Summary
In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.
Abstract
Cryopreservatie van perifeer bloed leukocyten wordt op grote schaal gebruikt om cellen voor immune reactie evaluaties te bewaren in klinische studies en biedt vele voordelen voor het gemak en de standaardisatie van immunologische evaluaties, maar nadelige effecten van dit proces zijn waargenomen op sommige cel subsets, zoals granulocyten, B-cellen en dendritische cellen 1-3. Analyseren verse leukocyten geeft een nauwkeuriger beeld van de in vivo toestand van de cellen, maar is vaak moeilijk uit te voeren in het kader van grote klinische studies. Verse cel assays zijn afhankelijk van vrijwilligers verplichtingen en termijnen, en zo tijdrovend, die toepassing niet kan onpraktisch zijn als gevolg van de werktijden nodig zijn van het laboratoriumpersoneel. Bovendien, als proeven worden uitgevoerd op meerdere centra, kunnen de laboratoria met de middelen en opleiding nodig zijn om de tests uit te voeren niet in voldoende nabijheid van klinische plaatsen. Om deze problemen aan te pakken, hebben we ontwikkeld een 11-kleurige antilichaamkleuring paneel dat kan met Trucount buizen (Becton Dickinson, San Jose, CA) gebruikt om fenotype en grote sommen leukocyt populaties in het perifere bloed, waardoor robuuster celtype specifieke informatie dan assays zoals complete bloedbeeld (CBC) of testen met de handel verkrijgbare panelen ontworpen voor Trucount buizen die vlek voor slechts een paar soorten cellen. De kleuring procedure is eenvoudig, vereist slechts 100 ul vers volbloed, en duurt ongeveer 45 minuten, waardoor het mogelijk is voor standaard bloed-processing laboratoria uit te voeren. Het is een bewerking van de BD Trucount buis technische fiche ( versie 8/2010 ). De kleuring antilichaam cocktail worden voorbereid in bulk in een centraal laboratorium assay en overgebracht naar de verwerking ter labs. Stained buizen kunnen worden vastgestelden ingevroren voor verzending naar de centrale test laboratorium voor veelkleurige flowcytometrie-analyse. De gegevens die uit deze kleuring paneel kan worden gebruikt om veranderingen in concentraties leukocyten tijd met betrekking tot interventie volgen en gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activatie toestand van specifieke celtypen plaats beoordelen. In dit rapport tonen we de procedure die door bloed-processing laboranten om vlekken uit te voeren op vers volbloed en de stappen om deze gekleurde monsters te analyseren op een centrale test laboratorium ter ondersteuning van een multicenter klinische studie. De video beschrijft de procedure zoals deze wordt uitgevoerd in het kader van een klinische proef bloed trekken in de HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Opmerking: Om de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen beschermen tegen licht, voert u alle stappen in een bio-safety kast met het licht uit.
1. Antilichaamkleuring Panel Voorbereiding
- Het antilichaam kleuring panel vindt in tabel 1. Antilichaamconcentratie worden bepaald door titratie met volbloed en dezelfde flowcytometrie apparatuur en procedures die worden gebruikt om de gekleurde monsters fenotypering verwerven.
- Zodra geschikte kleuring titers worden bepaald, combineren antilichamen in een mengsel in een lock-cap tube. Toevoegen stroom wasbuffer (Dulbecco's PBS met 2% door hitte geïnactiveerd foetaal runderserum) het totale volume op 100 pl brengen. Schaal het mengsel voor het aantal monsters gekleurd. Dit mengsel kan worden opgeslagen bij 4 ° C tot acht weken.
2. Kleuring
- Als het opgevangen bloed wordt gebruikt voor andere doeleinden in advoorwaarde deze assay stel een aliquot leggen terwijl meer tijdgevoelige procedures worden uitgevoerd op het resterende bloed. De hoeveelheid kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 4 uur na venapunctie zonder significant celverlies.
- Controleer of er een intact kraal pellet onderaan de Trucount buis en de buis label identificeren monster gekleurd. In HVTN klinische studies, het Laboratorium Data Management Systeem (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) wordt gebruikt om te labelen en te volgen gekleurd monsters.
