las paredes internas de la aguja. El revestimiento de silicona maximiza el paso de células y virus a través del orificio de agujas, que de otro modo se pegan a las paredes capilares de vidrio interiores.
- Obtener una longitud de aproximadamente 8 cm de tubo de plástico estéril mediante la reducción de un 25 ¾ de calibre de recogida de sangre con luer-lock en el punto directamente después de la aguja (retirar la aguja de la tubería).
- Llenar un 1 ml Sub-Q-26 5/8-gauge deslizamiento punta de la jeringa con solución salina estéril y retirar la aguja de la jeringa.
- Coloque la aguja de inyección en el extremo cortado de la tubería de plástico y unir la jeringa al luer-lock en el otrofinal.
- Aspirar solución salina estéril para llenar el espacio muerto de la aguja y el tubo capilar, expulsando algunos salina a través de la aguja para asegurarse de que esté correctamente colocado sin fugas. A continuación, se aspira una pequeña cantidad de aproximadamente 1 l de aire, en la punta de la aguja de inyección. Esto separa la solución salina desde el fluido de inyección y proporcionar una señal visual que indica el final de la inyección de fluido durante el procedimiento quirúrgico. El aparato de inyección debe mantenerse en una superficie limpia limpiados con etanol al 70% durante el procedimiento quirúrgico. Además, todo el equipo usado durante el procedimiento quirúrgico se debe limpiar antes y después con etanol al 70%, para la excepción de las agujas de inyección que ya debe mantenerse estéril y listo para su uso. Estas agujas deben desecharse después de la cirugía, y no volver a utilizarse.
- Finalmente, aspirar solución inyectable que contiene el vector empaquetado deseado terapia génica viral o células madre. Esto se puede hacer portomando la solución de inyección en una punta de pipeta estéril, y después de pipeteado de la solución sobre la superficie de una placa de cultivo celular estéril. La solución puede ser fácilmente trasladada a la aguja de inyección con la jeringa. La cantidad necesaria variará dependiendo de la edad del ratón. Para nuestros propósitos utilizar post-natales día 5 ratones, que pueden ser inyectados con 0.5-0.8 l de fluido de inyección. Las cantidades más pequeñas, l 0,5 o menos, pueden ser utilizados para ratones más jóvenes y cantidades mayores, tales como 1 l, se puede utilizar para ratones adultos. El título viral o el número de células tiene que ser determinado con base en el virus / células se inyectan y el tejido objetivo deseado, como partículas virales de más o de células en un volumen pequeño puede conducir a la toxicidad para las células de la retina. En el vídeo, para propósitos de visualización, se han utilizado 1,5 l, una mayor cantidad de colorante que es necesario inyectar en el ojo.
2. Acceso al espacio subretiniano
- Dentro de la sala quirúrgica estéril,estabilizar o anestesiar al ratón de acuerdo con el protocolo de manipulación de animales aprobado localmente, que varían según la edad del ratón. Anestesia común para ratones adultos incluye el uso de gas isoflurano o una inyección intra-peritoneal de 0,1 ml/10g peso corporal de ketamina (100 mg / ml) y xilazina (20 mg / ml) en solución salina estéril. Para los ratones perinatales, las técnicas comunes de anestesia incluyen el uso de gas isoflurano o crioanestesia (hipotermia). Todas las técnicas de anestesia debe ser aprobado por el comité local de IACUC antes de su uso. Por lo general el uso post-natal días (P) 5 ratones, aunque técnicas similares puede ser aplicada a los ratones tan jóvenes como P0 o ratones adultos. El procedimiento quirúrgico no puede comenzar hasta que el ratón ha dejado de mover las extremidades y ya no responde a los pies pellizcos. Para los ratones perinatales, se vuelven notablemente más ligero en color, ya que el flujo de sangre se ralentizará, otra de las claves para saber que están completamente bajo anestesia.
- En ratones perinatales, use tijeras Vannas consecutivos para make un aproximado de 1,5 mm de incisión a lo largo de la fisura tapa cerrada. Tenga cuidado de cortar a la sangría, donde el ojo naturalmente se abrirá en el futuro. Esto asegura que las tapas se cura y abrir correctamente durante el desarrollo del ratón. Una cuchilla quirúrgica puede ser utilizado para este propósito, aunque preferimos tijeras de Vannas ya que reducen el riesgo de perforar el ojo durante este procedimiento. En el video, las tijeras se utilizan para pinchar directamente y corte a lo largo del borde del párpado. Cuando el aprendizaje de esta técnica, el fórceps se debe utilizar para levantar el párpado antes de cortar y reducir el riesgo de dañar el ojo.
