Высокая эффективность, определенных сайтов Трансфекция прилипшие клетки с помощью миРНК Микроэлектродные массивы (MEA)

Summary

В статье подробно протокол для сайт-специфической трансфекции яичницу последовательности миРНК в приверженцем культуры млекопитающих ячейки с помощью микроэлектродов массива (МПС).

Protocol

1. МЭС подготовка

1. МЭС для использования в экспериментах электропорации может либо быть изготовлены с использованием стандартной техники фотолитографии, как описано ранее ¹⁸ или приобрести непосредственно у поставщиков производителей MEA, такие как многопользовательская система Channel (http:/www.multichannelsystems.com/) и альфа-MED Scientific, Inc ( http://www.MED64.com) . МПС используются в наших экспериментах были изготовлены в доме на чистое средство номер в университете штата Аризона, который находится в ведении Центра по твердотельной электроники исследований (CSSER). МЭС использовали в наших экспериментах было 32 индия электродов оксида олова в 8 на 4 массива с электродами диаметром от размеров 50-200 мкм в пределах 1 см внутренний диаметр стекла хорошо. Стекла также были связаны с MEA Используя полидиметилсилоксана (PDMS).
2. Стерилизовать MEA в автоклаве до клетки сeeding. Другие методы стерилизации, такие как замачивание в 70% этаноле, УФ-обработки и горячей обработки воды, как описано в другом месте также может быть использован как долго они не ставят под угрозу целостность МПС.
3. Передача автоклавного МЭА ламинаре и поместить его в стандартный стерильную чашку Петри полистирола. До посева клеток на MEA, стерилизовать капотом ламинарного потока путем включения УФ-светом в течение 20 мин. Если MEA чувствителен к ультрафиолетовому излучению покрытие чашки Петри содержащие MEA стерильной алюминиевой фольги, в то время как поток капот под действием УФ-освещения.

2. Посев Ячейки MEA

1. Урожай клетки работают клеточной линии приверженцем клетках млекопитающих, используя трипсин / ЭДТА и поднять их до концентрации 100-200 клеток / мкл в 1 мл клеточную среду для посева. В наших экспериментах мы добились успеха в культивировании NIH 3T3 клетки фибробласты линии, линия клеток HeLa и первичных корковых нейронов гиппокампа и на МПС.
2. 2 ч после посева клеток переносить чашки Петри с MEA из инкубатора для ламинарного потока капот и аккуратно добавьте 400-500 мкл предварительно подогревается СМИ (37 ° C) в МЭС хорошо. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки все еще привязаны и равномерно распределить по поверхности МЭС. Передача назад МЭА в инкубаторе. 2 часа период ожидания перед добавлением средств массовой информации обеспечивает достаточно времени для клеток придерживаться с поверхностью МПС. Добавление ячейки СМИ вскоре после посева клеток может смыть клетки. Если клетки не придерживаются также на MEA, его поверхность можно лечить с помощью прикрепления клеток такие факторы, aspolylysine, фибронектина и ламинина для улучшения адгезии клеток. В наших экспериментах клетки HeLa мы обычно обработать поверхность MEA с fibronectiл (10 мкг / мл) в течение 1-2 часов.
3. 8-12 ч после посева клеток, выполняют 1-2 промывок PBS для удаления мертвых клеток. Сотовые среда может менять каждые 24-48 часа по мере необходимости. В типичном эксперименте, клетки, как правило, готовы к трансфекции 24-48 ч после посева. Для обеспечения согласованности в электропорации эффективности рекомендуется подождать, пока культура не менее 80% вырожденная до электропорации.

