Summary
Emato-encefalica perturbazione barriera favorisce l'erogazione di alcuni farmaci al cervello. Mannitolo consegnato intra-arteriosa cellule restringe i vasi sanguigni circostanti, al fine di distruggere fisicamente la barriera.
Abstract
Cellule endoteliali con giunzioni strette insieme con la membrana basale e piedi finali astrociti circondano vasi sanguigni cerebrali per formare la barriera emato-encefalica 1. La barriera esclude selettivamente molecole di attraversare tra il sangue e il cervello in base alla loro dimensione e carica. Questa funzione può impedire l'erogazione di terapie per disturbi neurologici. Un certo numero di farmaci chemioterapici, per esempio, non viene effettivamente attraversare la barriera emato-encefalica per raggiungere le cellule tumorali 2. Quindi, migliorare l'erogazione di farmaci attraverso la barriera sangue-cervello è una zona di interesse.
I metodi più diffusi per migliorare la consegna di farmaci al cervello sono diretti infusione cerebrale e barriera emato-encefalica interruzione 3. Diretti garanzie infusione intracerebrale che le terapie arrivano al cervello, tuttavia, questo metodo ha una limitata capacità di disperdere il farmaco 4. Emato-encefalica perturbazione barriera (BBBD) alfarmaci bassi di fluire direttamente dal sistema circolatorio nel cervello e quindi più efficace raggiungere dispersi cellule tumorali. Tre metodi di interruzione barriera includono interruzioni osmotica barriera, barriera interruzione farmacologica, e ultrasuoni focalizzati con microbolle. Interruzione osmotica, introdotta da Neuwelt, utilizza una soluzione ipertonica di 25% mannitolo che disidrata le cellule della barriera sangue-cervello facendoli restringersi e distruggere le loro giunzioni strette. Interruzione barriera può anche essere realizzato con composti farmacologicamente vasoattive quali l'istamina e bradichinina 5 6. Questo metodo, tuttavia, è selettivo principalmente per il cervello-tumorale barriera 7. Inoltre, RMP-7, un analogo del peptide bradichinina, è risultata essere inferiore rispetto testa a testa con BBBD osmotico con 25% di mannitolo 8. Un altro metodo, ultrasuoni focalizzati (FUS) in combinazione con agenti di microbolle di contrasto ad ultrasuoni, è stato anche dimostratoper aprire reversibilmente la barriera emato-encefalica 9. Rispetto al FUS, però, il 25% mannitolo ha una storia più lunga di sicurezza in pazienti umani che lo rende uno strumento collaudato per la ricerca traslazionale 10-12.
Al fine di realizzare BBBD, mannitolo devono essere consegnati a un tasso elevato direttamente nella circolazione arteriosa del cervello. Negli esseri umani, un catetere endovascolare è guidato al cervello dove rapida, flusso diretto può essere realizzato. Questo protocollo modelli umana BBBD più possibile. A seguito di un cut-down alla biforcazione della carotide comune, un catetere viene inserito retrogrado nella CCE e usati per fornire mannitolo direttamente nell'arteria carotide interna (ICA) circolazione. Propofol e N 2 O anestesia vengono utilizzati per la loro capacità di massimizzare l'efficacia di interruzione barriera 13. Se eseguito correttamente, questa procedura ha la capacità di in modo sicuro, efficace e reversibile aprire la barriera emato-encefalica e improvvisazionee l'erogazione di farmaci che ordinariamente non raggiungono il cervello 8,13,14.
Protocol
1. Preparare animale e l'attrezzatura per la procedura
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, preparare l'area chirurgica e l'animale. Rendere il catetere carotide inserendo un ago di calibro 23 smussata in un'estremità 12 "di PE50 tubi. Tagliare uno smusso di circa 45 ° alla estremità opposta del catetere. Sterilizzare le attrezzature prima della procedura. Indossare un cofano capelli, maschera chirurgica e guanti sterili.
- Posizionare una piastra elettrica sulla superficie dove l'intervento verrà eseguito. Attivare e lasciarlo riscaldare. Coprire l'area con un tampone assorbente panca.
- Verificare di avere il 25% di mannitolo in soluzione senza cristalli. Se sono presenti cristalli, scioglierle ponendo la provetta in un bagno di acqua calda a 80 ° C e agitando periodicamente.
- Registrare la massa dell'animale.
- Effettuare una diluizione propofol per la consegna a 0,8 mg / kg / min ad una velocità di 0,1 ml / min.
- Posizionare il topo nella casella induzione per 3 min. Regolazioni: 5% isoflurano, 2 L / minportata sul ventilatore.
