Summary
En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.
Abstract
Crioconservación de leucocitos de sangre periférica se utiliza ampliamente para conservar las células para las evaluaciones de la respuesta inmune en los ensayos clínicos y ofrece muchas ventajas para la facilidad y la normalización de las evaluaciones inmunológicas, pero los efectos perjudiciales de este proceso se han observado en algunos subconjuntos de células, tales como los granulocitos, células B , y las células dendríticas 1-3. Ensayo de leucocitos frescas da una imagen más precisa del estado in vivo de las células, pero a menudo es difícil de realizar en el contexto de ensayos clínicos grandes. Los ensayos de células frescas dependen de compromisos voluntarios y los plazos, y si consume tiempo, su aplicación puede ser poco práctico debido a las horas de trabajo necesarias del personal de laboratorio. Además, cuando los ensayos se llevan a cabo en varios centros, laboratorios con los recursos y la capacitación necesarios para llevar a cabo los ensayos no pueden estar situados en la proximidad suficiente a los sitios clínicos. Para abordar estas cuestiones, tenemos que desarrorrollado un panel de anticuerpos 11-tinción de color que se puede utilizar con tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) a fenotipo y enumerar las principales poblaciones de leucocitos en la sangre periférica, con un rendimiento más robusto de células de tipo información específica de ensayos tales como un Recuento sanguíneo completo (CSC) o ensayos comercialmente disponibles con paneles diseñados para tubos Trucount que manchan por sólo unos pocos tipos de células. El procedimiento de tinción es simple, requiere sólo 100 l de sangre entera fresca, y tarda aproximadamente 45 minutos, por lo que es factible para el estándar de procesamiento de la sangre para llevar a cabo los laboratorios. Es una adaptación de la hoja BD Trucount tubo técnica de datos ( versión 8/2010 ). El cóctel de anticuerpos de tinción puede ser preparado de antemano a granel en un laboratorio central de ensayo y se envían a los laboratorios de transformación en el lugar. Tubos manchados puede ser fijadoy se congelan para su envío al laboratorio de ensayo central para el análisis multicolor citometría de flujo. Los datos generados a partir de este panel de tinción se puede utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de leucocitos en el tiempo en relación con la intervención y fácilmente podrían ser desarrolladas para evaluar los estados de activación de tipos de células específicas de interés. En este informe, demuestran el procedimiento utilizado por los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre para realizar la tinción de sangre entera fresca y los pasos para analizar estas muestras teñidas en un laboratorio de ensayo de soporte central un ensayo clínico multicéntrico. Los detalles del video del procedimiento, ya que se realiza en el contexto de un proyecto de ensayo clínico de la sangre en la Red de Ensayos de Vacunas contra el VIH (HVTN).
Protocol
Nota: Para proteger los anticuerpos conjugados con fluorocromo de la luz, realice todos los pasos en un gabinete de bioseguridad con la luz apagada.
1. Tinción de anticuerpos Panel Preparación
- El panel de tinción de anticuerpos se pueden encontrar en la Tabla 1. La concentración de anticuerpo debe ser definido por titulación con sangre entera y usando el equipo de citometría de flujo mismo y los procedimientos que se utilizarán para adquirir las muestras teñidas fenotipificación.
- Una vez los títulos de tinción apropiados se determinan, se combinan todos los anticuerpos en una única mezcla en un tubo de bloqueo de la tapa. Añadir tampón de flujo de lavado (PBS de Dulbecco con 2% inactivado por calor suero fetal bovino) para llevar el volumen total a 100 l. Escala de la mezcla para el número de muestras que se están teñidas. Esta mezcla se puede almacenar a 4 ° C durante hasta ocho semanas.
2. La tinción
- Si la sangre recogida es para ser utilizado para otros fines en anunciocondición para este ensayo, establecer una alícuota a un lado mientras más sensibles al tiempo los procedimientos se realizan en la sangre restante. La alícuota se pueden almacenar a temperatura ambiente durante hasta 4 horas después de la punción venosa, sin pérdida significativa de células.
