Summary
Neste relatório, demonstrar os passos coloração e análise de um ensaio de fenotipagem em sangue total fresco para enumerar grandes inata e adaptativa populações de leucócitos. Ressaltamos considerações para executar estes procedimentos, no contexto de um ensaio clínico multicêntrico.
Abstract
Criopreservação de leucócitos do sangue periférico é amplamente utilizado para preservação de células para a avaliação da resposta imune, em ensaios clínicos, e oferece muitas vantagens para facilidade e normalização das avaliações imunológicos, mas os efeitos prejudiciais deste processo têm sido observados em alguns subconjuntos de células, tais como granulócitos, células B , células dendríticas e 1-3. Ensaio leucócitos frescos dá uma visão mais precisa do estado in vivo das células, mas é muitas vezes difícil de realizar, no contexto de grandes estudos clínicos. Ensaios com células frescas são dependentes de compromissos voluntários e prazos e, se demorado, sua aplicação pode ser impraticável devido às horas de trabalho necessárias do pessoal de laboratório. Além disso, quando os ensaios são realizados em centros múltiplos, laboratórios com os recursos e treinamento necessários para realizar os ensaios não podem estar localizados em proximidade suficiente para locais clínicos. Para resolver estas questões, temos develvolvido um 11-cor do painel de coloração de anticorpo que pode ser utilizado com tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) para o fenótipo e enumerar as principais populações de leucócitos no sangue periférico, produzindo mais robusto informação específica do tipo de célula do que os ensaios, tais como um hemograma completo (CBC) ou ensaios com comercialmente disponíveis painéis projetados para tubos Trucount que mancham por apenas alguns poucos tipos de células. O processo de coloração é simples, requer apenas 100 l de sangue total fresco, e leva cerca de 45 minutos, tornando-se viável para o padrão de processamento de sangue laboratórios para executar. É adaptado do tubo Trucount BD ficha técnica ( versão 8/2010 ). O cocktail de anticorpos de coloração pode ser preparada antecipadamente a granel em um laboratório de ensaio central e enviado para o laboratório de processamento no local. Tubos coradas podem ser fixadase congelada para a expedição para o laboratório central para análise multicolor análise de citometria de fluxo. Os dados gerados a partir deste painel de coloração pode ser usado para controlar as alterações nas concentrações de leucócitos ao longo do tempo em relação à intervenção e pode ser facilmente desenvolvidas para avaliar os estados de activação de tipos específicos de células de interesse. Neste relatório, nós demonstrar o procedimento usado pelos técnicos de processamento de sangue de laboratório para realização da coloração de sangue total fresco e os passos para analisar estas amostras coradas em um laboratório de ensaio central de apoio de um ensaio clínico multicêntrico. Os detalhes do procedimento de vídeo, uma vez que é realizada no contexto de um ensaio clínico draw sangue no HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Nota: Para proteger os anticorpos fluoróforo conjugados da luz, executar todas as etapas de um gabinete de segurança bio-com a luz.
1. Anticorpo Preparação Painel de coloração
- O painel de coloração de anticorpos podem ser encontrados na Tabela 1. Concentração de anticorpos deve ser definido por meio de titulação com sangue total e no uso do equipamento de citometria de fluxo e mesmo procedimentos que serão utilizados para adquirir as amostras coradas fenotípicos.
- Uma vez que os títulos de coloração apropriados são determinados, combinar todos os anticorpos para uma mistura única de um tubo de bloqueio-cap. Adicionar tampão de fluxo de lavagem (PBS de Dulbecco, com 2% de calor de soro bovino fetal inactivado), para perfazer um volume total de 100 ul. Dimensionar a mistura para o número de amostras a serem corados. Esta mistura pode ser armazenada a 4 ° C durante até oito semanas.
2. Coloração
- Se o sangue recolhido é para ser usado para outros fins em addição para este ensaio, defina uma alíquota de lado enquanto os mais sensíveis ao tempo procedimentos são realizados no sangue restante. A alíquota pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até 4 horas após a punção venosa sem perda significativa de células.
