Summary
文章详细介绍了协议的站点特定的扰码序列的siRNA转染贴壁哺乳动物细胞培养用微电极阵列（MEA）。
Abstract
发现RNAi途径中真核生物的RNA干扰剂，如siRNA和shRNA的后续发展，都取得了沉默特定基因的功能基因组学和治疗学1-8的一种有效的方法。 RNAi技术为基础的研究中所涉及的一个主要挑战是交付的RNAi药物的靶细胞。传统的非病毒载体技术，如大容量电和化学品的转染方法往往缺乏必要的空间控制交付和9-12负担转染效率差。化学转染方法，例如阳离子性脂质，阳离子性聚合物和纳米粒子中的最新进展已经导致在高度增强的转染效率13。然而，这些技术仍无法提供精确的空间控制权交付，可以极大地有利于小型化，高通量的技术，单细胞的细胞 - 细胞相互作用的研究和调查。
NT“>基因传递的最近的技术进步已经使高通量的贴壁细胞转染14日至23日 ，其中大部分使用微型电。微型电，提供了精确的时空交付控制（单细胞），并已被证明此外，实现高效率，19，24-26。电穿孔基础的方法不要求长时间的潜伏期与siRNA和DNA复合物作为必要的化学基的转染方法（通常为4小时），并导致裸siRNA和DNA直接进入因此基因表达的分子进入细胞的细胞质中。可以实现早六个小时后，转染27。我们实验室先前已经展示了采用微电极阵列（MEA）的位点特异性转染贴壁哺乳动物细胞培养17-19。在MEA为基础的方法，实现基因的有效载荷交付通过局部的微观尺度electroporati上的细胞。到选定的电极产生的电脉冲的应用程序，导致刺激电极的区域中存在的细胞电穿孔的局部电场。微电极的独立的控制提供了空间和时间的控制权转染，并还可以使多个转染实验吞吐量增加和减少培养至培养变异上要执行的相同的培养的基础的实验。在这里，我们描述的实验装置和有针对性的粘附用荧光标记的使用电穿孔的扰频序列的siRNA的HeLa细胞转染的协议。相同的协议也可以用于转染的质粒载体。此外，这里所描述的协议可以很容易地扩展到轻微的修改的各种哺乳动物细胞系。使该技术的商业可用性多边环境协定与预定义的和自定义的电极图案访问吨大多数研究实验室基本的细胞培养设备。
Protocol
1。 MEA制备
- 多边环境协定电实验中使用的，可以使用标准光刻技术制作如前所述，18岁或MEA制造商，如多通道系统（http:/www.multichannelsystems.com/）和Alpha MED科学，公司从供应商直接购买（ http://www.MED64.com） 。在我们的实验中所用的多边环境协定是捏造的房子在洁净室的设施，这是由固体电子学研究（CSSER）中心在亚利桑那州立大学。在我们的实验中所用的多边环境协定有32个铟锡氧化物电极在8 4与电极直径在1厘米内径的玻璃以及从50-200微米大小的阵列。玻璃以及聚二甲基硅氧烷（PDMS）的MEA使用是否键合。
- 在高压釜中灭菌的MEA细胞前eeding。如浸泡在70％乙醇中的灭菌，如其他地方描述的UV处理和热水处理的其它方法也可以被使用，只要它们不会危及在MEA的完整性。
- 转移蒸压MEA层流罩，并将其放置在一个标准的无菌聚苯乙烯培养皿中。在种子细胞上的MEA，消毒层流罩接通20分钟的UV光。如果MEA UV光覆盖的MEA的培养皿中，用无菌铝箔流罩是在紫外光照射下是敏感的。
2。种子细胞在MEA
- 从一个正在运行的细胞粘附的哺乳动物细胞，用胰蛋白酶/ EDTA，并提高它们的浓度为100-200个细胞/微升用于电镀在1ml细胞介质中收获细胞。在我们的实验中，我们已经成功地培养NIH 3T3成纤维细胞的细胞系，HeLa细胞和初级皮层和海马神经元的MEA。
- 2小时后，播种的细胞从培养箱中与MEA的陪替氏培养皿转移到层流罩，并轻轻地添加400-500微升预温热媒体（37℃）的MEA以及。在显微镜下检查细胞仍然连接和MEA表面均匀地涂在。孵化器转移MEA回。 2小时媒体除了之前的等待期间，确保足够的时间进行的与MEA表面细胞附着。添加太早接种细胞后，细胞培养基可以洗去细胞。如果细胞不能很好地附着在MEA，其表面可以处理与细胞附着的等因素aspolylysine，纤连蛋白和层粘连蛋白，改善细胞的粘附。在我们的HeLa细胞的实验中，我们一般将MEA表面fibronectiN（10微克/毫升）1-2小时。
