Summary
В этом докладе мы покажем, окрашивание и анализ шагов фенотипирование анализ выполняется на свежую цельную кровь, перечислить основные врожденной и адаптивной популяции лейкоцитов. Мы подчеркиваем соображения для выполнения этих процедур в рамках многоцентрового клинического исследования.
Protocol
Примечание: Для защиты флуорофора-антителами от света, выполнить все этапы биологической безопасности шкаф с свет.
1. Антитела Окрашивание Подготовка панелей
- Панель антител окрашивания можно найти в таблице 1. Концентрации антител должно быть определено путем титрования цельной крови и с тем же оборудованием проточной цитометрии и процедуры, которые будут использоваться для приобретения окрашенных образцов фенотипирования.
- После соответствующих титров окрашивания определяется, объединить все антитела в одной смеси на замок крышкой трубки. Добавить поток промывочного буфера (PBS Дульбекко с 2% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сывороткой), чтобы довести общий объем до 100 мкл. Масштаб смеси для числа образцов, окрашенных. Эту смесь можно хранить при температуре 4 ° С в течение восьми недель.
2. Окрашивание
- Если кровь, собранная будет использоваться для других целей в объявленииУсловие для этого анализа, установить аликвоты в стороне в то время как более срочные процедуры выполняются на оставшуюся кровь. Аликвоту можно хранить при комнатной температуре в течение 4 часов после венепункции без значительных потерь клетки.
- Убедитесь, что есть нетронутыми борта осадок на дне Trucount трубы и трубки этикетки для идентификации пробы окрашивают. В HVTN клинических испытаний, лаборатория Data Management System (пограничная наука и технологии исследовательского фонда; Амхерст, штат Нью-Йорк) используется для обозначения и отслеживать окрашенных образцов.
- Запишите номер партии и срок годности всех реагентов. Запись Trucount трубки шарик число номеров, предоставляемых производителем на сумку труб; убедитесь, что номер партии на пакете соответствует номеру партии на трубе.
- Использование обратного пипеткой точно пипеткой 100 мкл цельной крови в Trucount трубку, чуть выше металлов фиксатор. Избегайте размытие крови вниз стороне трубки.
- Инкубируйте Trucount трубку в течение 15 минут при комнатной температуре (15-30 ° C) в темноте.
- При необходимости, разбавить аликвоты 10 × FACS Лизирующий решение 1X использованием DIH 2 O. Добавить 900 мкл 1 × FACS Лизирующий решение трубку.
- Закройте пробирку крышкой и тщательно вихря на низкой скорости в течение примерно 15 секунд, чтобы смешаться. Надавите на крышку вниз твердо в положение фиксации на трубе и печать с фильма лаборатории.
- Хранить трубки при -65 ° C до -95 ° C, пока образец готов для отправки в центральной лаборатории анализа или для анализа в доме. Образцы стабильны на данном этапе, по крайней мере, четыре недели. Если грузить или анализом непосредственно, этот шаг может быть опущен.
3. Судоходство
Примечание: Следующие инструкции используют изолированные системы доставки от Saf-T-Пак, Inc, специально предназначенные для доставки категории B освобождаются биологических веществ в соответствии с международными воздуха и транспорта (ИАТА) положений. Если в результате анализа образцов в том же месте, окрашивание произошло, перейдите в раздел 4.
- Образцы могут быть отправлены сразу после окрашивания или после их замораживают при -65 ° C до -95 ° C. Оберните каждую трубу полностью в фольгу и положите в коробку окрашенных образцов. Поместите окрашенные окна образца внутри герметичной поли-мешок с абсорбирующим материалом.
- Поместите герметичный поли-пакет и содержимое в сумку Tyvek и печать с минимальным воздухе как можно в сумке.
- Поместите образец пакета (образец внутри вторичной упаковки) во внутренней коричневой коробке.
- Поместите внутреннюю коричневый бвола внутри грудной клетки пенопласта, закрепив его в углубление для предотвращения смещения.
- Заполните груди пенополистирола с помощью сухого льда (около 8 кг) и поместите крышку плотно на груди.
- Безопасное ленты транспортную коробку и корабль, как биологическое вещество, категория B (UN3373) с соответствующим Dry Ice (UN1845) маркировки; следить IATA PI-650 инструкций.