- Verificar se existe um grânulo intacto pellet no fundo do tubo e Trucount rótulo do tubo para identificar a amostra que está sendo manchadas. Em ensaios clínicos da HVTN, o Laboratório de Sistema de Gerenciamento de Dados (Frontier Ciência e Tecnologia Research Foundation; Amherst, Nova Iorque) é usado para rotular e rastrear amostras coradas.
- Anote os números de lote e datas de vencimento de todos os reagentes. Anote o número de contagem Trucount tubo talão fornecido pelo fabricante no saco de tubos, certifique-se que o número de lote no saco corresponde ao número de lote no tubo.
- Usar a reversão de pipetagem de precisão pipetar 100 uL de sangue total para dentro do tubo Trucount, logo acima do retentor metálico. Evitar manchas de sangue para o lado do tubo.
- Incubar o tubo Trucount durante 15 minutos à temperatura ambiente (15-30 ° C), no escuro.
- Se necessário, diluem-se uma alíquota de 10 × solução de lise FACS para 1X utilizando dih 2 O. Adicionar 900 ul de 1 × solução de lise FACS para o tubo.
- Tapar o tubo e agitar no vortex cuidadosamente a baixa velocidade durante cerca de 15 segundos para misturar. Empurre a tampa para baixo firmemente em posição de bloqueio no tubo e vedação com filme de laboratório.
- Armazenar o tubo a -65 ° C a -95 ° C até que a amostra está pronta para a transferência para o laboratório de análise central ou para análise em casa. As amostras são estáveis, nesta fase, durante pelo menos quatro semanas. Se o transporte ou ensaio imediatamente, este passo pode ser omitido.
3. Expedição
Nota: As instruções a seguir utilizam um sistema de transporte isolado de Inc., Saf-T-Pak projetado especificamente para transporte de categoria B isentos substâncias biológicas de acordo com a International Air Transport Association e (IATA) regulamentos. Se analisar as amostras no mesmo local que a coloração ocorreu, vá para a seção 4.
- As amostras podem ser fornecidas imediatamente após a coloração ou depois de terem sido congeladas a -65 ° C a -95 ° C. Enrole cada tubo completamente em papel alumínio e coloque na caixa de espécime manchado. Coloque a caixa de espécime manchada dentro de um saco estanque-poli com material absorvente.
- Colocar o saco à prova de fugas e de poli-conteúdo dentro de um saco Tyvek e vedação com o ar o menos possível no saco.
- Coloque o pacote de amostra (amostra dentro de embalagem secundária) dentro da caixa interna marrom.
- Coloque o interior marrom bboi dentro do peito de isopor, prendendo-o no recuo para evitar deslocamento.
- Encha o peito de isopor com gelo seco (cerca de 8 kg) e coloque a tampa firmemente no peito.
- Segurança fita da caixa de transporte e navio como substância biológica, Categoria B (UN3373) com o gelo seco adequada (UN1845) marcações; seguir IATA PI-650 instruções.
- Após a recepção, as amostras são armazenadas a -65 ° C a -95 ° C até serem analisadas.
4. Descongelamento e Análise por Citometria de Fluxo
- Retirar a amostra corada do congelador a descongelar à temperatura ambiente, no escuro, antes de recolher no citómetro de fluxo. Se a recolha de dados sobre mais do que uma amostra, padronizar o processo para todos os tubos por escalonamento descongelamento para que os tubos não estão sentados à temperatura ambiente durante mais de 1 hora cada.
- As amostras devem ser obtidas utilizando um citómetro de fluxo de quatro a laser equipado com filtros adequados, tais como o LSR BDII. Utilize calibração citómetro padrão e métodos de compensação de fluorescência para coleta de dados 4.
