Summary
लेख के विवरण एक पक्षपाती स्तनधारी सेल संस्कृति में एक microelectrode सरणी (विदेश मंत्रालय) का उपयोग साइट विशिष्ट siRNA के तले अनुक्रम के अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल.
Protocol
1. विदेश मंत्रालय तैयारी
- Meas electroporation प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए या तो मानक photolithography तकनीक का उपयोग कर गढ़े जा सकता है के रूप में पहले से 18 वर्णित या मल्टी चैनल सिस्टम के रूप में विदेश मंत्रालय के निर्माताओं के विक्रेताओं से सीधे खरीदे (http:/www.multichannelsystems.com/) और अल्फा मेड साइंटिफिक इंक, ( ) http://www.MED64.com हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया meas घर में एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय, जो ठोस राज्य इलेक्ट्रॉनिक्स रिसर्च (CSSER) के लिए केंद्र द्वारा किया जाता है में साफ कमरे की सुविधा में गढ़े गए थे. हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया meas एक 8 में 1 सेमी भीतरी व्यास के साथ ही ग्लास भीतर 50-200 सुक्ष्ममापी से इलेक्ट्रोड व्यास आकार के साथ 4 सरणी द्वारा 32 ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड इलेक्ट्रोड था. कांच अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय क्या का उपयोग polydimethylsiloxane (PDMS) पर बंधुआ किया गया था.
- एक autoclave में विदेश मंत्रालय के पूर्व जीवाणुरहित सेल हैeeding. 70% इथेनॉल में एक भिगोने के रूप में नसबंदी के अन्य तरीकों, यूवी उपचार और गर्म पानी के उपचार के रूप में कहीं वर्णित भी लंबे समय के रूप में वे विदेश मंत्रालय के अखंडता समझौता नहीं करते के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- स्थानांतरण एक लामिना का प्रवाह हुड autoclaved विदेश मंत्रालय और यह एक मानक बाँझ polystyrene पेट्री डिश में जगह. विदेश मंत्रालय पर कोशिकाओं को बोने से पहले 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर बदल कर लामिना का प्रवाह हुड बाँझ. यदि विदेश मंत्रालय के यूवी प्रकाश पेट्री डिश बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ विदेश मंत्रालय युक्त जबकि प्रवाह हुड रोशनी के तहत यूवी को कवर करने के लिए संवेदनशील है.
2. विदेश मंत्रालय पर सीडिंग प्रकोष्ठों
- एक चल पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं की कोशिका लाइन / trypsin EDTA और उन्हें चढ़ाना के लिए 1 मिलीग्राम सेल मीडिया में 100-200 कोशिकाओं / μl के एक एकाग्रता बढ़ाने का उपयोग कर से हार्वेस्ट कोशिकाओं. हमारे प्रयोगों में हम संवर्धन NIH 3T3 fibroblasts सेल लाइन, HeLa सेल लाइन और विदेश मंत्रालय पर प्राथमिक cortical और hippocampal न्यूरॉन्स में सफल रहे हैं.
- बोने से इनक्यूबेटर कोशिकाओं लामिना का प्रवाह हुड के लिए विदेश मंत्रालय के साथ पेट्री डिश और हस्तांतरण धीरे विदेश मंत्रालय को पूर्व गरम मीडिया की 400-500 μl (37 डिग्री सेल्सियस) में अच्छी तरह से जोड़ने के बाद 2 घंटा. खुर्दबीन के नीचे की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अभी भी जुड़े होते हैं और समान रूप से विदेश मंत्रालय की सतह पर फैल गया. इनक्यूबेटर में विदेश मंत्रालय वापस स्थानांतरण. मीडिया के अलावा 2 घंटे से पहले प्रतीक्षा अवधि कोशिकाओं के लिए विदेश मंत्रालय की सतह के साथ पालन करने के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित करता है. सेल मीडिया की कोशिकाओं को बोने के बाद भी जल्द ही अलावा दूर कोशिकाओं को धो सकते हैं. यदि कोशिकाओं को अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय पर पालन नहीं करते हैं, इसकी सतह सेल लगाव जैसे aspolylysine, fibronectin, और laminin कारकों के साथ इलाज किया जा सकता है कोशिका आसंजन में सुधार. हमारे HeLa सेल प्रयोगों में हम आमतौर fibronecti के साथ विदेश मंत्रालय के सतह का इलाज1-2 घंटे के लिए n (10 ग्राम / एमएल).
