Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l'aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

Summary

Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l'aide d'une matrice de micro-électrodes (MEA).

Abstract

La découverte de la voie de RNAi chez les eucaryotes et le développement ultérieur des agents ARNi, comme siRNA et shRNA, ont atteint une méthode puissante pour faire taire des gènes spécifiques ^1-8 pour la génomique fonctionnelle et la thérapeutique. Un défi majeur impliqué dans les études basées sur l'ARNi est la délivrance d'agents ARNi dans les cellules ciblées. Les techniques traditionnelles de livraison non viraux, tels que l'électroporation en vrac et les méthodes de transfection chimiques n'ont souvent pas le contrôle nécessaire spatiale sur la livraison et payer des efficacités de transfection pauvres ^9-12. Les progrès récents dans les méthodes de transfection chimiques tels que les lipides cationiques, les polymères cationiques et les nanoparticules ont donné lieu à des efficacités de transfection hautement améliorées ^13. Toutefois, ces techniques continuent à ne pas offrir un contrôle précis de l'espace au-dessus de livraison qui peut grandement bénéficier miniaturisé technologies à haut débit, des études unicellulaires et les enquêtes sur les interactions cellule-cellule.

nt "> Les récents progrès technologiques dans la prestation des gènes ont permis de transfection à haut débit de cellules adhérentes ^14-23, dont une majorité d'utiliser l'électroporation microscopique. électroporation Microscale offre spatio-temporelle précise le contrôle de la livraison (jusqu'à des cellules individuelles) et a été montré d'atteindre des rendements élevés ^{19, 24-26.} De plus, les approches basées sur l'électroporation ne nécessitent pas une longue période d'incubation (environ 4 heures) avec des complexes ADN et de siRNA comme nécessaire dans les méthodes de transfection à base de produits chimiques et de conduire à l'entrée directe de l'ADN nu et siRNA molécules dans le cytoplasme de la cellule. Comme expression d'un gène conséquence peut être atteint dès six heures après la transfection ^27. Notre laboratoire a précédemment démontré que l'utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA) pour le site spécifique de transfection dans des cultures de cellules mammaliennes adhérentes ^17-19. Dans la MEA approche basée sur la livraison de la charge utile génétique est réalisée via localisée à micro-échelle electroporatisur des cellules. Une application de l'impulsion électrique à des électrodes sélectionnées génère locale du champ électrique qui mène à l'électroporation de cellules présentes dans la zone des électrodes stimulées. Le contrôle indépendant des électrodes de commande fournit des micro-spatiale et temporelle au cours de la transfection et permet également de multiples expériences de transfection à base à effectuer sur la même culture qui augmente le débit et la réduction de culture expérimentale à la variabilité culture.

Ici, nous décrivons le dispositif expérimental et le protocole de transfection ciblée des cellules HeLa adhérentes avec une fluorescence marquée brouillés siRNA de séquence en utilisant l'électroporation. Le même protocole peut également être utilisée pour la transfection des vecteurs plasmidiques. En outre, le protocole décrit ici peut être facilement étendu à une variété de lignées cellulaires de mammifères avec des modifications mineures. La disponibilité commerciale de ces accords avec des configurations d'électrodes à la fois prédéfinis et personnalisés font de ce t technique accessiblelaboratoires de recherche avec la plupart des o équipement de culture cellulaire de base.

Protocol

1. Préparation MEA

1. AME pour une utilisation dans des expériences d'électroporation peuvent être fabriqués en utilisant la technique de photolithographie standard comme décrit précédemment ¹⁸ ou acheté directement auprès des fournisseurs des fabricants AME tels que les systèmes multi-canaux (http:/www.multichannelsystems.com/) et Alpha MED scientifique, Inc ( http://www.MED64.com) . Les AME utilisées dans nos expériences ont été fabriqués en interne à l'installation de salle blanche dans l'Arizona State University, qui est administré par le Center for Solid State Electronics Research (CSSER). Les AME utilisées dans nos expériences a eu 32 électrodes d'indium oxyde d'étain dans une matrice 8 par 4 avec des diamètres de 50 à 200 um d'électrodes dans un verre de 1 cm de diamètre intérieur bien. Le verre et a été collé sur le polydiméthylsiloxane MEA en utilisant (PDMS).
2. Stériliser la MEA dans un autoclave avant cellule seeding. D'autres méthodes de stérilisation comme un trempage dans de l'éthanol à 70%, le traitement UV et traitement de l'eau chaude comme décrit par ailleurs peut aussi être utilisé aussi longtemps qu'elles ne compromettent pas l'intégrité de la MEA.
3. Transférer la MEA autoclave à une hotte à flux laminaire et le placer dans un plat de Pétri en polystyrène norme stérile. Avant l'ensemencement des cellules sur la MEA, la stérilisation de la hotte à flux laminaire par la mise sous lumière UV pendant 20 min. Si la MEA est sensible à la lumière UV couvrir la boîte de Petri contenant du MEA avec une feuille d'aluminium tandis que la hotte stérile écoulement est sous éclairage UV.