Nota: Não defina limites de dispersão de dispersão para a frente ou de lado durante a coleta de 5. Contas Trucount podem cair abaixo a configuração do limite mais baixo possível para estes parâmetros, causando um subconjunto de contas não devem ser contabilizados durante a análise. Se exigido pelo instrumento, para definir um limite, defina o menor possível Am Ciano limiar de canal. Porque leucócitos CD45 + coradas com o painel será Am Ciano positivo, e os grânulos Trucount também fluorescem no Ciano Am canal, este deve permitir a todos os dados relevantes para ser adequadamente recolhidos.
- Vortex do tubo de amostra durante 5 segundos antes de o colocar no citómetro de fluxo. Contas Trucount fluorescência altamente em muitos canais. Portão as contas durante a coleta, encontrando a população que é altamente positivo para o duplo-PE Cy5 e APC (o colo doisrs que mais facilmente distinguir os grânulos das células pode variar, dependendo de instrumentação). Selecione a porta talão como seu portão parar, e registro de dados até pelo menos 20.000 contas são adquiridos.
- Analisar os dados utilizando software apropriado, tal como FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figura 1 mostra o esquema de propagação utilizado para a análise de diferentes populações de leucócitos a partir de um desenho representativo de controlo do sangue.
5. Cálculos Trucount
- Cada tubo contém uma Trucount pellet liofilizado de partículas fluorescentes. Após a adição de líquido para o tubo e agitação em vórtex, as pérolas devem ser distribuídos igualmente ao longo da amostra. O número de pérolas na pelete varia ligeiramente, o número de lote e podem ser encontrados sobre o saco de armazenamento para os tubos.
- Portão das pérolas Trucount e populações de células, como mostrado na Figura 1 para determinar as contagens de eventos para cada população. Comparando o número de eventos in o portão do talão, o número total de pérolas originalmente no tubo lhe permitirá determinar a proporção da amostra recolhida, a qual pode então ser usada para determinar a concentração absoluta (isto é, células / uL) para cada população. A equação que se segue pode ser utilizado para este fim: concentração celular (# de células / uL de sangue total) = [# eventos / população (eventos # / # grânulo grânulos totais em pellet)] / 100 uL.
6. Resultados representativos
Figura esquema Gating 1. Utilizado para a análise de grandes populações de leucócitos que mostram dados representativos de um voluntário saudável. A) grânulos Trucount (i) são fechado e excluído a partir de células. Granulócitos (ii) são delineadas e lympohcytes e monócitos são divididos em 3 popluations: CD14linfócitos negativos (iii), todas as células CD14 negativas (iv), e não os linfócitos (V). B) CD14 linfócitos negativos são gated para distinguir células T CD4 + (VI), CD8 + T (vii), células B (VIII), CD56 brilhantes células NK (ix), células CD56 dim NK (x), e CD56 negativas células NK (xi). C) Todos células CD14 negativas são gated para distinguir mielóide (xii) e (xiii células plasmocitóide) dendríticas. D) Não são lympocytes fechado para distinguir não-clássicas (xiv), intermediários (xv) e clássica (xvi) monócitos. Clique aqui para ver maior figura .
Mais subconjuntos de células específicas, que não são mostradas na figura 1 (por exemplo, as células NKT ou neutrófilos) também pode ser distinguido através do painel são apresentadas, e o esquema de gating pode ser ampliado ou modificado para satisfazer as necessidades específicas de estudo. Gating passos certos mostrados são exclusivas para este método. Da nota particular, um portão de inclusão eportão exclusão são desenhados em torno das esferas de Trucount e colocado em cima da outra, de um a porta para as pérolas de contagem, e um para excluir os grânulos a partir da análise celular (Figura 1A). Além disso, como os linfócitos, monócitos, granulócitos e não são tão facilmente distinguidos no sangue total como o são em células mononucleares do sangue periférico por dispersão frontal e lateral de dispersão, gating estas células CD45 usando expressão dispersão lateral e é muitas vezes necessário (Figura 1A). Granulócitos contaminantes (círculos) que não podem ser separados a partir de linfócitos e monócitos CD45 e usando dispersão lateral são distinguíveis em algumas parcelas, pela sua expressão de alto CD16 (Figura 1C e Figura 1D). O número de granulócitos contaminantes é normalmente pequeno, e que não interfiram com a propagação de células de monócitos e células NK.