- Compruebe que hay un intacta pellet talón en la parte inferior del tubo Trucount y etiqueta el tubo para identificar la muestra que se tiñeron. En los ensayos clínicos HVTN, el Laboratorio de Sistema de Gestión de Datos (Frontier Science y Technology Research Foundation; Amherst, NY) se utiliza para etiquetar y rastrear muestras de colores.
- Anote los números de lote y fechas de caducidad de todos los reactivos. Anote el número de cuenta tubo Trucount talón proporcionado por el fabricante de la bolsa de tubos, asegúrese de que el número de lote en la bolsa coincide con el número de lote del tubo.
- Utilizar Invertir pipeteado para pipetear exactamente 100 l de sangre total en el tubo Trucount, justo encima del retenedor metálico. Evitar manchas de sangre por el lado del tubo.
- Incubar el tubo Trucount durante 15 minutos a temperatura ambiente (15-30 ° C) en la oscuridad.
- Si es necesario, se diluye una alícuota de 10 × solución de lisis FACS a 1X utilizando DIH 2 O. Añadir 900 l 1 x solución de lisis FACS para el tubo.
- Tapar el tubo y agitar cuidadosamente a baja velocidad durante aproximadamente 15 segundos para mezclar. Empuje la tapa hacia abajo firmemente en la posición de bloqueo en el tubo y la junta con película de laboratorio.
- Almacenar el tubo a -65 ° C a -95 ° C hasta que la muestra está lista para su envío al laboratorio central de análisis o para el análisis en casa. Las muestras son estables en esta etapa durante al menos cuatro semanas. Si va a enviar o ensayar inmediatatamente, este paso puede ser omitido.
3. Envío
Nota: Las siguientes instrucciones utilizan un sistema de envío aislados de Saf-T-Pak, Inc. diseñado específicamente para envío categoría B biológicos sustancias exentas de acuerdo con International Air y Transport Association (IATA). Si el análisis de las muestras en la misma ubicación que la tinción ocurrió, vaya a la sección 4.
- Las muestras pueden ser enviado inmediatamente después de la tinción o una vez que se congelan a -65 ° C a -95 ° C. Envuelva cada tubo completamente en papel de aluminio y coloque en el cuadro de muestra de colores. Coloque la caja espécimen manchado el interior de una bolsa de polietileno a prueba de fugas con materiales absorbentes.
- Coloque la prueba de filtración bolsa de polietileno y el contenido en una bolsa de Tyvek y sello con tan poco aire como sea posible en la bolsa.
- Coloque el paquete espécimen (muestra dentro de un embalaje secundario) dentro de la caja marrón interior.
- B Coloque el interior marrónbuey en el interior del pecho de espuma de poliestireno, fijándola en la muesca para evitar que se desplacen.
- Llene el pecho de espuma de poliestireno con hielo seco (aproximadamente 8 kg) y coloque la tapa firmemente en el pecho.
- Asegure con cinta adhesiva la caja de envío y de la nave como de Sustancias biológicas, Categoría B (UN3373) con el hielo seco adecuado (UN1845) del producto, siga IATA PI-650 instrucciones.
- Tras la recepción, las muestras se almacenaron a -65 ° C a -95 ° C hasta que se analizaron.
4. Descongelación y análisis de citometría de flujo
- Retirar la muestra teñida del congelador se descongele a temperatura ambiente en la oscuridad antes de recoger en el citómetro de flujo. Si la recopilación de datos en más de una muestra, estandarizar el proceso para todos los tubos mediante el escalonamiento descongelación manera que los tubos no están sentados a temperatura ambiente durante más de 1 hora cada uno.
- Las muestras deben ser obtenidas usando un citómetro de flujo láser cuatro equipado con filtros adecuados, tales como el BD LSRII. Utilice la calibración citómetro estándar y métodos de fluorescencia de compensación para la recolección de datos 4.
