Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)

Summary

Os detalhes do protocolo de artigo para site-specific transfecção de scrambled sequência de siRNA em uma cultura de células aderentes mamíferos usando uma rede de microeletrodos (MEA).

Abstract

A descoberta da via de RNAi em eucariotos e subsequente desenvolvimento de agentes de RNAi, como siRNA e shRNA, ter alcançado um método poderoso para silenciar genes específicos ^1-8 para genômica funcional e terapêutica. Um dos maiores desafios envolvidos em estudos de RNAi base é a entrega de agentes de RNAi para as células-alvo. As técnicas tradicionais de entrega não virais, tais como a electroporação em massa e métodos de transfecção químicos muitas vezes não têm o necessário controlo espacial sobre a entrega e proporcionar eficiências de transfecção pobres ^9-12. Avanços recentes em métodos químicos, tais como a transfecção lipidos catiónicos, polímeros catiónicos e nanopartículas têm resultado em eficiências de transfecção altamente melhorados ^13. No entanto, estas técnicas ainda não oferecem o controle espacial preciso sobre entrega que pode beneficiar imensamente miniaturizado tecnologias de alta capacidade, estudos de células individuais e investigação de interações célula-célula.

nt "> Recentes avanços tecnológicos na entrega de genes permitiram alto rendimento a transfecção de células aderentes ^14-23, a maioria dos quais utilizam electroporação microescala. electroporação microescala oferece controlo espaço-temporal preciso sobre o parto (até as células individuais) e tem sido demonstrado para obter eficiências elevadas ^{19, 24-26.} Além disso, as abordagens baseadas em electroporação não necessitam de um longo período de incubação (normalmente de 4 horas) com siRNA e complexos de ADN, conforme necessário, em métodos químicos à base de transfecção e levar à entrada directa de ADN nu, e siRNA moléculas no citoplasma celular. Como consequência a expressão de genes pode ser alcançada tão cedo quanto seis horas após a transfecção ^27. nosso laboratório tem demonstrado o uso de matrizes de microeletrodos (MEA) de sítio-específica de transfecção em culturas aderentes de células de mamíferos ^17-19. Na abordagem baseada MEA, a entrega de carga genética é conseguido através de micro-escala localizada electroporatina de células. Uma aplicação de impulsos eléctricos para os eléctrodos seleccionados gera campo eléctrico local que conduz a electroporação de células presentes na região dos eléctrodos estimulados. O controlo independente dos micro-eléctrodos proporciona um controlo espacial e temporal sobre a transfecção e também permite que múltiplas experiências de transfecção à base a ser executada com a mesma cultura aumentando o rendimento e reduzindo experimental de cultura para cultura de variabilidade.

Aqui nós descrevemos a montagem experimental e do protocolo para transfecção alvo de células HeLa aderentes com uma seqüência de siRNA fluorescente etiquetado mexidos com eletroporação. O mesmo protocolo pode também ser utilizado para a transfecção de vectores plasmídicos. Além disso, o protocolo aqui descrito pode ser facilmente alargada a uma variedade de linhas de células de mamíferos, com pequenas modificações. Disponibilidade comercial de MEAs com padrões de eletrodos tanto pré-definidos e personalizados fazer esta t técnica acessívela maioria dos laboratórios de pesquisa Ø com equipamento básico de cultura de células.

Protocol

1. MEA Preparação

1. MEAs para uso em experimentos de eletroporação pode ser fabricado usando a técnica de fotolitografia padrão, como descrito anteriormente ¹⁸ ou comprados diretamente de fornecedores de fabricantes MEA como Sistemas Multi Channel (http:/www.multichannelsystems.com/) e MED Alpha Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Os MEAs utilizados em nossos experimentos foram fabricados em casa na instalação de sala limpa na Universidade Estadual do Arizona, que é administrado pelo Centro de Pesquisas do Estado Sólido Eletrônica (CSSER). Os MEAs utilizados em nossos experimentos teve 32 índio eletrodos de óxido de estanho em um 8 por 4 matriz com tamanhos de eletrodos de diâmetro 50-200 mM dentro de um vidro 1 cm de diâmetro interior também. O vidro bem foi colada sobre a MEA usando polidimetilsiloxano (PDMS).
2. Esteriliza-se o MEA em autoclave antes da célula seeding. Outros métodos de esterilização, tais como a imersão em etanol a 70%, tratamento com UV e tratamento com água quente, tal como descrito noutro local também pode ser utilizado, desde que não comprometam a integridade do MEA.
3. Transfira a MEA autoclavado a uma capela de fluxo laminar e colocá-lo em um estéril prato de poliestireno padrão Petri. Antes de semear as células da MEA, esterilizar a câmara de fluxo laminar, ligando a luz UV durante 20 min. Se o MEA é sensível à luz UV cobrir a placa de Petri contendo o MEA com folha de alumínio estéril enquanto o capuz de fluxo está sob iluminação UV.