- Sulla cima di un asciugamano usa e getta, la barba al collo e due cosce.
2. Intubare il Ratto
- Posizionare il retro animale nella scatola induzione per 3 min.
- Prepara il tuo tubo endotracheale con un catetere IV. Per queste dimensioni e ceppo di ratti, si usa un 18 ga catetere. Il tubo deve essere sufficientemente grande da consentire un flusso d'aria, ma abbastanza piccolo da entrare nella trachea senza causare danni. Estrarre il ago del catetere di plastica e con attenzione rompere il ca ago. 1 cm dalla punta affilata. L'ago bunted sarà lo stilo. Rimettere il ago nel catetere.
- Appendere il topo dai denti su una superficie angolata.
- Shine a luce direttamente sul collo dell'animale e allineati tra le sue orecchie.
- Inserire un ca piccola spatola. 3 centimetri nel dell'orofaringe. Sollevare verso l'alto, mentre tirando delicatamente la lingua fuori dalla bocca.
- Visualizzare l'apertura della trachea. Potrai seforo ea piccolo aprire e chiudere con ogni respiro.
- Inserire delicatamente catetere nel foro. A volte si può sentire la plastica entra la cartilagine della trachea. La trachea è sensibile. Non forzare il catetere.
- Impostare il ventilatore a 1 L / min e 60 bpm e l'isoflurano al 2%.
- Collegare il catetere al ventilatore e il tubo nastro alla superficie operativa.
- Verificare che l'animale è anestetizzato eseguendo un pizzico punta.
3. Stabilire Propofol Anestesia IV
- Fissare il topo con nastro adesivo tutti e quattro gli arti e la coda alla superficie operativa.
- Scrub al collo rasato e siti inguine con clorexidina sapone tre volte. Poi strofinare con clorexidina lavare tre volte.
- Collegare una siringa di propofol a un set di prolunga IV. Montare la siringa su una pompa per infusione.
- Utilizzando un bisturi, tagliare la pelle della coscia rasata. Evitare di tagliare muscolare.
- Aprire l'incisione con la forzaps per visualizzare la vena femorale.
- Tirare via il tessuto sopra l'arteria per esporre il vaso.
- Inserire un ga 26 Monoject veterinario IV catetere nella vena. Quando l'ago perfora la parete della vena vi sentirete diventa più facile da spingere. Ritrarre l'ago e spingere il catetere nel vaso.
- Avviare l'infusione di propofol a 0.1 ml / min.
- 3-5 minuti dopo l'inizio dell'infusione propofol, passare il gas anestesia ad una miscela di 50% O 2 e 50% N 2 O e spegnere il isoflurano.
4. Esporre la biforcazione della carotide comune
- Effettuare una incisione mediana al collo con lama di bisturi.
- Tagliare tra le due grandi ghiandole salivari con le forbici o bisturi.
- Dissect lontano tessuto lateralmente alla linea mediana per esporre l'arteria carotide. Usare pinze per aprire strati di tessuto. È possibile usare le forbici per rimuovere pezzi che si espongono con la pinza e determinare di essere minimally vascolare. Controllare l'emorragia con una garza, tamponi di cotone, e cauterizzazione se necessario.
- Iniettare 3 IP ml di soluzione salina, se non vi è stata da moderata a gravi emorragie.
- Utilizzare divaricatori per estrarre il tessuto dalla carotide. Trova la biforcazione.
- Esporre l'arteria occipitale appena distalmente alla biforcazione. Cauterize esso tra pinza e separarlo con un elettrocauterizzazione.
- Utilizzare pinze per esporre completamente la biforcazione carotidea e quanto più possibile l'ECA.
- Esporre l'arteria tiroidea superiore si dirama la Corte dei conti distale all'arteria occipitale. Cauterize esso tra pinza e separarlo con un elettrocauterizzazione.
5. Cateterismo dell'arteria carotide esterna
- Mettere 2 lunghezze di 4/0 di seta sotto la Corte dei conti.
- Prendete 1 lunghezza di sutura con la pinza emostatica e ritrarre la Corte dei conti torna caudalmente (verso i piedi del ratto).
- Prendete l'altra sutura e cravatta fino cranialmente (verso la bocca del ratto) possibile wesima di un chirurgo nodo. Questo forma una legatura permanente a sacrificare la Corte dei conti.
- Rimuovere la pinza emostatica primo (quello che è stato l'applicazione di tensione caudale) e afferrare la sutura altro (quello che si annoda intorno alla Corte dei conti) e applicare leggera tensione cranialmente con la pinza emostatica.