- Separar los párpados con pinzas curvas para vestirse proptose los ojos y apretar los párpados ligeramente por debajo del ojo para mantenerlo proptosed para inyección. Si la incisión tapa hecha en el paso dos es demasiado grande, el ojo se deslice de nuevo bajo las tapas y prevenir la exposición adecuada durante el procedimiento de inyección. Para los ratones adultos, aplicando una ligera presión alrededor de los ojos con el Dr.essing fórceps puede mantener el ojo proptosed para inyección.
- Hacer una pequeña incisión escleral en o posterior al ecuador del globo por el rascado de la superficie con una cuchilla de microcirugía 15-grado. Esta incisión debe ser suficientemente grande para pasar la punta de la aguja de inyección, pero no más que eso. Si se prefiere, una aguja pequeña, afilado tal como una aguja de acupuntura se puede utilizar para hacer la incisión en el espacio subretiniano en lugar de la hoja de microcirugía. En los animales con pigmentación oscura, de color marrón oscuro-pigmentada tejido (la coroides-epitelio pigmentario retinal) se hará visible en el punto de incisión. En más ligeros ratones pigmentados o albino, un rotulador quirúrgico de marcado puede ser aplicado a la punta de la hoja de microcirugía para dejar una mancha de tinta que indica el lugar de la incisión. Si transparente (vítreo) reflujos de fluido desde el lugar de la incisión, la cuchilla se coloca demasiado profunda y entró en la cavidad vítrea y el virus terapéutico o células pueden entrar en el espacio durante la inyección intravítrea. Para visualizatien fin, hemos hecho la incisión hasta este punto en el video. Todavía es posible completar una inyección subretiniana en este caso, sin embargo, el desprendimiento de la retina causado por la presencia del fluido de inyección no puede curarse completamente en este ratón. Por lo tanto, se debe tener cuidado para cortar solamente la superficie exterior del ojo y no a través de la retina antes de la inyección.
- Con cuidado, inserte la aguja en el sitio de la incisión y avanzar en paralelo a la pared externa del ojo para entrar en el espacio subretiniano. Avanzando demasiado cerca de la pared exterior o demasiado profundo dentro del ojo vaya a dirigir la inyección en el lugar equivocado. El mejor método para comprender si la aguja está en la ubicación correcta es practicar la técnica. Practicar en ratones ligeramente pigmentadas o albino puede ayudar a que las inyecciones precisas y exactas en el espacio subretiniano. Esto es porque el fluido de la aguja y la inyección es visible dentro de estos ojos.
- Aplique una leve presión sobre el émbolo de la jeringa ygin inyección del fluido deseado. Si la aguja está colocada correctamente en el espacio subretiniano, la contrapresión moderado se sentía. Si la aguja está dentro del vítreo, habrá contrapresión significativamente menor y potencialmente algo de reflujo del fluido durante la inyección. Si hay contrapresión importante, mantenga la aguja en su lugar por lo menos durante otros 15 segundos antes de retirar la aguja lentamente. Esto permitirá que la alta presión intraocular para igualar en lugar de a reflujo el virus inyecta o células de nuevo fuera del sitio de la incisión. Parte del aire y la solución salina puede ser inyectado en el espacio subretiniano debido al aumento de la presión requerida durante el procedimiento de inyección. Se debe tener cuidado de no sobre-inyectar aire o solución salina, ya que puede eliminar el virus inyecta o células del ojo. También es posible hacer que el desprendimiento de retina permanente de la presencia de demasiado líquido inyectado en el espacio subretiniano. Para fines de visualización, el exceso de tinte y se inyectó aire into el espacio subretiniano en el vídeo. Se puede ver claramente cómo parte del tinte se enjuaga de nuevo fuera del espacio subretinal si se inyecta demasiado, sino también cómo la burbuja de aire permanece dentro del espacio subretinal y no desaparece en el vítreo. Esto se utiliza para enfatizar que estas inyecciones eran todos a la ubicación correcta de los ojos, así que uno puede visualizar cómo la aguja debe entrar en el sitio de la incisión. Todas las inyecciones en el espacio subretiniano causar un desprendimiento de retina temporal debido a la presencia del fluido de inyección. Si el procedimiento de inyección se ha completado correctamente, este desprendimiento de retina temporal se cura dentro de 24 horas y los ratones pueden ser utilizados para todos los experimentos posteriores. El ojo puede permanecer suave durante aproximadamente una semana debido a la intervención quirúrgica, por lo que una segunda inyección se deben evitar durante este período de tiempo.