- कोशिकाओं को बोने के बाद 8-12 घंटा, पीबीएस के साथ 1-2 washes किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने का प्रदर्शन करते हैं. सेल मध्यम हर 24-48 घंटे की जगह के रूप में जरूरत हो सकती है. एक ठेठ प्रयोग में, कक्षों आमतौर पर बोने बाद अभिकर्मक घंटा 24-48 के लिए तैयार कर रहे हैं. Electroporation दक्षता में स्थिरता बनाए रखने के लिए प्रतीक्षा करने के लिए जब तक संस्कृति electroporation से पहले कम से कम 80% मिला हुआ है के लिए सिफारिश की है.
3. साइट - विशिष्ट siRNA के अभिकर्मक
- न्यूक्लिक एसिड के घोल तैयार करें. SiRNA अभिकर्मक के लिए, बर्फ ठंड electroporation बफर में एक 1-2 सुक्ष्ममापी siRNA electroporation समाधान तैयार 200-400 μl की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए. इस वीडियो लेख में हम Alexa 488 siRNA संयुग्मित तले अनुक्रम के साथ HELA कोशिकाओं के अभिकर्मक प्रदर्शित करता है.
- इनक्यूबेटर से बाँझ लामिना का प्रवाह हुड कोशिकाओं के साथ विदेश मंत्रालय का स्थानांतरण. विदेश मंत्रालय से सेल मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ एक धोने प्रदर्शन. इसके बाद, मैं के 200-400 μl जोड़ेंce ठंड सुक्ष्ममापी 1 siRNA electroporation अच्छी तरह से करने के लिए समाधान.
- लक्षित इलेक्ट्रोड (बिजली नाड़ी का इष्टतम मानकों का निर्धारण करने के लिए 4 कदम देखें) anodic वर्ग बिजली दालों लागू करें. हमारे प्रयोगों में हम एक व्यावहारिक उपकरण 2414a waveform जनरेटर का इस्तेमाल करने के लिए बिजली दालों और एक डुबकी () दोहरी इनलाइन पैकेज 16 पिन क्लिप करने के लिए विदेश मंत्रालय बांड पैड के साथ संपर्क बनाने के लिए उत्पन्न. तरंग जनरेटर एक demultiplexor मुद्रित सर्किट बोर्ड के माध्यम से व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड के चयनात्मकता प्रदान डुबकी क्लिप से जुड़ा जा सकता है. संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए, मीडिया सेल के बारे में एक इस्पात कैथोड जगह. जबकि मीडिया में इस्पात संदर्भ इलेक्ट्रोड को कम करने के लिए यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि यह सुनिश्चित करने संपर्क विदेश मंत्रालय सतह के साथ नहीं कर सकता है. संपर्क करने पर, यह कोशिकाओं और विदेश मंत्रालय के लिए नुकसान का कारण बन सकते हैं. यह कोशिकाओं के ऊपर 1 मिमी की एक स्थिति के संदर्भ इलेक्ट्रोड को कम करने के लिए सिफारिश की है. 1 मिमी की ऊंचाई के साथ एक स्पेसर रेफरी की नियुक्ति में की सहायता के अच्छी तरह से रखा जा सकता हैerence इलेक्ट्रोड. एक बाहरी संदर्भ इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका कैथोड anode जोड़े के रूप में पड़ोसी इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए है.