2. Les cellules d'ensemencement sur la MEA

1. Récolte des cellules d'une lignée cellulaire fonctionnement des cellules de mammifères adhérentes à l'aide de trypsine / EDTA et de les élever à une concentration de 100-200 cellules / ul dans 1 ml milieux cellulaires pour le placage. Dans nos expériences, nous avons réussi à cultiver NIH 3T3 lignée de cellules fibroblastes, lignée cellulaire HeLa et primaires neurones corticaux et hippocampiques sur l'AEM.
2. 2 h après l'ensemencement des cellules de transfert de la boîte de Pétri avec la MEA de l'incubateur pour hotte à flux laminaire et ajouter doucement pi 400-500 de pré supports chauffés (37 ° C) à la MEA bien. Vérifiez sous le microscope pour s'assurer que les cellules sont encore attachés et uniformément répartie sur la surface de la MEA. Transfert à l'arrière MEA à l'incubateur. La période de 2 heures d'attente avant l'addition du support garantit suffisamment de temps aux cellules d'adhérer à la surface de la MEA. Ajout de milieux cellulaires trop tôt après l'ensemencement des cellules peut laver les cellules. Si les cellules n'adhèrent pas bien à la MEA, sa surface peut être traitée avec des facteurs de fixation cellulaire tel aspolylysine, la fibronectine, la laminine et d'améliorer l'adhérence cellulaire. Dans nos expériences, nous avons généralement de cellules HeLa traiter la surface avec MEA fibronectin (10 pg / ml) pendant 1-2 heures.
3. 8-12 heures après l'ensemencement des cellules, effectuez 1-2 lavages avec du PBS pour éliminer les cellules mortes. Milieu cellulaire peuvent être remplacées tous les 24 à 48 heures selon les besoins. Dans une expérience typique, les cellules sont généralement prêt pour la transfection 24-48 heures après l'ensemencement. Pour assurer la cohérence de l'efficacité d'électroporation, il est recommandé d'attendre que la culture est au moins 80% de confluence avant électroporation.

3. Spécifique au site transfection de siRNA

1. Préparer une solution d'acide nucléique. Pour transfection de siRNA, préparer une solution uM 1-2 siARN électroporation dans le tampon d'électroporation glacée pour atteindre un volume final de 200-400 ul. Dans cet article, nous démontrons la vidéo transfection de cellules HeLa avec Alexa 488 conjugué brouillés séquence de siRNA.
2. Transférer la MEA avec des cellules de l'incubateur à flux laminaire hotte stérile. Retirez le support de cellules de l'AEM et d'effectuer un lavage avec du PBS. Par la suite, ajouter 200-400 ul de la iCE froide solution à 1 uM électroporation siRNA pour le bien.
3. Appliquer anodiques carrés des impulsions électriques aux électrodes ciblées (Reportez-vous à l'étape 4 pour déterminer les paramètres optimaux de l'impulsion électrique). Dans nos expériences, nous avons utilisé un des instruments pragmatiques 2414A générateur de signaux pour générer des impulsions électriques et d'un double-inline-paquet (DIP) 16 circlip d'axe de prendre contact avec les plots de connexion MEA. Le générateur de forme d'onde peut être relié à l'élément DIP via une carte de circuit imprimé démultiplexeur pour fournir une sélectivité d'électrodes individuelles. Pour l'électrode de référence, placer une cathode en acier dans les milieux cellulaires. Tout en réduisant l'électrode de référence en acier dans les médias, il est extrêmement important de veiller à ce qu'il n'entre pas en contact avec la surface de la MEA. En cas de contact, il peut causer des dommages aux cellules et l'AME. Il est recommandé d'abaisser l'électrode de référence à une position de 1 mm au-dessus des cellules. Une entretoise avec une hauteur de 1 mm peut être placé dans le puits pour faciliter le placement de l'arbitrerence électrode. Une approche alternative à l'utilisation d'une électrode de référence externe est d'utiliser des électrodes voisines comme cathode-anode paires.
4. Immédiatement après l'application des impulsions électriques aux électrodes ciblées sur l'AEM, AEM transférer l'arrière de l'incubateur. Après une période d'incubation de 5 min, doucement remplacer 75% de la mémoire tampon d'électroporation avec préchauffées (37 ° C) milieu cellulaire. Plus tard, l'imagerie fluorescente peut être fait pour confirmer la livraison de siRNA marquées par fluorescence dans les cellules.