- 8-12小时后接种细胞，进行1-2与PBS清洗，以消除任何的死细胞。细胞培养基可以根据需要24-48小时更换一次。在一个典型的实验中，细胞是通常准备用于转染24-48小时后播种。为了保持电效率的一致性，建议，等到文化是至少80％汇合前电。
3。网站特定的siRNA转染
- 准备核酸溶液。对于siRNA转染，准备一个1-2μM的siRNA电穿孔溶液冰冷的电穿孔缓冲液中，以达到最终体积为200-400微升。在这个视频文章中，我们展示了Alexa 488标记的扰码序列的siRNA转染HeLa细胞。
- 从孵化器的无菌层流罩与细胞转移MEA。从MEA中取出的细胞培养基，并用PBS进行洗涤。此后，添加200-400微升的iCE冷1μM的siRNA电的很好的解决方案。
- 应用阳极方形电脉冲的目标电极（参照到步骤4，用于确定最优参数的电脉冲）。在我们的实验中，我们使用的语用仪器2414A波形发生器产生电脉冲和双列直插式封装（DIP）16引脚剪辑的接触的MEA焊盘的。通过一个多路分路器，印刷电路板，以提供单个电极的选择性，可以被连接到的波形发生器的DIP剪辑。对于参比电极，在细胞培养基中放置一个钢阴极。同时降低钢在媒体上的参考电极，它是极为重要的，以确保它不会使与MEA的表面接触。接触时，它可能会导致损坏的细胞和MEA。它是建议降低参比电极的位置的1毫米以上的细胞。在放置了ref，高度为1mm的隔离物具有可放置在阱，以协助erence电极。使用外部基准电极的另一种方法是使用阴极 - 阳极对相邻的电极。
- 的电脉冲施加到目标上的MEA的电极后，立即转移的MEA回到培养箱。 5分钟的潜伏期后，轻轻地取代75％的电穿孔缓冲液预温（37°C）的细胞培养基。购买，荧光成像可以做，以荧光标记的siRNA的细胞中确认交货。
4。电穿孔参数优化
- 电穿孔法，的设计电穿孔实验在脉冲幅度，脉冲宽度，和脉冲数的值的范围内，以确定最佳的电脉冲参数。在我们的经验与HeLa细胞中，我们观察到一个电压脉冲的幅值从3 V到9 V，和持续时间1毫秒至10毫秒的一个电极的大小为100μm与英里导致成功的电穿孔nimal细胞死亡。一个参数而变化的时间和其他被保持恒定，这是我们的建议。为了定量的电穿孔效率为每个脉冲参数中，我们使用碘化丙啶（PI），细胞浸透染料污渍核酸材料，和现场检测为基础的方法，描述在步骤4.2-4.5。
- 按照在步骤1和2中列出的指示，建立的细胞培养上的MEA。
- 电穿孔前制备300-500微升30μg/ ml的PI溶液在冰冷的电穿孔缓冲液和400微升4的μMcalcien AM的PBS溶液。
- 转移MEA从培养箱中的层流罩。从MEA中取出的细胞培养基，并用PBS进行洗涤。此后，与PI冰冷的电穿孔缓冲液中添加300〜500μl的。
- 应用电脉冲与所需的脉冲的幅度和持续时间的有针对性的电极（在我们的实验中所使用的设备，用于产生和施加电TRIC脉冲的MEA的步骤3.3）中描述的。对于参比电极的钢降低电极到在MEA的电穿孔缓冲液中，或使用相邻的电极作为参考。通过选择性地施加脉冲的变化的幅度或持续时间，以不同的电极，多个实验，可以在同一装置上进行。例如，在一个32电极的MEA，8的实验可以通过拆分进行的32个电极中的8个组，每个组由4个电极组成的。的8个组中的每一个，然后，可以在3 V-6 V的范围内变化的振幅在0.5 V增量和一组由一个单一的矩形电压脉冲的持续时间5毫秒的刺激，可以用作对照。
- 后立即施加的电压脉冲的MEA转移到孵化5分钟。之后，轻轻地去除75％的电穿孔缓冲液的MEA，取而代之的是温暖的细胞培养基。孵化器转移MEA回。
- 经过2-4小时的潜伏期以及取代的MEA中的细胞培养基，用300-500微升4μM钙黄绿素AM在PBS中的溶液。 MEA回转移到另一个30分钟的孵化器。