- विदेश मंत्रालय पर लक्षित इलेक्ट्रोड बिजली दालों को लागू करने के तुरंत बाद, इनक्यूबेटर में विदेश मंत्रालय वापस हस्तांतरण. 5 मिनट की एक ऊष्मायन अवधि के बाद, धीरे से पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सेल मीडिया के साथ electroporation बफर के 75% की जगह. बाद में, फ्लोरोसेंट इमेजिंग fluorescently टैग siRNA की कोशिकाओं के लिए वितरण की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है.
4. Electroporation पैरामीटर अनुकूलन
- के के electroporation स्पंद आयाम, नाड़ी की अवधि, और दालों की संख्या के मूल्यों की एक श्रृंखला के लिए डिजाइन electroporation प्रयोगों के लिए इष्टतम बिजली नाड़ी मापदंडों का निर्धारण. HELA कोशिकाओं के साथ हमारे अनुभव में, हम ने कहा कि 3 वी 9 वी से एक आयाम के एक वोल्टेज स्पंद, और 100 मील के साथ सफल electroporation नेतृत्व सुक्ष्ममापी की एक इलेक्ट्रोड आकार के लिए 1 से 10 मिसे मिसे अवधिnimal कोशिका मृत्यु. यह हमारी सिफारिश है कि एक पैरामीटर एक समय में अलग हो सकता है और दूसरों को स्थिर रखा जाता है. नाड़ी मापदंडों में से प्रत्येक के लिए electroporation दक्षता quantitate, हम आयोडाइड propidium (पीआई), एक सेल impermeant डाई है कि दाग न्यूक्लिक सामग्री, और लाइव परख आधारित पद्धति, रूप में 4.2-4.5 चरणों में वर्णित का उपयोग करें.
- विदेश मंत्रालय पर चरण 1 और 2 में उल्लिखित निर्देशों का पालन एक सेल संस्कृति की स्थापना.
- पहले electroporation बर्फ ठंड electroporation बफर में 30 ग्राम / एमएल PI समाधान के एक 300-500 μl और 4 सुक्ष्ममापी calcien AM पीबीएस में समाधान के 400 μl तैयार करने के लिए.
- लामिना का प्रवाह हुड इनक्यूबेटर से विदेश मंत्रालय के स्थानांतरण. विदेश मंत्रालय से सेल मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ एक धोने प्रदर्शन. इसके बाद, पीआई के साथ बर्फ के ठंडे electroporation बफर के 300-500 μl जोड़ने.
- वांछित स्पंद आयाम और लक्षित इलेक्ट्रोड (पैदा करने और लागू करने के चुनाव के लिए हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया उपकरण के लिए अवधि के साथ बिजली दालों लागूविदेश मंत्रालय के लिए tric नाड़ी 3.3 कदम) में वर्णित है. संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए या तो विदेश मंत्रालय में electroporation बफर में एक इस्पात इलेक्ट्रोड कम या संदर्भ के रूप में पड़ोसी इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. चुनिंदा विभिन्न इलेक्ट्रोड अलग amplitudes या durations के दालों को लागू करके कई प्रयोगों का एक ही डिवाइस पर प्रदर्शन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक 32 इलेक्ट्रोड विदेश मंत्रालय, 8 प्रयोगों बंटवारे से प्रदर्शन किया जा सकता है 8 समूहों, 4 इलेक्ट्रोड से मिलकर प्रत्येक में 32 इलेक्ट्रोड. 8 समूहों में से एक तो एक 0.5 वी वेतन वृद्धि और एक समूह में 3 वी 6 वी रेंज में अलग - अलग आयाम के साथ एक अवधि 5 मिसे के आयताकार वोल्टेज स्पंद द्वारा प्रेरित किया जा सकता है एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- तत्काल लागू करने के बाद वोल्टेज दालों इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए विदेश मंत्रालय के हस्तांतरण. बाद में, धीरे से विदेश मंत्रालय से electroporation बफर के 75% अच्छी तरह से दूर करने के लिए और यह गर्म सेल के मीडिया के साथ बदलें. इनक्यूबेटर में विदेश मंत्रालय वापस स्थानांतरण.