- Tie un altro nodo del chirurgo vagamente (non garantiscono - lasciano poco legato) distale alla biforcazione e prossimale alla legatura permanente.
- Irrigare con 1% di lidocaina per rilassarsi l'arteria.
- Riempi il tuo catetere con soluzione fisiologica eparinizzata.
- Posizionare una clip temporanea vaso più vicino possibile alla biforcazione. Posto fermaglio nave ad un angolo di massimizzare lo spazio per la cateterizzazione. Far scorrere il nodo sciolto verso la clip.
- Fai un piccolo arteriotomia (taglio) in ECA appena prossimale alla legatura con microforbici. Non ci dovrebbero essere sanguinamento se la clip e la legatura sono al sicuro.
- Utilizzando pinze per controllare le pareti ECA, alimentare la estremità smussata del catetere nel vaso. Fissare il catetere con il nodo allentato sutura. Legare l'arteria intorno al catetere.
- Rimuovere la clip e pulire la zona con un batuffolo di cotone.
- Avanzare il catetere di circa 1 mm distalmente alla biforcazione. Tenere l'arteria con pinze prossimali al nodo di garantire la nave è immobilizzato.
6. Somministrare mannitolo
- Riempire un 8 "set di estensione IV e una siringa da 6 ml con il mannitolo senza creare bolle d'aria Conservare questo in incubatore a 37 ° C. Nota: il lavoro rapidamente con mannitolo - sarà facilmente precipitare dalla soluzione a temperatura ambiente..
- Al fine di visualizzare BBBD, si può somministrare Evans colorante blu e vederlo entrare nelle zone del cervello dove la barriera è stata interrotta. Per fare questo, dare all'animale 2 ml / kg del 2% Blu di Evans attraverso un nuovo sito IV sulla gamba controlaterale alla infusione di propofol.
- Collegare il set di prolunga a un micron 5 Eliminare filtro e riempirlo con il mannitolo per rimuovere le bolle d'ariaBles. Quindi, fissare questo al rubinetto senza creare bolle.
- Somministrare mannitolo a 0,09 ml / sec per 25 sec. Guardare per il mannitolo per raggiungere l'equilibrio con il flusso nella carotide comune in un punto appena prossimale al ICA. Dovrebbe apparire a impulsi con la frequenza cardiaca del ratto. Se il mannitolo scorre semplicemente verso il cuore aver superato la pressione del ratto. Ciò può causare complicanze potenzialmente letali e BBBD poveri.
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Representative Results
Figura 1. Visualizzazione ematoencefalica interruzione barriera via stravaso Evans colorante blu. Evans blue colorante è un pigmento che si lega all'albumina e non stravaso nel cervello in condizioni fisiologiche. Perturbazione della barriera ematoencefalica su un lato del cervello Evans blue permette di entrare e macchiare l'azzurro emisfero interrotto mentre l'emisfero non perturbato rimane invariato. Così, è un utile marcatore di sangue-cervello barriera interruzione. Figura 1A è un esempio di un cervello senza sangue-cervello barriera interruzione. Figura 1B è un esempio di un blu cervello macchiata dopo BBBD osmotica utilizzando 25% mannitolo. Si noti che un emisfero è di colore blu mentre l'altro rimane senza macchia. Alcuni blu è entrato dell'emisfero sinistro vicino alla fessura longitudinale mediale come risultato di miscelazione del flusso di sangue al tegli circolo di Willis.
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Discussion
Ci sono pochi mezzi di massimizzare l'efficacia di BBBD. È importante ridurre al minimo il sanguinamento durante la fase di cut-down. La pressione sanguigna e la frequenza cardiaca può essere influenzata da sanguinamento sostanziale e questi fattori sono noti per influenzare il grado di BBBD 13. Sanguinamento può essere ridotto utilizzando suture per legare vasi grandi, come la tiroide superiore e arterie occipitali, che devono essere divisi. Inoltre, elettrocauterizzazione può essere utilizzato per dividere navi e sezionare zone che hanno una fornitura di sangue ricco. E 'anche importante per mantenere l'aria e solidi su tutte le linee poste nell'animale - particolarmente il catetere carotide. Lavorare rapidamente con il mannitolo aiuta a garantire che i cristalli non formano all'interno della siringa o tubo.
È importante utilizzare un tasso mannitolo flusso che è efficace per la dimensione e ceppo di ratti utilizzati in questo esperimento. La portata di infusione mannitolo deve corrispondere alla pressione nel ratto comune Carotiarteria d tale che una concentrazione dei flussi di mannitolo in ICA senza che scorre lungo la carotide comune nel cuore e nei polmoni, che può causare danni. I ricercatori che scelgono una diversa dimensione e la tensione di ratto rispetto a quello utilizzato in questo studio dovrebbe condurre esperimenti per trovare la corretta portata mannitolo.