3. Сайт-специфическая Трансфекция миРНК

1. Подготовка нуклеиновые кислоты. Для миРНК трансфекции, готовить 1-2 мкм миРНК электропорации решение в ледяном буфере электропорации для достижения конечного объема 200-400 мкл. В этом видео статье мы покажем, трансфекции клеток HeLa с Alexa 488 сопряженной яичницу последовательности миРНК.
2. Передача MEA с клетками из инкубатора к стерильным ламинаре. Удалить ячейки массовой информации в МПС и выполнить промывку PBS. После этого, добавьте 200-400 мкл яCE холодного 1 мкМ миРНК электропорации решение хорошо.
3. Применить анодных квадратных электрических импульсов к целевым электродами (см. шаг 4 для определения оптимальных параметров электрического импульса). В наших экспериментах мы использовали прагматические инструменты 2414A Генератор сигналов для генерации электрических импульсов и двойной встроенный пакет (DIP) 16 контактный клип вступить в контакт с прокладками MEA связи. Генератор сигналов может быть подключен к DIP-клип с помощью демультиплексора печатной платы, чтобы обеспечить селективность отдельных электродов. Для электрода сравнения, поместить стального катода в ячейке СМИ. При опускании электродов сталь ссылки в СМИ крайне важно, чтобы убедиться, что он не имеет контакта с поверхностью МПС. При контакте, это может привести к повреждению клеток и МПС. Рекомендуется снизить электрод в положение 1 мм над клетками. Прокладка с высоты 1 мм могут быть размещены в хорошо для оказания помощи в размещении ссылокразностных электрода. Альтернативный подход к использованию внешних электрода сравнения заключается в использовании соседних электродов катод-анод пар.
4. Сразу же после применения электрических импульсов к целевому электродов на MEA, передает назад МЭА в инкубаторе. После инкубации в течение 5 мин, аккуратно заменить 75% электропорации буфера с подогретого (37 ° C) средства массовой информации клетки. Позже, флуоресцентные изображения может быть сделано для подтверждения доставки флуоресцентно отмеченных миРНК в клетки.

4. Оптимизация параметров электропорации

1. Для определения оптимальных параметров электрического импульса для электропорации, дизайн электропорации экспериментов для различных значений амплитуды импульсов, длительность импульса и количество импульсов. Как показывает наш опыт с клетками HeLa, мы обнаружили, что одного импульса напряжения амплитудой от 3 В до 9 В и длительностью от 1 мс до 10 мс для электродов размером 100 мкм привело к успешному электропорации мильНимал гибели клеток. Это наша рекомендация, что один параметр можно варьировать в то время, и другие остаются постоянными. Для количественной оценки эффективности электропорации для каждого из параметров импульса, мы используем пропидия йодида (PI), краситель клетки impermeant, что пятна нуклеиновых материалом, и живой анализа на основе методологии, как описано в пунктах 4.2-4.5.
2. Создание клеточной культуры на МПС в соответствии с направлениями, указанными в пунктах 1 и 2.
3. До электропорации подготовить 300-500 мкл 30 мкг / мл PI решение в ледяном буфере электропорации и 400 мкл 4 мкМ calcien AM решение в PBS.
4. Передача MEA из инкубатора в ламинарном боксе. Удалить ячейки массовой информации в МПС и выполнить промывку PBS. После этого, добавьте 300-500 мкл ледяного буфера электропорации с PI.
5. Применение электрических импульсов с заданной амплитудой и длительностью импульса к целевым электродов (оборудование, используемые в наших экспериментах для создания и применения электронныхэлектрического импульса на MEA описано в шаге 3,3). Для электрода либо снизить стали электрод в электропорации буфера в МЭС хорошо или использовать соседний электрод в качестве ссылки. По выборочного применения импульсов различной амплитуды и продолжительности различных электродов многочисленные эксперименты могут быть выполнены на том же устройстве. Например, на 32 электродов MEA, 8 эксперименты могут быть выполнены путем расщепления на 32 электродов в 8 групп, каждая из которых состоит из 4 электродов. Каждый из 8 групп может быть стимулировано одного прямоугольного импульса напряжения длительностью 5 мс с амплитудой в 3 различных V-6 Диапазон V с шагом 0,5 В и одну группу могут быть использованы в качестве контроля.
6. Сразу после нанесения импульсов напряжения передать МЭА в инкубаторе в течение 5 мин. Затем аккуратно удалить 75% электропорации буфер из MEA хорошо, и заменить его теплой СМИ ячейки. Передача назад МЭА в инкубаторе.
7. После инкубационного периода в 2-4 часазаменить ячейку средств массовой информации в МПС и в 300-500 мкл 4 мкМ Calcein AM решение в PBS. Передача назад МЭА в инкубаторе в течение еще 30 мин.
8. После инкубации клеток с Calcein AM, заменить Calcein AM решения в МЭС хорошо с PBS после двух промывок PBS. Получить флуоресцентных изображений клеток с использованием с помощью оптического микроскопа с фильтрами для ПИ (возбуждение / излучение - 535 nm/617 нм) и Calcein AM (возбуждение / излучение - 490 nm/520 нм). Поглощение PI, в связи с электропорации, заставляет клетки светятся красным и Calcein AM заставляет клетки, которые живы светиться зеленым цветом. Три возможных сценария, которые могут наблюдаться: 1) клетка электропорации и живой (и будут светиться красный и зеленый), 2) клетки живых, но не электропорации (и будут светиться только зеленые) и 3) клетки мертвы из-за электропорации (и будут светиться только красным) . Жизнеспособность клеток рассчитывается как процент от общего числа клеток живого на электрод и электропорации эффiciency рассчитывается как процент от общего числа клетки, нагруженные PI / миРНК.