Nota: No establezca umbrales de dispersión hacia adelante o al lado de dispersión durante la recogida 5. Perlas Trucount puede caer por debajo del valor de umbral más bajo posible para estos parámetros causantes de un subconjunto de perlas no tenerse en cuenta durante el análisis. Si es requerido por el instrumento, para establecer un umbral más bajo posible establecer el umbral Am Cian canal. Debido a que los leucocitos CD45 + teñidas con el panel estará Am Cian positivo, y los granos también Trucount fluorescencia en el canal Am Cian, esto debería permitir a todos los datos relevantes para ser debidamente recogidos.
- Vortex el tubo de muestra durante 5 segundos antes de cargar en el citómetro de flujo. Cuentas Trucount fluorescente altamente en muchos canales. Puerta de las cuentas durante la recolección mediante la búsqueda de la población que es muy positivo para la doble-PE Cy5 y APC (la colo dosrs que distinguen más fácilmente las perlas de las células puede variar dependiendo de la instrumentación). Seleccione la puerta de perla como la puerta de detener y registrar datos hasta por lo menos 20.000 cuentas se adquieren.
- Analizar los datos con el software adecuado, como FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figura 1 se muestra el esquema de puerta utilizado para el análisis de las diferentes poblaciones de leucocitos de un empate de sangre del control representativo.
5. Cálculos Trucount
- Cada tubo contiene Trucount una pastilla liofilizada de perlas fluorescentes. Después de la adición de líquido al tubo y la agitación en vórtex, las perlas deben ser distribuidas por igual en toda la muestra. El número de los granos en la pastilla varía ligeramente según el número de lote y se puede encontrar en la bolsa de almacenamiento para los tubos.
- Puerta de las cuentas Trucount y poblaciones de células, como se muestra en la Figura 1 para determinar el recuento de eventos para cada población. Comparando el número de eventos in de la puerta de vidrio hasta el número total de bolas originalmente en el tubo le permitirá determinar la proporción de la muestra recogidos, que entonces se puede utilizar para determinar la concentración absoluta (es decir, las células / l) para cada población. La siguiente ecuación se puede usar para este propósito: la concentración de la célula (# células / sangre entera l) = [# de población acontecimientos (eventos / # / # grano granos totales en pellet)] / 100 mu l.
6. Los resultados representativos
Figura 1. Gating esquema utilizado para el análisis de grandes poblaciones de leucocitos que muestran datos representativos de un voluntario sano. A) perlas Trucount (i) están cerradas y excluido de las células. Granulocitos (ii) se delinean y lympohcytes y monocitos se dividen en 3 popluations: CD14linfocitos negativos (iii), todas las células CD14 negativas (iv) y que no son linfocitos (v). B) CD14 linfocitos negativos son gated para distinguir células T CD4 + (vi), células CD8 + T (vii), células B (viii), células CD56 brillantes NK (ix), CD56 dim células NK (x), y CD56 células NK negativos (xi). C) Todas las células CD14 negativas están cerradas para distinguir mieloide (xii) y (xiii plasmacitoides) células dendríticas. D) No lympocytes están cerradas para distinguir no clásicos (xiv), intermedio (XV) y clásico (xvi) los monocitos. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Subconjuntos de células más específicas que no se muestran en la Figura 1 (por ejemplo, las células NKT o neutrófilos) también se pueden distinguir mediante el panel se presentan, y el esquema de puerta puede ser ampliado o modificado para satisfacer las necesidades específicas de estudio. Algunos pasos de activación periódica mostrados son únicas a este método. Cabe destacar que una puerta de la inclusión y lapuerta de exclusión se dibujan alrededor de las perlas Trucount y se coloca en la parte superior de uno al otro, uno a la puerta de las perlas para el recuento, y la otra para excluir las perlas del análisis celular (Figura 1A). Además, debido a los linfocitos, monocitos y granulocitos no son como se distingue fácilmente en la sangre entera como lo son en las células mononucleares de sangre periférica por dispersión frontal y dispersión lateral, gating estas células utilizando expresión CD45 y la dispersión lateral es a menudo necesario (Figura 1A). Granulocitos contaminantes (círculo) que no pudieron ser separados de linfocitos y monocitos utilizando CD45 y dispersión lateral son distinguibles en algunas parcelas por su alta expresión de CD16 (Figura 1C y Figura 1D). El número de granulocitos contaminantes es