- После получения, образцы хранятся при -65 ° C до -95 ° C, пока не будут проанализированы.
4. Размораживание и анализа проточной цитометрии
- Снимите окрашенных образцов из морозильной камеры таять при комнатной температуре в темноте до сбора на проточной цитометрии. Если сбор данных о более чем одного образца, стандартизировать процесс для всех труб шатаясь оттаивания так, чтобы трубы не сидят при комнатной температуре в течение более 1 часа каждый.
- Образцы должны быть приобретены с использованием четырех цитометра лазерных оборудованы соответствующими фильтрами, таких как BD LSRII. Используйте стандартные калибровки цитометра и флуоресцентных методов компенсации для сбора данных 4.
Примечание: Не устанавливайте вперед разброс порогов или боковой разброс во время сбора 5. Trucount бисер может упасть ниже минимально возможных пороговые значения для этих параметров вызывает множество шариков, чтобы не учитывается при анализе. Если требуется инструмент для установки порогового значения, установить минимально возможных Am Голубой канал порог. Потому что CD45 + лейкоциты окрашенных панелей будет Am Голубой положительные, и Trucount бисер также светиться в Am Голубой канал, это должно обеспечить все необходимые данные, чтобы быть надлежащим образом собраны.
- Vortex пробирку в течение 5 секунд до погрузки на проточной цитометрии. Trucount бисером флуоресцирует очень во многих каналов. Ворота бисер во время сбора, найдя населения, которая очень двойного положительного для ПЭ Cy5 и APC (два колоRS, что наиболее легко отличить бусы из клеток может изменяться в зависимости от аппаратуры). Выберите борта ворота, как ваша остановка ворот, и записи данных до минимум 20.000 бисер приобрел.
- Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения, таких как FlowJo (Treestar; Ashland, OR). На рисунке 1 показана схема стробирования используются для анализа различных популяций лейкоцитов от представителя ничьей крови контролем.
5. Trucount Расчеты
- Каждая трубка Trucount содержит лиофилизированный осадок люминесцентные бусины. После добавления жидкости в трубе и встряхиванием, шарики должны стать равномерно распределены по всему образцу. Количество бусин в гранулах немного отличается от номера партии и могут быть найдены на хранение сумку для труб.
- Ворота Trucount бисером и клеточных популяций, как показано на Рисунке 1, чтобы определить событие рассчитывает для каждой группы населения. Сравнивая количество событий яп борта ворота общее количество бисера, первоначально в трубе позволят вам определить соотношение собранных образцов, которые затем могут быть использованы для определения абсолютных концентраций (например, клеток / мкл) для каждой группы населения. Следующее уравнение может быть использовано для этой цели: Сотовый концентрации (# клеток / мкл цельной крови) = [# население события / (# шарик события / # общем бусины в гранулах)] / 100 мкл.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. Gating схема использована для анализа основных популяций лейкоцитов показывает репрезентативные данные от здоровых добровольцев. A) Trucount шарики (я) являются закрытого типа, и исключить из клетки. Гранулоцитов (II) очерчены и lympohcytes и моноциты делятся на 3 popluations: CD14отрицательное лимфоцитов (III), все негативные клетки CD14 (IV), и не-лимфоцитов (V). B) CD14 отрицательными лимфоциты закрытом отличить CD4 + Т-клеток (VI), CD8 + Т-клеток (VII), В-клетки (VIII), CD56 яркие NK клеток (IX), CD56 тусклом клеток NK (х) и CD56 отрицательными NK клеток (XI). C) Все CD14 негативные клетки являются закрытом отличить миелоидного (XII) и плазмацитоидных (XIII), дендритные клетки. D) Non-lympocytes являются закрытом отличить неклассической (XIV), промежуточный (XV), и классический (XVI) моноциты. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Более конкретная ячейка подмножества, которые не показаны на рисунке 1 (например, NKT клетки или нейтрофилы) также можно отличить с помощью панели мы представляем, и литниковой системы могут быть расширены или изменены в соответствии с конкретными потребностями исследования. Определенные шаги стробирования показаны уникальные для данного метода. Следует особо отметить, включение ворот иИсключение ворот тянутся по всему Trucount бисером и размещены на верхней части друг друга, один к воротам шарики для подсчета, и один, чтобы исключить бусы из сотовых анализа (рис. 1А). Кроме того, поскольку лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов не так легко отличить в цельной крови, как в мононуклеарных клетках периферической крови от рассеяния вперед и боковой разброс, стробирование этих клеток с помощью экспрессии CD45 и боковой разброс часто необходимо (рис. 1А). Загрязняющие гранулоцитов (в кружке), которые не могут быть отделены от лимфоцитов и моноцитов использованием CD45 и боковой разброс различимы в некоторых участках их высокой CD16 выражении (рис. 1С и рис. 1D). Количество загрязняющих гранулоцитов, как правило, небольшие, и они не мешают моноцитов и NK клетки стробирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном отчете мы представляем шарик на основе метода для перечисления популяции лейкоцитов в свежей цельной крови методом проточной цитометрии и охватывают параметры, необходимые для его использования в многоцентровых клинических испытаний с централизованным анализом образцов. Этот метод основан на и оптимизирует протокол BD Trucount и дает возможность ее надежного использования в многоцентровых клинических испытаний. Окрашивание теста проста и занимает около 45 минут для выполнения, что делает его возможным для крови техниками обработки лаборатории выполнять его и заморозить и отправить образцы для анализа центральной лаборатории для анализа. Анализа требуется всего 100 мкл цельной крови, что исключает необходимость временных и дорогостоящих PBMC обработки и использует гораздо меньший объем, чем стандартные анализы фенотипирования. Кроме того, с помощью свежей цельной крови, этот анализ более точно изображены в естественных условиях состояние клеток и устраняет негативные последствия криоконсервации наблюдается на некоторых типов клетокс 1-3. Этот метод окраски производит точные измерения концентрации клетки, но с дополнительным преимуществом различать значительно более типов клеток, чем CBC и других методов подсчета. Ключ к получению точных и последовательных результатов заключается в тщательном стандартизации важных шагов в протокол и использовать документацию система, которая отслеживает все шаги так, чтобы любые аномалии, обнаруженные можно проследить источник ошибки.
Есть несколько важных шагов на протяжении всего процесса, которые влияют на качество данных, полученных из этого анализа. Во-первых, стандартизация лечения и обработки крови от времени обращается на момент его окрашивают важно, подобное тому, что было ранее сообщалось PBMC обработки 6. Мы получим согласованные данные, когда кровь хранится в коллекции труб на клинической и доставлены в лаборатории обработки при температуре окружающей среды, окрашиваниеосуществляется в течение 4 часов взятия крови, а также окрашенных образцов затем отправлен на сухом льду в центральную лабораторию анализа. Кроме того, сделав антител коктейль в центральной лаборатории и отправки его в лабораторию сайте обработке, мы обеспечения согласованности между сайтами и может проверить каждый коктейль на ничью кровь контроль, прежде чем использовать, чтобы окрасить пробные образцы. Важно, что центральная лаборатория анализа стандартизировать этот процесс. Поэтому мы рекомендуем, что после учредительного антител титруют для оптимизации расстояния между положительными и отрицательными населения 7, та же участь антитела быть использован для окрашивания всех образцов в клинических испытаниях, чтобы поддерживать постоянный уровень окрашивания для каждого маркера. Если это невозможно (например, отсутствие наличия антител от производителя), каждой новой партии антитела должны быть надлежащим образом титруют чтобы убедиться, что данные проточной цитометрии будет сопоставима с полученной с использованием предыдущей много. Центральная лаборатория иСайт лаборатории обработки должны проявлять большую осторожность, чтобы транспортировать и хранить смесь антител при температуре 4 ° С и предотвращения попадания света, чтобы минимизировать деградацию, которые могут возникнуть, особенно в тандеме красителей 8-9.