- Noteer de lotnummers en vervaldata van alle reagentia. Noteer de Trucount buis kraal tellen nummer dat door de fabrikant op de zak van buizen, zorg ervoor dat het lotnummer op de zak overeenkomt met het lotnummer op de buis.
- Gebruik reverse pipetteren tot 100 ul volbloed nauwkeurig pipetteren in de Trucount buis, net boven de metalen houder. Vermijd smeren bloed langs de zijkant van de buis.
- Incubeer de Trucount buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (15-30 ° C) in het donker.
- Indien nodig, Verdun een hoeveelheid van 10 × FACS lyserende oplossing voor 1X met DIH 2 O. Voeg 900 ul 1 x FACS lyserende oplossing aan de buis.
- Grondig Doe het buisje dicht en vortex bij lage snelheid gedurende ongeveer 15 sec om te mengen. Druk de dop stevig in vergrendeling positie op de buis en afdichting met laboratorium film.
- Bewaar het buisje bij -65 ° C tot -95 ° C totdat het monster gereed is voor verzending naar de centrale analytisch laboratorium of voor analyse in huis. Monsters stabiel in dit stadium gedurende ten minste vier weken. Indien verzending of het testen onmiddellijkdellijk kan deze stap worden weggelaten.
3. Scheepvaart
Opmerking: De volgende instructies maken gebruik van een geïsoleerde verzendkosten systeem van Saf-T-Pak, Inc speciaal ontworpen voor de scheepvaart categorie B vrijgesteld biologische stoffen volgens de International Air and Transport Association (IATA) regelgeving. Als de analyse van de monsters op dezelfde locatie als de kleuring opgetreden, ga dan naar hoofdstuk 4.
- Monsters kunnen verzonden worden onmiddellijk na kleuring of nadat ze ingevroren bij -65 ° C tot -95 ° C. Volledig Wikkel elke buis in folie en plaats in de gekleurde monster box. Leg de gekleurde monster doos in een lekvrije poly-bag met absorberend materiaal.
- Plaats de lekvrij poly-bag en de inhoud in een Tyvek zak en sluit met zo weinig mogelijk lucht in de zak.
- Plaats het preparaat pakket (specimen in de secundaire verpakking) in de binnenste bruine doos.
- Plaats de binnenste bruine bos in de piepschuim borst, vastzetten in de inkeping op de veranderende voorkomen.
- Vul het piepschuim borst met droog ijs (circa 8 kg) en stevig leg het deksel op de borst.
- Veilig tape de doos en het schip als biologische stof, categorie B (UN3373) met de juiste Dry Ice (UN1845) markeringen; volg IATA PI-650-instructies.
- Na ontvangst monsters worden bewaard bij -65 ° C tot -95 ° C tot ze geanalyseerd.
4. Ontdooien en flowcytometrie-analyse
- Verwijder het gekleurde monster uit de diepvries bij kamertemperatuur in het donker ontdooien voor het verzamelen op de flowcytometer. Als het verzamelen van gegevens over meer dan een monster, standaardiseren van het proces voor alle buizen door spreiden ontdooien, zodat de buizen niet zitten bij kamertemperatuur gedurende meer dan 1 uur.
- Monster wordt verkregen met een vier laser stromingscytometer uitgerust met geschikte filters, zoals BD LSRII. Gebruik standaard cytometer kalibratie en fluorescentie vergoeding methoden voor het verzamelen van gegevens 4.
Opmerking: Gebruik geen vooruit gezet verstrooien of zijwaartse verstrooiing drempels tijdens het verzamelen 5. Trucount kralen kunnen beneden de laagste drempelwaarde voor deze parameters veroorzaken van een subset van kralen niet meegeteld tijdens de analyse. Indien vereist door het instrument op een drempel vast te stellen, stelt u de laagst mogelijke Am Cyan kanaal drempel. Omdat CD45 + leukocyten gekleurd met het panel zal worden Am Cyaan positief, en Trucount kralen ook fluoresceren in het Am Cyaan kanaal, moet dit zorgen voor alle relevante gegevens op passende wijze worden verzameld.
