Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

Summary

El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).

Abstract

El descubrimiento de la vía de RNAi en eucariotas y el posterior desarrollo de los agentes de ARNi, como siRNA y shRNA, han logrado un método potente para el silenciamiento de genes específicos de ^1-8 para la genómica funcional y la terapéutica. Un reto importante involucrado en estudios basados ​​en RNAi es el suministro de agentes de ARNi a células diana. Tradicionales técnicas no víricas de envío, tales como electroporación grandes cantidades y métodos químicos de transfección a menudo carecen del control necesario espacial sobre la entrega y proporcionar eficiencias de transfección ^9-12 pobres. Los recientes avances en los métodos de transfección químicas tales como lípidos catiónicos, polímeros catiónicos y nanopartículas han dado lugar a eficiencias de transfección muy mejoradas ^13. Sin embargo, estas técnicas aún no ofrecen un control preciso espacial sobre la entrega que se pueden beneficiar inmensamente miniaturizado tecnologías de alto rendimiento, estudios de células individuales y la investigación de las interacciones célula-célula.

nt "> avances tecnológicos recientes en la administración génica han permitido alto rendimiento de transfección de células adherentes ^14-23, una mayoría de los cuales utilizan electroporación microescala. electroporación Microscale ofrece espacio-temporal preciso control sobre la entrega (hasta células individuales) y se ha demostrado para lograr altas eficiencias de ^{19, 24-26.} Además, los enfoques basados ​​en la electroporación no requieren un prolongado período de incubación (típicamente de 4 horas) con complejos de DNA y siRNA como sea necesario en los métodos químicos de transfección basados ​​en y conducir a la introducción directa de ADN desnudo y siRNA moléculas en el citoplasma de la célula. Como consecuencia la expresión génica se puede lograr tan pronto como seis horas después de la transfección ^27. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de matrices de microelectrodos (MEA) para sitio específico de transfección en cultivos celulares de mamíferos adherentes ^17-19. En el enfoque basado en MEA, entrega de carga genética se logra a través de micro-escala localizada electroporatien las células. Una aplicación de pulsos eléctricos a los electrodos seleccionados genera el campo eléctrico local que conduce a la electroporación de células presentes en la región de los electrodos estimulados. El control independiente de los microelectrodos proporciona un control espacial y temporal sobre la transfección y también permite múltiples experimentos de transfección basados ​​en que se realizará en el mismo cultivo aumentando la producción experimental y la reducción de la cultura a la cultura variabilidad.

Aquí se describe la configuración experimental y el protocolo para la transfección selectiva de adherentes células HeLa con un siRNA secuencia de marcado con fluorescencia codificado utilizando electroporación. El mismo protocolo también puede ser utilizado para la transfección de vectores de plásmido. Además, el protocolo aquí descrito puede extenderse fácilmente a una variedad de líneas celulares de mamíferos, con modificaciones menores. Disponibilidad comercial de los acuerdos ambientales multilaterales con modelos de electrodos tanto predefinidos y personalizados que este t técnica accesibleo La mayoría de los laboratorios de investigación con equipo básico de cultivo celular.

Protocol

1. MEA Preparación

1. MEA para su uso en experimentos de electroporación puede ser fabricado utilizando la técnica de fotolitografía estándar como se describe anteriormente ¹⁸ o comprados directamente a los vendedores de los fabricantes de MEA, tales como sistemas de canales múltiples (http:/www.multichannelsystems.com/) y alfa MED Scientific Inc., ( http://www.MED64.com) . Los AMUMA utilizados en nuestros experimentos se fabrican en el local en la sala limpia en Arizona State University, el cual es administrado por el Centro de Investigación Electrónica de estado sólido (CSSER). Los AMUMA utilizados en nuestros experimentos con 32 electrodos de óxido de estaño e indio en un 8 por 4 matriz con diámetros de electrodos 50 a 200 micras dentro de un vaso 1 cm de diámetro interior también. El vidrio también se unió a la MEA polidimetilsiloxano utilizando (PDMS).
2. Esterilizar el MEA en autoclave antes de célula seeding. Otros métodos de esterilización tal como un remojo en 70% de etanol, tratamiento UV y tratamiento con agua caliente como se describe en otra parte también se puede utilizar siempre y cuando no comprometan la integridad de la MEA.
3. Transferir el autoclave MEA a una campana de flujo laminar y colocarlo en un patrón de poliestireno placa de Petri estéril. Antes de la siembra de células sobre la MEA, esterilizar la campana de flujo laminar mediante la activación de la luz UV durante 20 min. Si el MEA es sensible a la luz UV cubrir la placa de Petri que contiene el MEA con papel de aluminio estéril mientras que la campana de flujo es bajo iluminación UV.