- Para los ratones recién nacidos, utilice las pinzas curvas aderezo para empujar suavemente el ojo detrás de los párpados y en la órbita. Puede ser útilesperar un minuto con el fin de permitir que el virus a establecerse dentro del espacio subretinal y no causar que sea purgada del sitio de la incisión cuando se presiona suavemente el ojo de vuelta a su órbita. Después de la cirugía, una gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluido al 0,25% en solución salina estéril con una aguja de calibre 25-puede ser colocado en el sitio de inyección. Los ratones no muestran signos evidentes de angustia después de la cirugía subretiniana y el uso de bupivacaína como un analgésico tópico de larga duración ha sido amplia en los últimos tres años. Ratones siempre deben ser controlados después del procedimiento quirúrgico para observar cualquier signo de peligro, tales como las infecciones, inflamación, o una disminución en las actividades cotidianas del ratón. Si esto ocurre, el veterinario debe ser notificado y otras medicaciones de dolor como la buprenorfina (0,05 mg / kg) puede administrarse como una inyección intraperitoneal.
- Despierta el ratón de la anestesia local, según el protocolo aprobado manipulación de animales. El ratón se debe mantener en un p calefacciónanuncio para mantener la temperatura normal del cuerpo como se despierta de la anestesia. El procedimiento quirúrgico debe tomar menos de cinco minutos para completar, sin contar el tiempo para el ratón para someterse a la anestesia. Por lo tanto, una resistencia de calentamiento no es necesario durante el procedimiento en sí, pero puede ser necesaria mientras que uno está aprendiendo la técnica como el procedimiento podría tener una mayor duración de tiempo. El ratón no se debe volver a colocar en una jaula limpia hasta que ha comenzado a moverse por sí mismo. Para los recién nacidos, pellizcos suaves dedos le ayudará para que puedan recuperarse completamente de la anestesia, y deben recuperar su color rosado y el movimiento antes de ser colocado de nuevo con la madre. Los ratones deben ser controlados a través del tiempo en busca de signos de malestar como se indica anteriormente.
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Representative Results
Un dibujo del ojo del ratón se muestra con grandes estructuras marcadas para referencia, con flechas que muestran las ubicaciones de los procedimientos de inyección intravítrea tanto subretinal y quirúrgicos (puntas de flecha, Figura 1). Vectores de terapia génica, tales como el vector lentiviral lacZ (Figura 2), se puede inyectar el uso de estas ubicaciones. Además, las células madre, tales como células madre embrionarias de ratón (Figura 3), también se pueden trasplantar en estos sitios en el ojo del ratón.
1 l de un vector lentiviral que porta el gen reportero lacZ conducido por el promotor de citomegalovirus (CMV) (1x10 8 TU / ml, Lentigen Corporation, Figura 2A) se inyectó en el espacio subretiniano de ratones C57BL/6J. Los ojos fueron enucleados a las seis semanas de edad por disección roma y se sumergieron en 1 mg / ml de X-gal solución (5 mM K 3 Fe (CN) 6, 2 mM de MgCl 2, 0,02% NP 40, y 0.1% de desoxicolato de sodio) durante la noche a 37 ° C. Ojos se fijaron en glutaraldehído al 2% formaldehyde/0.2% durante 30 min y se seccionaron con un microtomo. Reportero LacZ expresión del gen se detectó como X-gal producto (azul) en aproximadamente el 10% de las células fotorreceptoras (Figura 2B). La presencia intracelular de la expresión de lacZ y los tejidos intactos rodean indican la inyección subretiniana éxito en el ojo del ratón.