- 2-4 घंटे के एक ऊष्मायन अवधि के बादविदेश मंत्रालय में मीडिया सेल 4 सुक्ष्ममापी की 300-500 μl के साथ अच्छी तरह से जगह Calcein AM पीबीएस में समाधान. इनक्यूबेटर में एक और 30 मिनट के लिए विदेश मंत्रालय वापस स्थानांतरण.
- Calcein AM साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद, विदेश मंत्रालय में Calcein समाधान की जगह AM पीबीएस के साथ दो washes के बाद अच्छी तरह से पीबीएस के साथ. और Calcein AM (/ उत्तेजना उत्सर्जन 490 nm/520 एनएम) कोशिकाओं फ्लोरोसेंट छवियों PI (535 nm/617 एनएम / उत्तेजना उत्सर्जन) के लिए फिल्टर के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ प्रयोग कर प्राप्त करें. गड़बड़ी की तेज, electroporation के कारण का कारण बनता है, कोशिकाओं को लाल प्रतिदीप्ति और Calcein AM कोशिकाओं है कि करने के लिए हरी प्रतिदीप्ति जीवित हैं का कारण बनता है. तीन संभावित परिदृश्यों है कि देखा जा सकता है 1) electroporated और जीवित सेल (दोनों लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति जाएगा), 2) जीवित कोशिकाओं लेकिन electroporated और नहीं (सिर्फ हरी प्रतिदीप्ति जाएगा) 3) मृत कोशिकाओं electroporation के कारण (सिर्फ लाल प्रतिदीप्ति) . सेल व्यवहार्यता इलेक्ट्रोड पर जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या का एक प्रतिशत और electroporation eff के रूप में गणना की गईiciency PI / siRNA साथ लोड कोशिकाओं की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में गणना की गई.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 साइट विशिष्ट पीआई के साथ हेला कोशिकाओं की लोडिंग से पता चलता है. यह देखा जा सकता है कि इलेक्ट्रोड पर केवल कोशिकाओं PI (चित्रा 1 बी) के एक तेज का प्रदर्शन कर सकते हैं. एक जीवित परख प्रदर्शन पोस्ट electroporation कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. electroporation और चित्र 1 में दिखाया उदाहरण के लिए सेल व्यवहार्यता दक्षता क्रमशः 81.8% और 96.1% हैं. उच्च सेल व्यवहार्यता और electroporation दक्षता electroporation नाड़ी मानकों के अनुकूलन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक अनुकूलित electroporation पल्स के लिए fluorescently टैग siRNA (8 वी, मिसे 1) के साथ साइट विशिष्ट HELA कोशिकाओं के अभिकर्मक चित्रा 2 में दिखाया गया है. वी 8, 1 मिसे में siRNA के लिए electroporation दक्षता 74.4 हो पाया था ± 16.0% औरसेल व्यवहार्यता 87.9 ± 8.4% (सभी डेटा मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व ± मानक विचलन, एन 5 =) हो पाया था.
चित्रा 1 HELA कोशिकाओं में साइट विशिष्ट गड़बड़ी की एक 200 सुक्ष्ममापी इलेक्ट्रोड (6 वी, 5 मिसे) पर डिलीवरी. ए) Calcien आधारित रहते हैं परख 2 घंटा पोस्ट electroporation प्रदर्शन किया. जिंदा कोशिकाओं हरी प्रतिदीप्ति द्वारा संकेत कर रहे हैं. बी) लाल प्रतिदीप्ति इलेक्ट्रोड पर कोशिकाओं द्वारा गड़बड़ी की तेज दर्शाता है. सी) एक और सफेद तीर बी के एक आरोपित छवि electroporated और जीवित कोशिकाओं है कि संकेत मिलता है. काला तीर मृत कोशिकाओं है कि संकेत मिलता है. ए, बी और सी में सफेद सर्कल इलेक्ट्रोड की रूपरेखा को इंगित करता है.