- 钙黄绿素AM的细胞孵育之后，取代的钙黄绿素AM溶液中的MEA以及用PBS洗涤两次后，用PBS。获得使用与PI（激发/发射 - 535 nm/617纳米）和钙黄绿素AM（激发/发射 - 490 nm/520纳米）的过滤器，用光学显微镜的细胞的荧光图像。 PI的吸收，由于电，使细胞发荧光红和钙黄绿素AM导致细胞是活着的绿色荧光。有三种可能的情况下，可以观察到：1）细胞电穿孔和活着（会发出荧光红色和绿色），2）细胞存活，但没有电穿孔（荧光只是绿色）和3）细胞死亡电（荧光红刚） 。计算细胞存活率，在电极上的细胞存活的总数的百分比和电穿孔EFFiciency加载带有PI /的siRNA的细胞总数的百分数计算。
5。代表性的成果
图1显示了特定网站的加载Hela细胞PI。可以观察到的，只在电极上的细胞表现出的PI（ 图1B）中的摄取。进行的现场试验后的电用于评估的可行性细胞（ 图1A）。电穿孔效率和在图1中所示的例子中的细胞存活率分别为81.8％和96.1％。高的细胞存活率和电穿孔效率，可以实现优化的电穿孔脉冲参数。特定于站点的转染的HeLa细胞用荧光标记的siRNA为一个优化的电穿孔脉冲（8 V，1毫秒）在图2中示出。电穿孔效率为8 V，1毫秒的siRNA被发现是74.4±16.0％，而细胞活力被发现是87.9±8.4％（所有数据表示为平均值±标准偏差，N = 5）。
图1特定站点200μm的电极（6 V，5毫秒）在HeLa细胞中对交付PI。 A）Calcien根据现场试验进行了2小时后电。活细胞显示绿色荧光。 B）红色荧光表明在电极上的细胞吸收PI。 C）的叠加后的图像A和B的白色箭头表示的电穿孔和活的细胞。黑色箭头表示的细胞都死了。在A，B和C的白圈表示在电极的轮廓。
图2转染的HeLa细胞用荧光标记的scramblË序列的siRNA。 A）用Alexa 488标记的siRNA的（8 V，1毫秒）转染的HeLa细胞的图像上的100微米的电极。 B）的细胞核用DAPI染色的图片。的白色圆圈标记的边缘的电极。
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Discussion
在这个视频文章中，我们演示了如何使用MEA站点特定的扰码序列的siRNA转染HeLa细胞。这种技术的优点之一是其适用于不同的细胞系，包括原代细胞系。我们实验室先前已经展示了使用这种技术的位点特异性转染的原代海马神经元培养E18日龄大鼠和NIH-3T3细胞，加扰的siRNA序列和GFP质粒18，19。我们也有过成功提供功能性siRNA对HeLa细胞中内源性的目标（未发表的数据）。典型的市售MEA是兼容与光学成像（直立显微镜），使基因沉默功能的影响的定量评估，使用荧光免疫染色技术。另外，在MEA的微电极可以用来监测细胞，如初级神经元的电活动的影响，在响应于遗传扰动。 “MEA的独特的性质，可同时在一个单一的细胞培养中，多个实验从而增加实验吞吐量。目前与MEA基础的系统的一个主要的限制是大量用于转染（400微升1μM的siRNA）的需要，这是常规的化学转染基础的方法相比高的siRNA，并从而限制了该系统的成本效益。这部分可以通过将与MEA mircofluidics基础的系统，降低电穿孔的siRNA溶液的总体积小于几微升克服。此外，微流体可以启用序列提供不同的siRNA分子，从而大大增强了吞吐量的MEA的基础的技术。另外，siRNA分子可以被发现在细胞接种前的微电极，然后可以通过反向电穿孔15，23转染到细胞的siRNA分子。这项技术的进一步发展提供了一个新的高-Throughput，高效，低成本的方法进行基因操作的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
References
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