2. Las células siembra sobre el MEA

1. Cosecha células de una línea celular adherente de funcionamiento de las células de mamífero utilizando tripsina / EDTA y elevarlas a una concentración de 100-200 células / l en 1 ml de medio de células para la siembra. En nuestros experimentos hemos tenido éxito en el cultivo de línea celular NIH 3T3 fibroblastos, la línea de células HeLa y neuronas corticales primarias del hipocampo y en el MEA.
2. 2 horas después de la siembra de las células transferir la placa de Petri con el MEA de la incubadora para campana de flujo laminar y suavemente añadir 400-500 l de preparación de soportes calentado (37 ° C) a la MEA bien. Ver bajo el microscopio para asegurar que las células están todavía unido y distribuida uniformemente en la superficie de MEA. Transferir la parte posterior MEA a la incubadora. El período de 2 hr de espera antes de la adición de medios de comunicación asegura un tiempo suficiente para que las células se adhieran a la superficie de MEA. La adición de medios de células demasiado pronto después de la siembra de las células puede lavar las células. Si las células no se adhieren bien sobre la MEA, su superficie puede ser tratada con factores de unión celular, tales aspolylysine, fibronectina y laminina para mejorar la adhesión celular. En nuestros experimentos con células HeLa que solemos tratar la superficie con MEA fibronectin (10 ug / ml) durante 1-2 hr.
3. 8-12 horas después de la siembra de las células, realizar 1-2 lavados con PBS para eliminar las células muertas. Medio celular puede cambiarse cada 24-48 horas, según sea necesario. En un experimento típico, las células generalmente están listos para la transfección 24-48 h después de la siembra. Para mantener la coherencia en la eficiencia de la electroporación, se recomienda que esperar hasta que el cultivo es de al menos 80% confluentes antes de la electroporación.

3. Específica de sitio La transfección de siRNA

1. Preparar la solución de ácido nucleico. Para la transfección siRNA, preparar un siRNA 1-2 mM solución electroporación en tampón de electroporación enfriado en hielo para alcanzar un volumen final de 200-400 l. En este artículo de vídeo se demuestra la transfección de células HeLa con Alexa 488 conjugada revueltos secuencia de siRNA.
2. Transferir la MEA con células de la incubadora a la campana de flujo laminar estéril. Eliminar los medios celulares a partir de la MEA y realizar un lavado con PBS. Después de eso, añadir 200-400 l de la ice frío 1 mM siRNA electroporación solución al pozo.
3. Aplicar anódicos impulsos eléctricos a los electrodos cuadrados específicas (Consulte el paso 4 para determinar los parámetros óptimos de los impulsos eléctricos). En nuestros experimentos hemos utilizado algunos instrumentos pragmáticos 2414a generador de forma de onda para generar impulsos eléctricos y una dual-inline-paquetes (DIP) 16 pin clip de entrar en contacto con los terminales de unión de los AMUMA. El generador de forma de onda puede ser conectado a la pinza DIP a través de una placa de circuito impreso demultiplexor para proporcionar selectividad de los electrodos individuales. Para el electrodo de referencia, colocar un cátodo de acero en los medios celulares. Aunque bajar el electrodo de referencia de acero en los medios de comunicación es extremadamente importante para asegurarse de que no hace contacto con la superficie del MEA. Tras el contacto, puede causar daño a las células y la MEA. Se recomienda para bajar el electrodo de referencia a una posición de 1 mm por encima de las células. Un separador con una altura de 1 mm puede ser colocado en el pozo para ayudar en la colocación de la refrencia electrodo. Un enfoque alternativo a la utilización de un electrodo de referencia externo es el uso de electrodos vecinos como pares de ánodo cátodo.
4. Inmediatamente después de aplicar los impulsos eléctricos a los electrodos de destino de la MEA, transferir la parte posterior MEA a la incubadora. Después de un período de incubación de 5 min, suavemente reemplazar 75% del tampón de electroporación con pre-calentado (37 ° C) medios celulares. Más tarde, fluorescente de imágenes puede realizarse para confirmar la entrega de ARNsi marcado fluorescentemente a las células.