4. Optimisation des paramètres d'électroporation

1. Pour déterminer les paramètres optimaux d'impulsions électriques pour l'électroporation, expériences d'électroporation de conception pour une plage de valeurs de l'amplitude d'impulsion, durée d'impulsion, et le nombre d'impulsions. Dans notre expérience avec des cellules HeLa, nous avons observé qu'une seule impulsion de tension d'amplitude de 3 V à 9 V, et la durée de 1 ms à 10 ms pour une taille d'électrode de 100 um ont conduit à une électroporation avec succès kmnimal mort cellulaire. Il est de notre recommandation selon laquelle un paramètre de faire varier à la fois et d'autres sont maintenus constants. Pour quantifier l'efficacité d'électroporation pour chacun des paramètres d'impulsion, nous utilisons l'iodure de propidium (PI), un colorant imperméant cellule que le matériel nucléique taches, et la méthodologie de test en direct basée, comme décrit dans les étapes 4.2 à 4.5.
2. Mettre en place une culture de cellules de la MEA en suivant les instructions indiquées dans les étapes 1 et 2.
3. Avant de préparer une électroporation ul 300-500 de 30 pg / ml solution PI dans le tampon d'électroporation glacée et 400 ul de 4 uM calcien AM solution dans du PBS.
4. Transférer la MEA de l'incubateur de la hotte à flux laminaire. Retirez le support de cellules de l'AEM et d'effectuer un lavage avec du PBS. Par la suite, ajouter 300-500 ul du tampon d'électroporation glacée avec PI.
5. Appliquer des impulsions électriques d'amplitude d'impulsion désirée et la durée des électrodes ciblées (Le matériel utilisé dans nos expériences pour générer et d'appliquer l'électrique impulsion à l'AEM est décrite à l'étape 3.3). Pour l'électrode de référence soit abaisser une électrode d'acier dans le tampon d'électroporation dans la MEA bien ou d'utiliser l'électrode voisine comme référence. En appliquant sélectivement des impulsions d'amplitudes variables ou des durées différentes à électrodes multiples expériences peuvent être réalisées sur le même dispositif. Par exemple, sur une électrode 32 MEA, 8 expériences peuvent être réalisées en séparant les électrodes 32 en 8 groupes, chacun composé de 4 électrodes. Chacun des 8 groupes peuvent ensuite être stimulé par une impulsion de tension rectangulaire unique d'une durée de 5 ms avec des amplitudes différentes dans 3 V-6 V Plage par incréments de 0,5 V et un groupe peut être utilisé comme un contrôle.
6. Immédiatement après l'application des impulsions de tension transférer la MEA à l'incubateur pendant 5 min. Ensuite, retirer délicatement de 75% de la mémoire tampon d'électroporation de la MEA bien et le remplacer par les médias de cellules chaudes. Transfert à l'arrière MEA à l'incubateur.
7. Après une période d'incubation de 2-4 heuresremplacer les supports de cellules dans le MEA bien avec 300-500 ul de 4 uM calcéine AM solution dans du PBS. Transfert à l'arrière de l'incubateur MEA pendant encore 30 minutes.
8. Après l'incubation des cellules avec la calcéine AM, la calcéine AM remplacer solution dans le puits avec du PBS MEA après deux lavages avec du PBS. Obtenir des images fluorescentes de cellules à l'aide d'un microscope optique avec des filtres pour PI (excitation / émission - 535 nm/617 nm) et calcéine AM (excitation / émission - 490 nm/520 nm). L'absorption de PI, en raison de l'électroporation, la destruction des cellules à fluorescence rouge et la calcéine AM provoque des cellules qui sont vivants à fluorescence verte. Trois scénarios possibles qui peuvent être observés sont: 1) des cellules vivantes (électroporation et une fluorescence rouge et vert), 2) des cellules vivantes, mais pas électroporation (une fluorescence verte juste) et 3) les cellules mortes en raison de l'électroporation (une fluorescence rouge seulement) . La viabilité cellulaire a été calculé en pour cent du nombre total de cellules vivantes sur l'électrode et l'eff électroporationicacité a été calculé comme pour cent du nombre total de cellules chargées de PI / siRNA.