- Vortex het monster buis gedurende 5 sec voordat u op de flowcytometer. Trucount kralen fluoresceren zeer in veel kanalen. Poort de kralen tijdens het verzamelen door het vinden van de bevolking die sterk dubbel positief is voor PE Cy5 en APC (de twee colors dat het gemakkelijkst de kralen onderscheiden van de cellen is afhankelijk van instrumentatie). Selecteer de kraal poort als uw stoppen poort, en opnemen van gegevens tot ten minste 20.000 kralen zijn verworven.
- Analyseren van de gegevens met behulp van geschikte software, zoals FlowJo (Treestar, Ashland, OR). Figuur 1 toont de gating systeem gebruikt voor analyse van verschillende leukocyt populaties zijn van een controle bloedafname.
5. Trucount Berekeningen
- Elke Trucount buis bevat een gevriesdroogd pellet van fluorescerende kralen. Na het toevoegen in de buis en vortexen moeten de korrels worden gelijkmatig verdeeld in het monster. Het aantal kralen in de pellet varieert enigszins door het lot nummer en is te vinden op de opbergzak voor de buizen.
- Gate Trucount de kralen en celpopulaties zoals getoond in figuur 1 naar event tellingen te bepalen voor elke populatie. Vergelijken van het aantal events in de kraal gate het totale aantal kralen oorspronkelijk in de buis kunt u de verhouding van monster verzameld, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de absolute concentratie (dwz cellen / pl) bepalen voor elke populatie te bepalen. De volgende vergelijking kan worden gebruikt voor dit doel: celconcentratie (# cellen / ul volbloed) = [# populatie events / (# bead events / # totaal beads in pellet)] / 100 pl.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Gating regeling gebruikt voor de analyse van grote populaties leukocyten met representatieve gegevens van een gezonde vrijwilliger. A) Trucount kralen (i) zijn gated en uitgesloten van cellen. Granulocyten (ii) worden afgebakend en lympohcytes en monocyten zijn onderverdeeld in 3 popluations: CD14negatieve lymfocyten (iii) alle CD14 negatieve cellen (iv), en niet-lymfocyten (v). B) CD14 negatieve lymfocyten gated om CD4 + T-cellen (vi), CD8 + T-cellen (vii), B-cellen (viii), CD56 bright NK cellen (ix), CD56 dim NK cellen (x) en CD56 negatieve NK cellen onderscheiden (xi). C) Alle CD14 negatieve cellen te gated myeloïde (xii) en plasmacytoïde (xiii) dendritische cellen onderscheiden. D) niet-lympocytes zijn gated aan niet-klassieke (xiv), intermediair (xv), en klassieke (xvi) monocyten te onderscheiden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Meer specifieke cel subsets die niet worden getoond in Figuur 1 (bijv. NKT cellen of neutrofielen) kan ook worden onderscheiden met het paneel we presenteren en de gating regeling kan worden uitgebreid of aangepast voor specifieke studie behoeften. Bepaalde stappen zijn weergegeven gating uniek voor deze methode. Van bijzonder belang, de opneming poort enuitsluiting gate getrokken rond de Trucount kralen en bovenop elkaar, een aan de gate korrels te tellen, en een aan de beads sluiten van de cellulaire analyse (Figuur 1A). Ook omdat lymfocyten, monocyten en granulocyten niet zo gemakkelijk onderscheiden in volbloed als in perifeer bloed mononucleaire cellen door voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing, gating deze cellen met CD45 expressie en zijwaartse verstrooiing vaak noodzakelijk (Figuur 1A). Verontreinigende granulocyten (omcirkeld) die niet konden worden gescheiden van lymfocyten en monocyten met CD45 en zijwaartse verstrooiing te onderscheiden in sommige plaatsen met hoge CD16 expressie (Figuur 1C en fig. 1D). Het aantal verontreinigende granulocyten meestal klein en ze niet interfereren met monocyt en NK cel gating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport presenteren we een kraal-gebaseerde methode voor het opsommen van leukocyten populaties in vers volbloed door flowcytometrie en hebben betrekking op de parameters die nodig zijn voor het gebruik ervan in een multicenter klinische studie met gecentraliseerde monsteranalyse. Deze