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Discussion
Neste relatório, apresentamos um método baseado em talão para enumerar populações de leucócitos no sangue total fresco por citometria de fluxo e cobrir os parâmetros necessários para a sua utilização em um ensaio clínico multicêntrico com a análise da amostra centralizado. Este método baseia-se e otimiza o BD protocolo Trucount e permite seu uso confiável em um ambiente de estudo clínico multicêntrico. O método de coloração é simples e leva cerca de 45 minutos para ser realizado, tornando viável para técnicos de laboratório de processamento de sangue para realizá-lo e congelar e enviar as amostras a um laboratório de ensaio central para análise. O ensaio requer apenas 100 ul de sangue completo, o que elimina a necessidade de tempo de processamento e de custo intensivo e PBMC usa volume muito menor do que os ensaios fenotípicos convencionais. Além disso, usando sangue total fresco, neste ensaio com mais precisão descreve o estado em in vivo de células e elimina os efeitos prejudiciais de criopreservação observadas em alguns tipos de célulass 1-3. Este método de coloração produz uma medição precisa de concentrações de células, mas com o benefício adicional de distinguir tipos de células significativamente maior do que CBC e outros métodos de contagem. A chave para a obtenção de resultados precisos e consistentes é cuidadosamente padronizar etapas críticas do protocolo e de utilizar um sistema de documentação que mantém o controle de todas as etapas para que as anomalias que são descobertos podem ser rastreados para a fonte do erro.
Existem vários passos críticos ao longo do processo que influenciam a qualidade dos dados obtidos a partir deste ensaio. Em primeiro lugar, a padronização do tratamento e manuseamento de sangue a partir do momento em que for puxado para o momento em que é corado é importante, semelhante ao que foi previamente relatado para processamento de PBMC 6. Obtemos dados consistentes quando o sangue é armazenado nos tubos de recolha no local da clínica e transportadas para o laboratório de processamento à temperatura ambiente, a coloração érealizada dentro de 4 horas após colheita de sangue, e as amostras coradas são então enviadas em gelo seco para o laboratório de ensaio central. Além disso, fazendo o coquetel de anticorpos no laboratório central e enviá-lo para os laboratórios de processamento do site, assegurar a coerência entre sites e pode testar cada cocktail em uma coleta de sangue de controle antes de ser usado para manchar amostras experimentais. É importante que o ensaio de laboratório central de padronizar este processo. Portanto, recomendamos que uma vez que os anticorpos são titulados constituintes para optimizar a separação entre as populações positivas e negativas 7, o mesmo lote de anticorpo ser utilizado para a coloração de todas as amostras de um ensaio clínico para manter os níveis de coloração consistente para cada marcador. Se isto não for possível (por exemplo, a falta de disponibilidade de um fabricante de anticorpo), a cada novo lote de anticorpo deve ser adequadamente ajustada para assegurar que os dados de citometria de fluxo será comparável à obtida com o lote anterior. O laboratório central eo laboratório de processamento do local deve ter grande cuidado para transportar e armazenar o cocktail de anticorpos, a 4 ° C e evitar a exposição à luz para minimizar a degradação que pode ocorrer, em especial com corantes em tandem 8-9.
A precisão dos dados adquiridos com o presente ensaio depende de vários passos cruciais durante o processo de coloração e a aquisição de amostras no citómetro de fluxo. De nota particular, inversa exacta pipetagem do sangue para dentro do tubo Trucount é essencial, uma pequena diferença no volume de sangue pode ter um grande efeito sobre as concentrações calculadas de subconjuntos de células. Vórtice a baixa velocidade, após a adição do cocktail de anticorpos e lise FACS BD para misturar os reagentes também é importante. Do mesmo modo, para dispensar vórtice completamente os grânulos uniformemente por toda a amostra antes da aquisição é essencial para uma contagem precisa 10. Pequenas variações nas configurações de análise sobre o citómetro de fluxo pode também ter um grande impacto sobre os dados adquiridos, assim careful atenção deve ser dada à calibração e configuração do citómetro com o uso diário 4.