2. As células de sementeira no MEA

1. Células de colheita a partir de uma linha de células aderentes em execução de células de mamíferos utilizando tripsina / EDTA e elevá-las a uma concentração de 100-200 células / uL de 1 ml de meio de células de galvanização. Em nossas experiências, temos sido bem sucedidos em cultura de células NIH 3T3 linha de fibroblastos, células HeLa e linha primários neurônios corticais e do hipocampo no MEA.
2. 2 horas depois de semear as células transferir a placa de Petri com o MEA da incubadora a câmara de fluxo laminar e adicionar suavemente 400-500 ul de pré meios aquecidos (37 ° C) para o MEA bem. Verificar ao microscópio para garantir que as células que ainda estão presos e uniformemente distribuído sobre a superfície MEA. Transferir a volta MEA para a incubadora. O período de espera de 2 horas antes da adição de media garante um tempo suficiente para que as células adiram à superfície MEA. Além dos meios de comunicação celulares também logo após a semeadura das células pode lavar as células. Se as células não aderem bem no MEA, a sua superfície pode ser tratada com factores de fixação de células aspolylysine tal, fibronectina, laminina e para melhorar a adesão celular. Em nossos experimentos com células HeLa que normalmente tratam a superfície MEA com fibronectin (10 ug / ml) durante 1-2 horas.
3. 8-12 horas após a sementeira das células, executa 1-2 lavagens com PBS para remover as células mortas. Meio celular pode substituir cada 24-48 horas, conforme necessário. Numa experiência típica, as células são usualmente preparados para a transfecção 24-48 horas após a sementeira. Para manter a consistência na eficácia de electroporação, recomenda-se esperar que a cultura é de pelo menos 80% confluentes antes da electroporação.

3. Site-specific A transfecção de siRNA

1. Preparar uma solução de ácido nucleico. Para a transfecção siRNA, preparar uma solução de 1-2 uM de electroporação em gelo siRNA tampão de electroporação gelado para atingir um volume final de 200-400 ul. Neste artigo de vídeo que demonstram a transfecção de células HeLa com Alexa 488 scrambled sequência conjugado de siRNA.
2. Transferir o MEA com as células a partir do incubador a capa de fluxo laminar estéril. Remover os meios de comunicação celular a partir da MEA e efectuar uma lavagem com PBS. Em seguida, adicione 200-400 ul do ice frio de 1 uM solução eletroporação de siRNA para o bem.
3. Aplicar anódicas quadrados impulsos elétricos para os eletrodos direcionados (Consulte o passo 4 para determinar os parâmetros ótimos do pulso elétrico). Em nossos experimentos utilizamos uma Instrumentos pragmáticas gerador de onda 2414A para gerar pulsos elétricos e um dual-inline-package (DIP) 16 clipe pino para fazer contato com as pastilhas de títulos MEA. O gerador de forma de onda pode ser ligado ao clipe DIP através de uma placa de circuito impresso para proporcionar demultiplexor selectividade dos eléctrodos individuais. Para o eléctrodo de referência, coloque um cátodo de aço nos meios de comunicação celular. , Baixando o eléctrodo de referência de aço nos meios de comunicação, é extremamente importante para assegurar que não entra em contacto com a superfície do MEA. Em contacto, pode provocar danos nas células e o MEA. Recomenda-se a diminuir o eléctrodo de referência para uma posição, de 1 mm acima das células. Um espaçador com uma altura de 1 mm pode ser colocada no poço para auxiliar no posicionamento da refeletrodo cia. Uma abordagem alternativa ao uso de um eletrodo de referência externo é usar eletrodos vizinhos como cátodo ânodo-pares.
4. Imediatamente após a aplicação dos impulsos eléctricos para os eléctrodos de alvo no MEA, transferir o MEA volta para a incubadora. Após um período de incubação de 5 min, colocar suavemente a 75% do tampão de electroporação, com pré-aquecido (37 ° C) meios de comunicação celular. Mais tarde, imagiologia fluorescente pode ser feito para confirmar a entrega de siRNA fluorescentemente marcado para as células.