methode is gebaseerd op en optimaliseert de BD Trucount protocol en maakt het zijn betrouwbaar gebruik in een multicenter klinische studie setting. De kleuring test is eenvoudig en duurt ongeveer 45 minuten uit te voeren, waardoor het mogelijk is voor de verwerking van bloed laboranten om het uit te voeren en om en de monsters bevriezen verzenden naar een centrale test lab voor analyse. De assay vereist alleen 100 pi volbloed, die de noodzaak voor tijd-en kostenintensieve PBMC worden afgewerkt en gebruikt veel minder volume dan de standaard assays fenotypering. Bovendien met vers volbloed Deze assay nauwkeuriger toont de in vivo toestand van de cellen en elimineert de schadelijke effecten van cryopreservatie waargenomen op een celtypes 1-3. Deze kleuring methode levert nauwkeurige meting van celconcentraties maar met het extra voordeel van aanzienlijk meer onderscheiden celtypes dan CBC en telmethoden. De sleutel tot het verkrijgen van nauwkeurige en consistente resultaten is om zorgvuldig te standaardiseren kritische stappen in het protocol en een documentatie systeem dat bijhoudt van alle stappen, zodat eventuele afwijkingen die worden ontdekt kan worden herleid tot de bron van de fout te kunnen benutten.
Er zijn meerdere belangrijke stappen in het proces dat de kwaliteit van de verkregen gegevens uit deze assay beïnvloeden. Eerste standaardisatie van de behandeling en de behandeling van bloed vanaf het moment dat wordt gevestigd op het moment dat het gekleurd is belangrijk, vergelijkbaar met wat eerder is gerapporteerd voor PBMC verwerking 6. We krijgen consistente gegevens wanneer bloed wordt opgeslagen in de verzamelbuizen in de klinische en wordt vervoerd naar de verwerking labs bij omgevingstemperatuur, kleuringuitgevoerd binnen 4 uur na bloedafname, en de gebrandschilderde monsters worden vervolgens verzonden op droogijs naar de centrale test lab. Bovendien, door het maken van het antilichaam cocktail in de centrale lab en op te sturen naar de verwerking ter plaatse labs, wij zorgen voor samenhang tussen de sites en kan op elke cocktail te testen op een controle bloed te trekken voordat het wordt gebruikt om proef monsters vlek. Het is belangrijk dat de centrale assay lab standaardiseren proces. Daarom raden dat wanneer de samenstellende antilichamen worden getitreerd om de scheiding tussen de positieve en negatieve populaties 7 optimaliseren dezelfde partij antilichaam worden gebruikt voor de kleuring van monsters in een klinische studie een consistente kleuring te handhaven voor elke markering. Als dit niet mogelijk is (bijvoorbeeld, gebrek aan beschikbaarheid van een antilichaam fabrikant), moet elk nieuw lot antilichaam geschikt worden getitreerd dat de flowcytometrie gegevens vergelijkbaar met die verkregen met de vorige lot. Het centrale laboratorium ende verwerking ter plaatse lab moeten besteden veel aandacht aan het schip en het antilichaam cocktail bewaren bij 4 ° C en blootstelling aan licht te vermijden degradatie die zich kunnen voordoen te minimaliseren, in het bijzonder met tandem kleurstoffen 8-9.
De nauwkeurigheid van de verkregen gegevens met deze assay is afhankelijk van een aantal kritische stappen tijdens de kleuringprocedure en afnemen van het monster op de flowcytometer. Van bijzonder belang, nauwkeurige reverse pipetteren van het bloed in de Trucount buis is van essentieel belang, een klein verschil in het bloedvolume kan een groot effect hebben op de berekende concentraties van de cel subsets. Vortexen lage snelheid na toevoeging van het antilichaam cocktail en BD FACS lyseren grondig mengen van de reagentia is ook belangrijk. Ook vortexen grondig gelijkmatig doseren van de kralen in het monster vóór overname is van essentieel belang voor een nauwkeurige telling 10. Kleine variaties in de analyse instellingen van de flowcytometer kunnen ook een grote invloed hebben op de verworven gegevens, dus cazorgvuldig en voorzichtig aandacht moet worden besteed aan de kalibratie en setup van de cytometer bij dagelijks gebruik 4.