Também deve ser notado que, embora os dados preliminares sugerem que o congelamento das amostras coradas não parece afectar a concentração de células obtidas (dados não apresentados), esta tem ainda de ser testado. Embora esta seja uma preocupação potencial, as comparações entre amostras ainda podem ser feitas com confiança, desde que todas as amostras são tratados de uma forma consistente.
Controle cuidadoso da amostra durante a análise de coloração e é particularmente importante, especialmente quando centenas de amostras são processados no contexto de um estudo clínico. Uma vez que os dados são adquiridos e análise iniciada, é crítico para padronizar portões de análise, tanto quanto possível, entre as amostras. Alguma variabilidade na fluorescência de certas populações pode ocorrer, especialmente entre os voluntários diferentes, mas os locais de porta padrão deve ser definido que são aplicabo para tantas amostras quanto possível. Qualquer mudança dos portões do local padrão deve ser documentado e levado em conta ao determinar se as alterações na contagem de células ocorrem entre as amostras.
Este método de coloração foi optimizada para enumerar os principais subconjuntos de leucócitos utilizando um painel de coloração do anticorpo, mas o processo e o painel pode ser facilmente modificado para satisfazer as necessidades específicas de estudo. Contrariamente ao processo de folha de dados técnicos Trucount, o que sugere a utilização de 50 ul de sangue, o método, apresentamos utiliza 100 ul. Ao utilizar um volume maior de sangue, mais eventos podem ser obtidos durante a análise, o que é útil quando se estudam as populações de células com concentrações relativamente baixas no sangue periférico, tais como células dendríticas. Embora os estudos anteriores tenham enumerado populações de células dendríticas através Trucount utilizando 50 uL e 100 uL volumes de sangue 11-12, os relatórios indicam que a precisão razoável é dependente de adquirir, pelo menos, 400 positivos e os eventos de população, os quais podem frequentemente ser difícil com células dendríticas quando se utiliza apenas 50 ul de sangue 13. O volume do sangue pode ser utilizado e ajustado para satisfazer os requisitos de análise para tipos específicos de células ou painéis de coloração. Do mesmo modo, o painel de coloração pode ser modificado para se concentrar em certos tipos de células, permitindo assim a enumeração de subconjuntos específicos de células mais actualmente não se distinguem por o painel mostrado aqui (por exemplo, a outros subconjuntos de células NK ou de células T reguladoras). O uso de um único painel simplifica o protocolo de coloração e reduz os erros associados com painéis múltiplos, tais como erros na etiquetagem de amostras coradas. Embora o uso de painéis múltiplos aumenta os custos e os potencial para erro, painéis separados adaptados para tipos específicos de células para permitir a fenotipagem mais pormenorizada e / ou a inserção de marcadores de activação e a sua utilização pode ser facilmente implementado em ensaios clínicos multicêntricos, tendo em conta as considerações anteriormente discoussed.
| Marcador | Fluoróforo | Companhia | Clone |
| CD45 | Am Ciano | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | Ax700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | Immu-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tabela 1. Painel Anticorpo de coloração para determinar todas as principais populações de leucócitos do sangue periférico.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain e Stephen Voght para a sua assistência no desenvolvimento deste método manuscrito, e vídeo.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates CAVD concessão 38.645 (MJM) e do Instituto Nacional de Saúde concede UM1 AI068618 e U01 AI069481 (MJM). EA-N. é suportado pelo NIH Grant T32 AI007140. Agradecemos a confiança James B. Pendleton Charitable por sua doação de equipamentos generoso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
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