चित्रा 2 HELA कोशिकाओं की fluorescently टैग scrambl साथ प्रोटोकॉल.ई siRNA के अनुक्रम. ए) एक 100 सुक्ष्ममापी इलेक्ट्रोड पर HELA कोशिकाओं की छवि Alexa 488 टैग siRNA (8 वी, मिसे 1) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. बी) सेल नाभिक की छवि DAPI साथ दाग. सफेद वृत्त इलेक्ट्रोड के किनारे के निशान.
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Discussion
इस वीडियो लेख में हम siRNA के तले अनुक्रम के साथ HELA कोशिकाओं की साइट - विशिष्ट अभिकर्मक के लिए विदेश मंत्रालय के उपयोग के प्रदर्शन. इस प्रौद्योगिकी के लाभ में से एक अपनी प्राथमिक सेल लाइनों सहित विभिन्न सेल लाइनों के लिए लागू है. हमारी प्रयोगशाला पहले E18 दिन पुराने चूहे और तले siRNA दृश्यों और प्लाज्मिड GFP 18, 19 के साथ NIH 3T3 कोशिकाओं से साइट विशिष्ट प्राथमिक hippocampal neuronal संस्कृति के संक्रमण के लिए इस तकनीक का उपयोग का प्रदर्शन किया है. हम भी HELA कोशिकाओं में एक अंतर्जात लक्ष्य (अप्रकाशित डेटा) के खिलाफ कार्यात्मक siRNA पहुंचाने में सफलता मिली है. एक ठेठ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विदेश मंत्रालय ऑप्टिकल इमेजिंग (ईमानदार माइक्रोस्कोप) के साथ संगत है, जीन मुंह बंद के कार्यात्मक प्रभाव के मात्रात्मक आकलन सक्षम, फ्लोरोसेंट immunostaining तकनीक का उपयोग कर. इसके अलावा, विदेश मंत्रालय में microelectrodes प्राथमिक न्यूरॉन्स के रूप में कोशिकाओं, बिजली की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आनुवंशिक गड़बड़ी के जवाब में.विदेश मंत्रालय की अद्वितीय प्रकृति एक एकल सेल संस्कृति पर एक साथ कई प्रयोगों के लिए सक्षम बनाता है, जिससे प्रयोगात्मक throughput बढ़ाने. वर्तमान में विदेश मंत्रालय आधारित प्रणाली के साथ एक प्रमुख सीमा siRNA अभिकर्मक (1μM siRNA के 400 μl) है, जो उच्च परंपरागत रासायनिक अभिकर्मक आधारित दृष्टिकोण की तुलना में है के लिए जरूरत की एक बड़ी राशि है और इस प्रकार इस प्रणाली की लागत प्रभावशीलता सीमा. यह आंशिक रूप से विदेश मंत्रालय आधारित प्रणाली के साथ mircofluidics को शामिल करने के लिए कम से कम कुछ microliters siRNA electroporation समाधान की कुल मात्रा को कम करके दूर किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, microfluidics अलग siRNA अणुओं के धारावाहिक वितरण सक्षम कर सकते हैं, जिससे बहुत विदेश मंत्रालय आधारित प्रौद्योगिकी के throughput बढ़ाने. वैकल्पिक रूप से, siRNA अणुओं सेल बोने से पहले microelectrodes पर देखा जा सकता है और फिर siRNA अणुओं रिवर्स electroporation 15, 23 के द्वारा कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. इसके अलावा इस प्रौद्योगिकी के विकास के एक उपन्यास उच्च टी प्रदान करता हैहेरफेर जीन के अध्ययन के लिए hroughput, कुशल और कम लागत वाली विधि.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
References
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