generalmente pequeño, y que no interfieran con gating celular de monocitos y NK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este informe se presenta un método basado en perlas para enumerar las poblaciones de leucocitos en sangre entera fresca por citometría de flujo y cubrir los parámetros necesarios para su uso en un ensayo clínico multicéntrico con el análisis de muestras centralizado. Este método se basa en el protocolo y optimiza BD Trucount y permite su uso confiable en un entorno ensayo clínico multicéntrico. El ensayo de tinción es simple y toma aproximadamente 45 minutos para llevar a cabo, por lo que es factible para los técnicos de laboratorio de procesamiento de la sangre para llevarla a cabo y para congelar y enviar las muestras a un laboratorio de análisis central para su análisis. El ensayo requiere sólo 100 l de sangre total, lo que elimina la necesidad de tiempo y coste intensivo de procesamiento de PBMC y utiliza un volumen mucho menor que los ensayos de fenotipado estándar. Además, mediante el uso de sangre entera fresca, este ensayo con más precisión representa el estado in vivo de las células y elimina los efectos perjudiciales de la crioconservación observado en un cierto tipo de célulass 1-3. Este método de tinción produce una medición precisa de las concentraciones de células, pero con la ventaja añadida de distinguir significativamente más tipos de células que los métodos de recuento de CTF y otros. La clave para obtener resultados precisos y consistentes es estandarizar cuidadosamente los pasos críticos en el protocolo y utilizar un sistema de documentación que realiza un seguimiento de todos los pasos para que todas las anomalías que se detectan se puede remontar a la fuente del error.
Hay varios pasos críticos a lo largo del proceso que influyen en la calidad de los datos adquiridos a partir de este ensayo. En primer lugar, la normalización del tratamiento y la manipulación de la sangre desde el momento en que se señala a la vez que se tiñeron es importante, similar a lo que se ha informado anteriormente para PBMC de procesamiento 6. Se obtienen datos coherentes cuando la sangre se almacena en los tubos de recogida en el centro clínico y se transporta a los laboratorios de procesamiento a temperatura ambiente, la tinción esrealizar dentro de las 4 horas de la extracción de sangre, y las muestras teñidas se envían luego en hielo seco al laboratorio de ensayo central. Además, al hacer que el cóctel de anticuerpos en el laboratorio central y enviarlo a los laboratorios de transformación en el lugar, es asegurar la consistencia entre sitios y puede probar cada cóctel en una extracción de sangre de control antes de que se utiliza para teñir muestras de ensayo. Es importante que el laboratorio central de ensayo de estandarizar este proceso. Por lo tanto se recomienda que una vez que los anticuerpos constitutivos se titula para optimizar la separación entre las poblaciones positivas y negativas 7, el mismo lote de anticuerpo se utilizará para la tinción de todas las muestras en un ensayo clínico para mantener niveles uniformes de tinción para cada marcador. Si esto no es posible (por ejemplo, la falta de disponibilidad de un fabricante de anticuerpo), cada nuevo lote de anticuerpo deben titularse para garantizar que los datos de citometría de flujo será comparable a la obtenida con el lote anterior. El laboratorio central yel laboratorio de procesamiento de sitio debe tener mucho cuidado para transportar y almacenar el cóctel de anticuerpos a 4 ° C y evitar la exposición a la luz para minimizar la degradación que puede ocurrir, sobre todo con tintes tándem 8-9.
La exactitud de los datos adquiridos con este ensayo depende de varios pasos críticos durante el procedimiento de tinción y de obtención de muestras en el citómetro de flujo. De particular, pipeteado inverso exacto de la sangre en el tubo Trucount es esencial; una pequeña diferencia en el volumen de sangre podría tener un gran efecto en las concentraciones calculadas de subconjuntos de células. Agitación en vórtex a baja velocidad después de añadir el cóctel de anticuerpos y BD FACS lisar para mezclar completamente los reactivos es también importante. De manera similar, agitación a fondo para dispensar las perlas uniformemente a través de la muestra antes de la adquisición es esencial para el recuento preciso 10. Pequeñas variaciones en la configuración del análisis en el citómetro de flujo también puede tener un gran impacto en los datos adquiridos, por lo que caReful atención debe prestarse a la calibración y la configuración del citómetro con el uso diario 4.