C57BL/6J madre embrionarias de ratón (ES) las células fueron marcadas con una proteína verde fluorescente (eGFP, Wellcome Trust Sanger Institute). Estas células se recogieron entonces y se suspendieron en estéril salina tamponada con fosfato y se trasplantaron en el espacio subretiniano del día postnatal (P) 5 ratones C57BL/6J, con aproximadamente 1x10 5 células inyectadas por 1 l. Los ojos fueron enucleados a las dos semanas de edad mediante disección roma, fijado en un gradiente de sacarosa y se congelaron en medio de inclusión OCT (Tissue-Tek). Los ojos fueron seccionadas y vis ualized bajo microscopía de fluorescencia (Zeiss). La presencia de GFP-etiquetados células ES se pueden encontrar en el espacio subretinal del ojo del ratón inyectado (Figura 3A). Además, C57BL/6J-Tyr c-2J / J (C2J) madre embrionarias de ratón (ES) las células se sometieron a electroporación con proteína amarilla fluorescente (YFP) y diferenciarse en epitelio pigmentario (RPE) células in vitro. Después de un mes de la diferenciación, las YFP-RPE-etiquetados como C2J células ES se suspendieron en estéril salina tamponada con fosfato y se inyecta en el espacio subretiniano de P5 ratones C57BL/6J. A las 15 semanas de edad, un ratón fue visualizado utilizando en vivo de imágenes de autofluorescencia para la presencia de YFP dentro de la retina (Escaneo láser confocal Spectralis Oftalmoscopio, Heidelberg Engineering, Figura 3B).
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Figura 1. Esquema del ojo del ratón. Un dibujo de la historieta que representa las estructuras del ojo del ratón con los sitios para los procedimientos de inyección tanto intravítreas y subretinal marcados (puntas de flecha).
Figura 2. Inyección subretiniana de un vector de terapia génica viral. A. lentivirus vector mapa que muestra el gen reportero lacZ conducido por el promotor de citomegalovirus (CMV). B. La expresión del gen reportero lacZ en la retina en un ratón C57BL/6J seis semanas de edad después de la inyección subretiniana en post-natal de cinco días. RGC, las células ganglionares de la retina; capa INL, nuclear interna; ES, segmentos fotorreceptores interiores (flecha); ONL, capa nuclear externa (fotorreceptores) (punta de flecha); OS, fotorreceptoras segmentos exteriores.
Figura 3. Inyección subretiniana de madre embrionarias de ratón (ES) las células. A. A dos semanas del ratón C57BL/6J edad después de la inyección subretiniana de proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados células madre embrionarias en el post-natal de cinco días. Células positivas para GFP son visibles en el espacio subretinal del ojo inyectado usando microscopía de fluorescencia (Zeiss). Verde, GFP marcado con células ES (flechas); capa RGL, ganglionares de la retina; capa INL, nuclear interna, capa de ONL, nuclear externa (fotorreceptores); IS / OS, segmentos fotorreceptores interior y exterior; epitelio RPE, pigmentario de la retina. B. A 15 semanas de edad C57BL/6J retina del ratón se muestra mediante autofluorescencia en vivo de formación de imágenes (Spectralis Scanning oftalmoscopio láser confocal, Heidelberg Engineering) para la presencia de la proteína fluorescente amarilla (YFP)-RPE-etiquetados como C2J células ES de ratón dentro de la retina.Inyección subretiniana de las RPE-como las células madre embrionarias-YFP se realizó en el post-natal de cinco días.