Het moet worden opgemerkt dat hoewel voorlopige gegevens suggereren dat het bevriezen van de gekleurde monsters niet lijkt de celconcentraties verkregen (gegevens niet getoond) beïnvloeden, dit nog moet zorgvuldig worden getest. Hoewel dit een potentieel probleem, kan vergelijkingen tussen steekproeven nog worden gemaakt met vertrouwen, zolang alle monsters worden behandeld op een consistente wijze.
Zorgvuldige monster volgen door kleuring en analyse is bijzonder belangrijk, vooral als honderden monsters worden verwerkt in het kader van een klinische proef. Zodra de gegevens zijn verkregen en analyse begonnen, is het essentieel om standaardiseren analyse poorten zoveel mogelijk tussen de monsters. Enige variatie in de fluorescentie van bepaalde populaties kan optreden, met name tussen verschillende vrijwilligers, maar standaard poort locaties dient te worden ingesteld, dat zijn toepassingkabel zoveel mogelijk samples. Elke verschuiving van de poorten van de standaard locatie moet worden gedocumenteerd en in aanmerking genomen bij het bepalen of veranderingen in het aantal cellen ontstaan tussen de monsters.
Deze kleuring is geoptimaliseerd om grote leukocyten subsets via een antilichaamkleuring panel sommen, maar de procedure en het paneel kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften studie. Anders dan Trucount fiche procedure, wat suggereert met 50 pl bloed, de methode presenteren we 100 ul gebruikt. Door een groter bloedvolume, meer events worden verkregen gedurende analyse, wat handig is bij het bestuderen van celpopulaties met relatief lage concentraties in het bloed, zoals dendritische cellen. Hoewel eerdere studies hebben opgesomd dendritische cel populaties via Trucount met behulp van 50 pl en 100 pl bloed volumes 11-12, rapporten blijkt dat redelijke mate van nauwkeurigheid is afhankelijk van het verwerven van ten minste 400 positive populatie gebeurtenissen, waardoor veelal moeilijk met dendritische cellen wanneer slechts 50 pl bloed 13. De gebruikte bloedvolume kan verder worden aangepast aan de analyse voor specifieke celtypen of kleuring panelen voldoen. Evenzo kan de kleuring panel worden gemodificeerd richten op bepaalde celtypes, waardoor voor de telling van meer specifieke cel subsets momenteel onderscheiden door het panel hier (bijvoorbeeld extra NK cell subsets of regulatoire T-cellen). Het gebruik van een enkel paneel vereenvoudigt de kleuringsprotocol en reduceert fouten geassocieerd met meerdere panelen zoals verkeerde etikettering van gekleurde monsters. Hoewel het gebruik van meerdere panelen verhoogt de kosten en de mogelijke fouten afzonderlijke panelen toegesneden op specifieke celtypen mogelijk meer gedetailleerde fenotypering en / of het opnemen van activatie merkers en het gebruik ervan kan gemakkelijk worden uitgevoerd in multicenter klinische studies met inachtneming de overwegingen eerder discussed.
| Fiche | Fluorofoor | Vennootschap | Kloon |
| CD45 | Am Cyaan | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | Ax700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | Immu-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tabel 1. Antilichaamkleuring paneel alle belangrijke perifere bloed leukocyten te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain en Stephen Voght voor hun hulp bij de ontwikkeling van deze methode, manuscript en video.
Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation CAVD subsidie 38.645 (MJM) en National Institutes of Health subsidies UM1 AI068618 en U01 AI069481 (MJM). EA-N. wordt ondersteund door NIH Grant T32 AI007140. Wij danken de James B. Pendleton Charitable Trust voor hun genereuze uitrusting donatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