4. Otimização de parâmetros eletroporação

1. Para determinar os parâmetros óptimos de impulsos eléctricos para electroporação, as experiências de electroporação de design para um intervalo de valores de amplitude de pulso, duração do impulso, e o número de pulsos. Na nossa experiência com as células HeLa, observou-se que um impulso de tensão de amplitude única de 3 V a 9 V, e duração de 1 mseg e 10 mseg para um tamanho de 100 um eléctrodo levaram a electroporação com sucesso mimorte celular nimal. É nossa recomendação que um parâmetro ser variada de cada vez e os outros são mantidas constantes. Para quantificar a eficiência da electroporação para cada um dos parâmetros de pulso, usamos iodeto de propídio (PI), um corante impermeante celular que o material de manchas nucleico e metodologia de ensaio baseado em directo, tal como descrito nos passos de 4,2-4,5.
2. Estabelecer uma cultura de células sobre a MEA seguindo as instruções descritas nos passos 1 e 2.
3. Antes da electroporação preparar um pi 300-500, de 30 ug / ml de solução em tampão de PI electroporação frio e 400 ul de 4 uM calcien AM solução em PBS.
4. Transferir o MEA da incubadora para a câmara de fluxo laminar. Remover os meios de comunicação celular a partir da MEA e efectuar uma lavagem com PBS. Em seguida, adicione 300-500 ul do tampão de electroporação arrefecido em gelo com PI.
5. Aplicar pulsos elétricos com amplitude e duração do pulso desejado para os eletrodos direcionados (O equipamento utilizado em nossos experimentos para gerar e aplicar o elecpulso tric a MEA é descrito na etapa 3.3.) Para o eléctrodo de referência ou um eléctrodo de aço diminuir no tampão de electroporação no MEA bem ou utilizar o eléctrodo vizinho como referência. Ao aplicar selectivamente pulsos de amplitudes diferentes ou durações de eléctrodos diferentes experiências múltiplas pode ser realizada no mesmo dispositivo. Por exemplo, em um 32 eléctrodo de MEA, 8 experiências podem ser realizadas através da divisão dos 32 eléctrodos em 8 grupos, cada um consistindo de quatro eléctrodos. Cada um dos 8 grupos podem então ser estimuladas por um pulso de voltagem rectangular único de duração de 5 mseg com amplitudes variando em 3 V-6 série V em incrementos de 0,5 V e um grupo pode ser usado como um controlo.
6. Imediatamente após a aplicação dos impulsos de tensão transferir a MEA na incubadora durante 5 min. Depois, remover suavemente a 75% do tampão de electroporação da MEA bem e substituí-la por meio de células quentes. Transferir a volta MEA para a incubadora.
7. Após um período de incubação de 2-4 hrsubstituir o meio de células no MEA bem com 300-500 ul de calceína 4 mM AM solução em PBS. Transferir a volta MEA a incubadora durante mais 30 minutos.
8. A seguir à incubação das células com calceína AM, substituir a calceína AM solução no MEA bem com PBS, depois duas lavagens com PBS. Obtenção de imagens fluorescentes das células utilizando um microscópio óptico com com filtros para PI (excitação / emissão - 535 nm/617 nm) e calceína AM (excitação / emissão - 490 nm/520 nm). A captação de PI, devido a eletroporação, faz com que células de fluorescência vermelha ea AM Calcein faz as células que estão vivos para fluorescência verde. Três cenários possíveis que podem ser observados são: 1) celulares eletroporados e vivo fica fluorescente (vermelho e verde), 2) células vivas, mas não eletroporadas (será apenas verde fluorescente) e 3) células mortas devido a eletroporação (só fica fluorescente vermelha) . A viabilidade celular foi calculada como uma percentagem do número total de células vivas no eléctrodo e a electroporação efficiency foi calculada como uma percentagem do número total de células carregadas com PI / siRNA.