4. Electroporación optimización de parámetros

1. Para determinar los parámetros óptimos de impulsos eléctricos para electroporación, diseñar experimentos de electroporación para una gama de valores de amplitud de pulso, duración del pulso, y el número de pulsos. En nuestra experiencia con células HeLa, se observó que un pulso de voltaje único de la amplitud de 3 V a 9 V, y la duración de 1 ms a 10 ms para un electrodo de tamaño de 100 micras llevaron a electroporación con éxito millasla muerte celular nimal. Es nuestra recomendación de que un parámetro puede variar a la vez y los demás se mantienen constantes. Para cuantificar la eficiencia de la electroporación para cada uno de los parámetros del pulso, se utiliza yoduro de propidio (PI), un colorante impermeant celular que el material de manchas nucleico, y la metodología de ensayo basado en directo, como se describe en los pasos 4.2-4.5.
2. Establecer un cultivo de células en el MEA siguiendo las instrucciones descritas en los pasos 1 y 2.
3. Antes de la electroporación preparar un 300-500 l de 30 mg / ml de solución PI en tampón de electroporación enfriada con hielo y 400 l de 4 mM calcien AM solución en PBS.
4. Transferir la MEA de la incubadora a la campana de flujo laminar. Eliminar los medios celulares a partir de la MEA y realizar un lavado con PBS. Después de eso, añadir 300-500 l del tampón de electroporación hielo frío con PI.
5. Aplicar impulsos eléctricos con la amplitud del pulso deseado y la duración de los electrodos dirigidos (El equipo usado en nuestros experimentos para generar y aplicar la electric pulso a la MEA se describe en el paso 3,3). Para el electrodo de referencia, bien bajar un electrodo de acero en el tampón de electroporación en la MEA o bien utilizar el electrodo vecino como referencia. Aplicando selectivamente impulsos de distintas amplitudes o duraciones de diferentes electrodos múltiples experimentos se pueden realizar en el mismo dispositivo. Por ejemplo, en un electrodo de 32 MEA, 8 experimentos se pueden realizar mediante el fraccionamiento de los 32 electrodos en 8 grupos, cada uno compuesto de 4 electrodos. Cada uno de los 8 grupos entonces puede ser estimulado por un pulso rectangular de una sola tensión de una duración de 5 ms con amplitudes que varían en 3 V-6 rango de V en incrementos de 0,5 V y un grupo se puede utilizar como un control.
6. Inmediatamente después de aplicar los impulsos de tensión transferir el MEA a la incubadora durante 5 min. Posteriormente, retirar suavemente el 75% del tampón de electroporación de la MEA bien y reemplazarlo con medios celulares cálidos. Transferir la parte posterior MEA a la incubadora.
7. Después de un periodo de incubación de 2-4 hrsustituir los medios celulares en el MEA bien con 300-500 l de 4 mM de calceína AM solución en PBS. Transferir la parte posterior MEA a la incubadora durante otros 30 min.
8. Después de la incubación de las células con calceína AM, sustituir la solución de calceína AM en el MEA bien con PBS después de dos lavados con PBS. Obtener imágenes fluorescentes de las células utilizando un microscopio óptico con filtros para PI (excitación / emisión - 535 nm/617 nm) y calceína AM (excitación / emisión - 490 nm/520 nm). La captación de PI, debido a la electroporación, hace que las células fluorescencia roja y la calceína AM hace que las células que están vivas que emite fluorescencia verde. Tres escenarios posibles que se pueden observar son: 1) celulares electroporadas y vivo será fluorescente (rojo y verde), 2) células vivas pero no electroporación (sólo presenta fluorescencia verde) y 3) células muertas debido a la electroporación (sólo presenta fluorescencia roja) . La viabilidad celular se calcula como un porcentaje del número total de células vivas en el electrodo y la electroporación efficiency se calculó como porcentaje del número total de células cargadas con PI / siRNA.