5. Представитель Результаты

На рисунке 1 показана сайт-специфической нагрузки клеток HeLa с PI. Это можно наблюдать, что только клетки на электроде продемонстрировать поглощение PI (рис. 1б). Онлайн-тест выполняется сообщению электропорации были использованы для оценки жизнеспособности клеток (рис. 1А). Эффективность электропорации и жизнеспособности клеток для примера, показанного на рисунке 1, 81,8% и 96,1% соответственно. Высокая жизнеспособность клеток и электропорации эффективность может быть достигнута путем оптимизации параметров электропорации импульса. Сайт-специфическая трансфекции клеток HeLa с флуоресцентной отмеченных миРНК для оптимизации импульса электропорации (8 В, 1 мс) показана на рисунке 2. Электропорации эффективности миРНК 8 В, 1 мс оказалось 74,4 ± 16,0% ижизнеспособность клеток было установлено, что 87,9 ± 8,4% (все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, N = 5).

Рисунок 1. Конкретных участков поставки PI в клетках HeLa на 200 мкм электрод (6 V, 5 мс). A) Calcien основе анализа живой выполнила 2 ч после электропорации. Живые клетки обозначены зеленой флуоресценции. B) красная флуоресценция показывает поглощение PI клетками на электроде. C) накладывается изображение А и В. белые стрелки указывают клетки, которые электропорации и живым. Черные стрелки указывают клетки, которые мертвы. Белый круг в A, B и C обозначает контуры электродов.

Рисунок 2. Трансфекция клеток HeLa с флуоресцентной отмеченных scramblэлектронной последовательности миРНК. A) изображения клеток HeLa на 100 Электрод мкм трансфицировали Alexa 488 отмеченных миРНК (8 В, 1 мс). Б) изображение клеточных ядер окрашивали DAPI. Белый круг знаменует края электрода.

Discussion

В этом видео статье мы демонстрации использования МПС для конкретных участков трансфекции клеток HeLa с яичницей последовательности миРНК. Одним из преимуществ данной технологии является ее применимость к различным клеточных линий, включая первичные клеточные линии. Наша лаборатория ранее продемонстрировали использование этой технологии для сайт-специфической трансфекции первичных нейронов гиппокампа культуры от E18 дневных крыс и NIH-3T3 с яичницей миРНК последовательности и GFP плазмиды ^{18, 19.} Мы также имели успех в реализации функционального миРНК против эндогенных мишени в клетках HeLa (неопубликованные данные). Типичный коммерчески доступных MEA совместим с оптическими изображениями (прямой микроскоп), что позволяет количественной оценки функционального воздействия генов, используя флуоресцентные методы иммуноокрашивания. Кроме того, микроэлектродов в МЭС могут быть использованы для мониторинга электрической активности клеток, таких как первичных нейронов в ответ на генетические возмущения.Уникальная природа MEA позволяет одновременно несколько экспериментов на одной культуре клеток, увеличивая тем самым экспериментальным пропускной способности. В настоящее время основным ограничением с МПС на основе системы является большое количество миРНК необходимых для трансфекции (400 мкл 1 мкм миРНК), который является высоким по сравнению с обычными химическими трансфекции подходов и, следовательно, ограничивает экономическую эффективность системы. Отчасти это можно преодолеть путем включения mircofluidics с MEA система для уменьшения общего объема миРНК решение электропорации до менее чем несколько микролитров. Кроме того, микрофлюидики можно включить серийную поставку различных молекул миРНК, что значительно повысит пропускную способность МЭС на основе технологии. Кроме того, молекулы миРНК может быть выставлен на микроэлектродов до посева клетки, а затем миРНК молекулы могут быть трансфекции в клетки с помощью электропорации обратном ^{15, 23.} Дальнейшее развитие этой технологии предлагает новый высокого тhroughput, эффективный и недорогой метод для исследования генных манипуляций.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.