5. Les résultats représentatifs

La figure 1 montre la charge spécifique au site de cellules HeLa avec PI. On peut constater que seules les cellules sur l'électrode démontrent une absorption de PI (figure 1B). Un test direct effectué après électroporation a été utilisé pour évaluer la viabilité des cellules (figure 1A). L'efficacité d'électroporation et la viabilité des cellules pour l'exemple représenté à la figure 1 sont 81,8% et 96,1% respectivement. La viabilité des cellules à haute efficacité et d'électroporation peut être obtenue en optimisant les paramètres d'impulsion d'électroporation. Spécifique au site transfection de cellules HeLa avec le siRNA marquées par fluorescence pour une impulsion d'électroporation optimisé (8 V, 1 msec) est montré dans la figure 2. L'efficacité d'électroporation pour le siRNA à 8 ms V, 1 a été jugée 74,4 ± 16,0% etla viabilité des cellules a été jugée 87,9 ± 8,4% (toutes les données représentées sous forme de moyenne ± écart type, n = 5).

Figure 1. Site-spécifique de livraison de PI dans les cellules HeLa sur une électrode de 200 um (6 V, 5 ms). A) Calcien dosage basé direct effectué 2 heures après l'électroporation. Cellules vivantes sont indiqués par une fluorescence verte. B) Rouge fluorescence montre l'absorption par les cellules de la PI sur l'électrode. C) Une image superposée de A et B. Les flèches blanches indiquent les cellules qui électroporation et vivant. Les flèches noires indiquent les cellules qui sont morts. Le cercle blanc en A, B et C indique le contour de l'électrode.

Figure 2. La transfection de cellules HeLa avec scrambl marquées par fluorescencee séquence de siRNA. A) l'image des cellules HeLa sur une électrode de 100 um transfectées avec Alexa 488 siARN étiquetés (8 V, 1 ms). B) l'image de noyaux de cellules colorées avec du DAPI. Le cercle blanc marque le bord de l'électrode.

Discussion

Dans cet article, nous démontrons vidéo de l'utilisation de la MEA pour le site spécifique à la transfection de cellules HeLa avec brouillés séquence de siRNA. Un des avantages de cette technologie est son applicabilité à différentes lignées cellulaires, y compris des lignées de cellules primaires. Notre laboratoire a précédemment démontré que l'utilisation de cette technologie pour le site spécifique à la transfection de culture neuronale hippocampique primaire de rat E18 vieux jour et cellules NIH-3T3 avec brouillés séquences de siRNA et la GFP plasmide ^{18, 19.} Nous avons également eu du succès dans la prestation de siRNA fonctionnelle contre une cible endogène dans les cellules HeLa (données non publiées). Un type MEA disponible dans le commerce est compatible avec l'imagerie optique (microscope droit), ce qui permet une évaluation quantitative de l'impact fonctionnel de l'inactivation génique, en utilisant des techniques d'immunomarquage fluorescent. De plus, les micro-électrodes dans MEA peut être utilisé pour surveiller l'activité électrique des cellules, telles que les neurones primaires, en réponse à une perturbation génétique. Lacaractère unique de MEA permet simultanément de multiples expériences sur une culture de cellules unique, augmentant ainsi le débit expérimental. À l'heure actuelle un obstacle majeur à la MEA système basé sur la grande quantité de siRNA nécessaire pour la transfection (400 ul de 1 uM siRNA), qui est élevé par rapport aux approches classiques de transfection à base chimique et limite ainsi la rentabilité du système. Ceci peut être surmonté en partie par l'incorporation mircofluidics avec le système à base de MEA pour diminuer le volume total de solution électroporation siRNA à moins de quelques microlitres. De plus, les micro-fluidique peut permettre la remise en série des molécules de siRNA différents; ce qui améliore grandement le rendement de la MEA technologie basée. Alternativement, les molécules de petits ARN interférents peut être repéré sur les microélectrodes avant l'ensemencement des cellules et les molécules de siRNA peuvent être transfectés dans les cellules par électroporation inverse ^{15, 23.} Poursuite du développement de cette technologie offre un roman à haute tméthode du coût hroughput, efficace et peu pour les études de manipulation génétique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.