Uno dei limiti di questa procedura è che richiede il sacrificio della ECA. Una volta che la Corte dei conti è un catetere, diventa difficile e poco affidabili per cateterizzare nuovo. Così, questa procedura non può essere eseguita due volte sul medesimo emisfero. Inoltre, i composti indicati in seguito BBBD deve essere accuratamente testati per neurotossicità. Alcuni farmaci che sono normalmente sicuri diventano pericolosi una volta che attraversano la barriera emato-encefalica.
Nonostante questi limiti, BBBD è stato ampiamente utilizzato per studiare una migliore organizzazione dei chemioterapia per tumori cerebrali 8,15-18. Può anche essere utile per altre applicazioni terapeutiche in which un farmaco non efficace attraversare la barriera emato-encefalica e mannitolo somministrazione è noto per essere sicuro.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Marshall JB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Long Evans rat | Harlan Laboratories | 210-250 g, male | |
| PE 50 Tubing | Beckton-Dickinson | ||
| 18 gauge x 2.5" IV catheter | Terumo | For ET tube | |
| 30" IV extension sets | Abbott | ||
| 26 gauge veterinary IV catheter | Monoject | ||
| Evans blue dye | Sigma | E2129 | |
| Bipolar | Codman | ||
| Filter, 5 μm | Braun |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Smith, Q. R.
- Kroll, R. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42, 1083 (1998).
- Kroll, R. A., Pagel, M. A., Muldoon, L. L., Roman-Goldstein, S., Neuwelt, E. A. Increasing volume of distribution to the brain with interstitial infusion: dose, rather than convection, might be the most important factor. Neurosurgery. 38, 746-754 (1996).
- Butt, A. M., Jones, H. C. Effect of histamine and antagonists on electrical resistance across the blood-brain barrier in rat brain-surface microvessels. Brain research. 569, 100-105 (1992).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14, 862-870 (1994).
- Matsukado, K., et al. Enhanced tumor uptake of carboplatin and survival in glioma-bearing rats by intracarotid infusion of bradykinin analog, RMP-7. Neurosurgery. 39, 125 (1996).
- Kroll, R. A., et al. Improving drug delivery to intracerebral tumor and surrounding brain in a rodent model: a comparison of osmotic versus bradykinin modification of the blood-brain and/or blood-tumor barriers. Neurosurgery. 43, 879 (1998).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, 11719-11723 (2006).
- Neuwelt, E. A., Dahlborg, S. A. Chemotherapy administered in conjunction with osmotic blood-brain barrier modification in patients with brain metastases. Journal of neuro-oncology. 4, 195-207 (1987).
- Doolittle, N. D., et al. Safety and efficacy of a multicenter study using intraarterial chemotherapy in conjunction with osmotic opening of the blood-brain barrier for the treatment of patients with malignant brain tumors. Cancer. 88, 637-647 (2000).
- Guillaume, D. J., et al. Intra-arterial chemotherapy with osmotic blood-brain barrier disruption for aggressive oligodendroglial tumors: results of a phase I study. Neurosurgery. 66, 48 (2010).
- Remsen, L. G., et al. The influence of anesthetic choice, PaCO2, and other factors on osmotic blood-brain barrier disruption in rats with brain tumor xenografts. Anesthesia & Analgesia. 88, 559-559 (1999).
- Nilaver, G., et al. Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 9829 (1995).
- Fortin, D., McCormick, C. I., Remsen, L. G., Nixon, R., Neuwelt, E. A. Unexpected neurotoxicity of etoposide phosphate administered in combination with other chemotherapeutic agents after blood-brain barrier modification to enhance delivery, using propofol for general anesthesia, in a rat model. Neurosurgery. 47, 199 (2000).
- Neuwelt, E. A., et al. Primary CNS lymphoma treated with osmotic blood-brain barrier disruption: prolonged survival and preservation of cognitive function. Journal of clinical oncology. 9, 1580 (1991).
- Remsen, L. G., Trail, P. A., Hellström, I., Hellström, K. E., Neuwelt, E. A. Enhanced delivery improves the efficacy of a tumor-specific doxorubicin immunoconjugate in a human brain tumor xenograft model. Neurosurgery. 46, 704 (2000).
- Neuwelt, E. A., Pagel, M. A., Kraemer, D. F., Peterson, D. R., Muldoon, L. L. Bone marrow chemoprotection without compromise of chemotherapy efficacy in a rat brain tumor model. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 309, 594-599 (2004).