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Discussion
Esta técnica de vídeo proporciona instrucciones para completar el procedimiento de inyección subretiniana quirúrgica con éxito, y asegurar que el vector de terapia génica o de células madre se colocan en la posición necesaria para tratar eficazmente la enfermedad oftálmica. Esta técnica permite la focalización de las células de la retina tales como el RPE o fotorreceptores, puesto que coloca los vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre en la proximidad de estas células. Los métodos anteriores involucrado inyecciones intravítreas, donde se coloca el fluido dentro de la cavidad vítrea y deben migrar a través de la retina con el fin de orientar estas áreas específicas. La inyección intravítrea reduce la transducción de vectores de terapia génica que los fotorreceptores de objetivo o el RPE, ya que no todas las partículas virales migrarán a la ubicación correcta. Además, las células madre se están volviendo cada vez más popular para reemplazar RPE enferma o fotorreceptores, y estas células diferenciadas deben ser trasplantados dentro de la subespacio retinal. 5
El paso crítico en este procedimiento es la entrada en el espacio subretiniano, ya que esto asegura la correcta ubicación de vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre con el fin de tener eficacia terapéutica, junto con la reducción del potencial de desprendimiento de retina o daños en el ojo que rodea tejido. Se debe tener cuidado para solucionar antes de tiempo, para ser capaz de localizar e inyectar el líquido en el espacio subretiniano. Esto se puede hacer a través de la práctica usando tinte de color y ratones albinos, como se muestra en el vídeo, ya que la aguja de inyección no será visible en el ojo de los ratones pigmentados. Después de la práctica, el investigador aprende a sentir la diferencia en la presión cuando el líquido está correctamente colocado en el espacio subretiniano y se sienten cómodos con el procedimiento quirúrgico de terminarla en tiempo y forma.
Hay algunos posibles modificaciones de este procedimiento quirúrgico. Estas inyecciones se pueden realizared en ratones de diferentes edades, aunque la cantidad de vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre inyectados podría variar dependiendo de la edad del ratón. Se debe tener cuidado para determinar la cantidad de líquido será promover el tratamiento de la enfermedad oftálmica, pero no prolongar desprendimiento y daño a la retina. La aguja sacó capilar puede ser modificado para tener diámetros diferentes. Agujas más pequeñas son suficientes para inyecciones virales, pero los diámetros más grandes pueden ser mejores para el trasplante celular. Además, la cirugía se puede realizar en ratones adultos. La densidad de tejido ocular será mucho mayor, por lo frescas, hojas quirúrgicas afiladas son necesarios para penetrar en el espacio subretiniano. En todos los casos, se pueden realizar modificaciones sobre la base de este protocolo para completar una inyección subretiniana éxito de un vector de terapia génica o de células madre derivadas de tejido.
Todas las inyecciones se subretinal causar un desprendimiento de retina temporal debido a la presencia del fluido inyectado dentro de laespacio subretiniano, pero esta separación debe curar dentro de las 24 horas del procedimiento quirúrgico. Los ratones pueden ser cuidadosamente observan bajo un microscopio para cualquier destacamento restante. Es posible que algunos ratones pueden no curar, naturalmente, incluso después de una inyección bien colocado. Todos los ratones son capaces de someterse a examen y los experimentos que siguen a esta 24 horas período de tiempo, sin embargo, el ojo puede ser suave debido a un cambio en la presión del procedimiento de inyección hasta por una semana. Por lo tanto, una limitación de esta técnica es la posibilidad de realizar inyecciones secundarias durante la primera semana postoperatoria. Otra inyección puede no ser posible en el postoperatorio inmediato, ya que la incidencia de desprendimiento de retina que no se cura después de la cirugía es mayor. Se aconseja que esperar por una duración de tiempo más largo, siempre y cuando un mes, antes de volver a inyectar el ojo del ratón.
El ratón se ha convertido en un importante organismo modelo para estudiar la enfermedad oftálmica y las posibles terapias tsombrero dará lugar a ensayos clínicos humanos. 9-12 Una segunda limitación de este procedimiento es que no todas las células son transfectadas con vectores de ADN después de la inyección subretiniana, como lo serían en un modelo de ratón transgénico. Sin embargo, este procedimiento puede aproximarse más estrechamente un procedimiento clínico en humanos en el que se no todas las células transfectadas. Por lo tanto, esta técnica puede ayudar a determinar la viabilidad de vectores de terapia génica viral o de células madre derivado de la terapia de trasplante de tejidos para tratar relacionada con la edad degeneración macular y otras enfermedades vitreoretinal en seres humanos. Las aplicaciones futuras pueden incluir el uso de diferentes promotores de células de la retina y células madre diferenciadas, o incluso inyecciones múltiples utilizando una combinación de tratamientos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Investigación para Prevención de la Ceguera, la asistencia Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta investigación cumple con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y Visual. KJW es apoyado por el NIH subvenciones 5T32EY013933 y 5T32DK007647-20. VBM es apoyado por el NIH subvención K08EY020530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
References
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