5. Resultados representativos

A Figura 1 mostra a carga específica do local de células HeLa com PI. Pode-se observar que apenas as células do eléctrodo demonstram uma absorção de PI (Figura 1B). Um ensaio ao vivo realizada pós electroporação foi utilizado para avaliar a viabilidade das células (Figura 1A). A eficiência de electroporação e a viabilidade das células para o exemplo mostrado na Figura 1 são de 81,8% e 96,1%, respectivamente. A viabilidade celular elevada e a eficiência de electroporação pode ser conseguida através da optimização dos parâmetros de electroporação de pulso. Site-specific a transfecção de células Hela com siRNA fluorescentemente marcado para um pulso de electroporação optimizado (8 V, 1 ms) é mostrado na Figura 2. A eficiência de electroporação para o siRNA de 8 V, 1 ms foi encontrado para ser 74,4 ± 16,0% eA viabilidade celular foi encontrado para ser 87,9 ± 8,4% (todos os dados representados como a média ± desvio padrão, n = 5).

Figura 1. Entrega específica do local de PI em células HeLa num eléctrodo 200 uM (6 V, 5 ms). A) Calcien ensaio baseado vivo realizados dois electroporação pós hr. Células vivas são indicados por fluorescência verde. B) Vermelho de fluorescência demonstra a captação de PI por células sobre o eléctrodo. C) Uma imagem sobreposta de A e B. As setas brancas indicam células que são electroporated e viva. As setas pretas indicam que as células são mortas. O círculo branco em A, B e C indicam o contorno do eléctrodo.

Figura 2. Transfecção de células HeLa com scrambl fluorescentemente marcadoseqüência e de siRNA. A) Imagem de células HeLa sobre um eléctrodo de 100 uM transfectadas com siRNA Alexa 488 marcado (8 V, 1 ms). B) Imagem de núcleos de células coradas com DAPI. O círculo branco marca a extremidade do eléctrodo.

Discussion

Neste artigo de vídeo que demonstram a utilização de MEA por site-specific transfecção de células HeLa com scrambled sequência de siRNA. Uma das vantagens desta tecnologia é a sua aplicabilidade a diferentes linhas de células, incluindo linhas de células primárias. O nosso laboratório tem demonstrado previamente a utilização desta tecnologia para o site-specific transfecção de cultura primária do hipocampo neuronal de rato E18 dia de idade e células NIH-3T3 com sequências de siRNA mexidos e GFP plasmídeo ^{18, 19.} Também tivemos sucesso na entrega de siRNA funcional contra um alvo endógeno em células HeLa (dados não publicados). A MEA típico disponível comercialmente é compatível com a imagiologia óptica (microscópio vertical), permitindo a avaliação quantitativa do impacto funcional de silenciamento de genes, utilizando técnicas imunorreatividade fluorescentes. Além disso, os microeléctrodos de MEA pode ser utilizado para monitorizar a actividade eléctrica de células, tais como os neurónios primários, em resposta a perturbação genética. Onatureza única de MEA permite simultâneas múltiplas experiências de cultura de células em um único, aumentando desse modo a taxa de transferência experimental. Actualmente, uma grande limitação com o sistema MEA base é a grande quantidade de siRNA necessário para a transfecção (400 ul de 1 uM siRNA), que é elevado em comparação com as abordagens químicas convencionais de transfecção à base e, portanto, limita a eficácia de custo do sistema. Isto pode em parte ser superada incorporando mircofluidics com o sistema MEA base para reduzir o volume total da solução de eletroporação siRNA para menos de alguns microlitros. Além disso, os microfluidos pode permitir a entrega de série de moléculas de siRNA diferentes; aumentando substancialmente a taxa de transferência da tecnologia baseada MEA. Alternativamente, moléculas de siRNA pode ser notado nas microeléctrodos antes da semeadura das células e, em seguida, as moléculas de siRNA pode ser transfectado em células por electroporação inversa ^{15, 23.} Desenvolvimento desta tecnologia oferece um romance de alta tmétodo de custo hroughput, eficiente e de baixo para estudos de manipulação de genes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.