Точность данных, полученных с помощью этого теста зависит от нескольких важных шагов во время процедуры окрашивания и образцы приобретения на проточной цитометрии. Следует особо отметить, точное обратное всасывание с кровью в Trucount трубки имеет важное значение, небольшая разница в объеме крови может иметь большое влияние на расчетные концентрации клеточных подмножеств. Встряхиванием при низкой скорости после добавления антител коктейль и BD FACS лизировать тщательно перемешать реагенты, также важно. Точно так же, встряхиванием полностью отказаться бусины равномерно по всей образца перед приобретением необходимо для точного подсчета 10. Незначительные изменения в анализе параметров проточной цитометрии также может иметь большое влияние на данные, полученные, так что окreful внимание должно быть уделено калибровки и настройки цитометра при ежедневном использовании 4.
Следует также отметить, что в то время как предварительные данные показывают, что замораживание окрашенных образцов, кажется, не влияют на клеточную концентрацию получил (данные не представлены), это еще не протестированы. Хотя это потенциальная проблема, сравнение образцов все еще может быть сделано с уверенностью, пока все образцы обрабатываются в согласованном порядке.
Тщательное отслеживание образца всей окрашивания и анализ особенно важен, особенно, когда сотни образцов обрабатываются в рамках клинических испытаний. После того как данные приобрела и начала анализа, важно стандартизировать анализ ворота как можно больше между образцами. Некоторые различия в флуоресценция определенных групп населения может возникнуть, особенно между различными добровольцами, но стандартные места ворота должны быть установлены, которые могут применятьсяКабель к так много образцов, как это возможно. Любое смещение ворот из стандартных место должно быть документально оформлены и приняты во внимание при определении, если изменения в подсчет клеток происходят между образцами.
Этот способ окрашивания был оптимизирован для перечисления основных подмножеств лейкоцитов с помощью одного антитела окрашивания панелей, но процедура и панели могут быть легко изменены в соответствии с конкретными потребностями исследования. В отличие от Trucount технические данные процедуры, которые предлагает использовать 50 мкл крови, мы представляем метод использует 100 мкл. При использовании большего объема крови, больше событий могут быть приобретены в ходе анализа, который полезен при изучении клеточных популяций с относительно низкой концентрации в периферической крови, таких как дендритные клетки. Хотя предыдущие исследования перечисленных дендритных клеточных популяций с помощью Trucount с использованием 50 мкл и 100 мкл объема крови 11-12, отчеты показывают, что разумная точность зависит от приобретения по меньшей мере 400 POSITIVНаселение электронной событий, и это часто может быть трудно с дендритных клеток при использовании только 50 мкл крови 13. Объем крови может быть использован в дальнейшем корректируется в соответствии с анализом требований для конкретных типов клеток или окрашивания панелей. Кроме того, окрашивание панелей может быть изменен, чтобы сосредоточиться на определенных типах клеток, что позволяет обеспечить перечисление более конкретных подмножеств ячейки в настоящее время не отличались панели показано здесь (например, дополнительные НК подмножеств клеток или регуляторных Т-клеток). Использование единой панели упрощает окрашивание протокол и уменьшает количество ошибок, связанных с нескольких панелей, таких как неправильной установки окрашенных образцов. Хотя использование нескольких панелей увеличивает затраты и вероятность ошибок, отдельных панелей с учетом конкретных типов клеток позволит более подробную фенотипирование и / или включение маркеров активации, и их использование может быть легко реализована в многоцентровых клинических испытаний, принимая во внимание соображения, ранее дискаussed.
| Маркер | Флуорофор | Компания | Клонирование |
| CD45 | Am Голубой | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | AX700 | BD Biosciences | РПА-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | IMMU-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <TD> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Таблица 1. Антитела окрашивания панелей для определения всех основных периферических популяций лейкоцитов крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Джессика Джонс, Эрик Кларк, Констанция Ducar, Донна Смит, Рой Льюис, Лили Apedaile, Джоан Визнер, Девин Адамс, Кори McBain и Стивен Voght за их помощь в развитии этого метода, рукописи и видео.
Эта работа была поддержана Фондом Билла и Мелинды Гейтс грант CAVD 38645 (MJM) и Национального института здоровья гранты UM1 AI068618 и U01 AI069481 (MJM). EA-N. при поддержке гранта NIH T32 AI007140. Мы благодарим Джеймс Б. Пендлтон благотворительного фонда за их щедрые пожертвования оборудованием.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