5. Los resultados representativos

La Figura 1 muestra la carga específica del sitio de células HeLa con PI. Se puede observar que sólo las células en el electrodo de demostrar una captación de PI (Figura 1B). Un ensayo realizado en vivo después de la electroporación se utilizó para evaluar la viabilidad de las células (Figura 1A). La eficiencia de la electroporación y la viabilidad celular para el ejemplo mostrado en la Figura 1 son 81,8% y 96,1% respectivamente. Alta viabilidad celular y la eficiencia de la electroporación se puede lograr mediante la optimización de los parámetros del pulso de electroporación. Sitio específico de la transfección de células HeLa con ARNsi marcado fluorescentemente y para un pulso de electroporación optimizado (8 V, 1 ms) se muestra en la Figura 2. La eficiencia de la electroporación para el siRNA en V 8 mseg, 1 se encontró que era 74,4 ± 16,0% yla viabilidad celular se encontró que era 87,9 ± 8,4% (todos los datos representados como media ± desviación estándar, n = 5).

Figura 1. Específica de sitio de entrega de PI en células HeLa en un electrodo m 200 (6 V, 5 mseg). A) calcien ensayo basado en directo interpretada 2 h después de la electroporación. Células vivas se indican con fluorescencia verde. B) Red de fluorescencia demuestra la captación de PI por las células en el electrodo. C) Una imagen superpuesta de A y B. Las flechas blancas indican que las células se someten a electroporación y vivo. Las flechas negras indican que las células están muertas. El círculo blanco en A, B y C indica el contorno del electrodo.

Figura 2. Transfección de células HeLa con scrambl marcado fluorescentementee secuencia de siRNA. A) Imagen de células HeLa en un electrodo 100 micras transfectadas con siRNA Alexa 488 marcado (8 V, 1 mseg). B) Imagen de núcleos de células teñidas con DAPI. El círculo blanco marca el borde del electrodo.

Discussion

En este artículo de vídeo que demuestran el uso de MEA para sitio específico de la transfección de células HeLa con revueltos secuencia de siRNA. Una de las ventajas de esta tecnología es su aplicabilidad a diferentes líneas celulares, incluyendo líneas celulares primarias. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de esta tecnología específica de sitio primario de la transfección de cultivo neuronal de hipocampo de rata E18 días de edad y células NIH-3T3 con revueltos secuencias de siRNA y GFP plásmido ^{18, 19.} También hemos tenido éxito en la entrega de siRNA funcional contra una diana endógeno en células HeLa (datos no publicados). Un típico MEA comercialmente disponible es compatible con formación de imágenes ópticas (microscopio vertical), que permite una evaluación cuantitativa de impacto funcional de silenciamiento de genes, utilizando técnicas fluorescentes de inmunotinción. Además, los microelectrodos en MEA se puede utilizar para controlar la actividad eléctrica de las células, tales como las neuronas primarias, en respuesta a la perturbación genética. Lanaturaleza única de MEA permite simultáneamente varios experimentos en un cultivo de células individuales, lo que aumenta el rendimiento experimental. Actualmente una limitación importante con el sistema basado en MEA es la gran cantidad de siRNA necesario para la transfección (400 l de 1μM siRNA), que es alta en comparación con los enfoques convencionales de transfección basados ​​en químicos y por lo tanto limita la rentabilidad del sistema. En parte, esto se puede superar mediante la incorporación de mircofluidics con el sistema basado en MEA para disminuir el volumen total de solución de siRNA electroporación a menos de unos pocos microlitros. Además, los microfluidos puede habilitar la entrega de serie de moléculas de siRNA diferentes; mejorando así, enormemente el rendimiento de la tecnología basada en MEA. Alternativamente, las moléculas de siRNA pueden ser vistos en los microelectrodos antes de la siembra de células y entonces las moléculas de siRNA pueden ser transfectados en las células por electroporación inversa ^{15, 23.} Un mayor desarrollo de esta tecnología ofrece una novela de gran throughput costo, eficiente y de bajo método para los estudios de manipulación de genes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.