También hay que señalar que mientras que los datos preliminares sugieren que la congelación de las muestras teñidas no parece afectar a las concentraciones de células obtenidos (datos no mostrados), esto aún no se ha probado a fondo. Aunque este es un problema potencial, las comparaciones entre muestras todavía se puede realizar con seguridad, siempre y cuando todas las muestras se tratan de una manera consistente.
Rastreo de muestras cuidadosa a lo largo de tinción y análisis es particularmente importante, sobre todo cuando cientos de muestras se procesan en el contexto de un ensayo clínico. Una vez adquiridos los datos y análisis comenzado, es crítico para estandarizar puertas análisis tanto como sea posible entre las muestras. Cierta variabilidad en la fluorescencia de ciertas poblaciones puede ocurrir, especialmente entre los voluntarios diferentes, pero ubicaciones estándar de compuerta se debe establecer que son aplicablescable a tantas muestras como sea posible. Cualquier desplazamiento de las puertas de la ubicación estándar debe ser documentada y tenerse en cuenta al determinar si los cambios en el recuento de células se producen entre muestras.
Este método de tinción fue optimizado para enumerar las principales subconjuntos de leucocitos utilizando un panel de tinción de anticuerpos, pero el procedimiento y el panel se podría modificar fácilmente para satisfacer las necesidades específicas de estudio. Contrariamente a la Trucount procedimiento técnico hoja de datos, que sugiere el uso de 50 l de sangre, el método que presentamos utiliza 100 l. Mediante el uso de un volumen sanguíneo de mayor tamaño, más eventos pueden ser adquiridos durante el análisis, que es útil en el estudio de las poblaciones de células con concentraciones relativamente bajas en la sangre periférica, tales como células dendríticas. Aunque estudios previos han enumerado las poblaciones de células dendríticas a través de Trucount utilizando 50 l y 100 volúmenes de sangre mu l 11-12, los informes indican que la precisión razonable depende de la adquisición de al menos 400 positiveventos e la población, y esto a menudo puede ser difícil con células dendríticas cuando se utiliza sólo el 50 l de sangre 13. El volumen de sangre que se utiliza puede ajustarse aún más para satisfacer los requerimientos de análisis para determinados tipos de células o paneles de tinción. De manera similar, el panel de tinción puede ser modificado para centrarse en determinados tipos de células, lo que permite la enumeración de más subconjuntos de células específicas que actualmente no se distinguen por el panel que se muestra aquí (por ejemplo, subconjuntos adicionales de células NK o células T reguladoras). El uso de un único panel simplifica el protocolo de tinción y reduce los errores asociados con múltiples paneles, tales como etiquetado incorrecto de las muestras teñidas. Aunque el uso de paneles múltiples aumenta los costes y las posibilidades de error, paneles separados a la medida de los tipos de células específicas para permitir fenotipificación más detallado y / o la inclusión de marcadores de activación, y su uso podría ser fácilmente implementado en los ensayos clínicos multicéntricos, teniendo en cuenta las consideraciones anteriormente discoussed.
| Marcador | Fluoróforo | Empresa | Clonar |
| CD45 | Am Cian | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | AX700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | Immu-357 |
| CD14 | v450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-Ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tabla 1. Panel de anticuerpos tinción para determinar todas las principales poblaciones periféricas de leucocitos sanguíneos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Jessica Jones, Clark Erica, Ducar Constanza, Donna Smith, Lewis Roy, Apedaile Lily, Wiesner Joanne, Adams Devin, McBain Corey y Voght Stephen por su ayuda en el desarrollo de este método, manuscrito y video.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates CAVD subvención 38.645 (MJM) y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones UM1 AI068618 y AI069481 U01 (MJM). EA-N. es apoyado por el NIH subvención T32 AI007140. Damos las gracias a la James B. Pendleton Charitable Trust por su donación generosa equipo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
