Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

Summary

Hemato-encefálica ruptura da barreira auxilia a distribuição de certas drogas para o cérebro. Manitol entregue intra-arterialmente células vizinhas encolhe vasos sanguíneos, a fim de interromper a barreira física.

Abstract

Células endoteliais com junções apertadas, juntamente com a membrana de base e os pés de extremidade de astrócitos rodeiam os vasos sanguíneos cerebrais, para formar a barreira sangue-cérebro ^1. A barreira selectivamente exclui moléculas de cruzamento entre o sangue e o cérebro com base no seu tamanho e carga. Esta função pode impedir a entrega de terapêuticas para doenças neurológicas. Um certo número de fármacos quimioterapêuticos, por exemplo, não irá efectivamente atravessar a barreira sangue-cérebro para atingir as células tumorais ^2. Assim, melhorando a libertação de fármacos através da barreira sangue-cérebro, é uma área de interesse.

Os métodos mais comuns para melhorar a administração de fármacos ao cérebro, são perfusão cerebral directa e barreira hemato-encefálica ruptura ^3. Directos garantias de infusão intracerebrais terapias que chegar ao cérebro, no entanto, este método tem uma capacidade limitada para dispersar a droga ^4. Hemato-encefálica ruptura da barreira (BBBD) albaixos de drogas para fluir directamente a partir do sistema circulatório no cérebro e, assim, atingir mais eficazmente dispersas células tumorais. Três métodos de interrupção barreira incluem rompimento barreira osmótica, a interrupção barreira farmacológico e ultra-som focalizado com microbolhas. Ruptura osmótica, iniciada por Neuwelt, utiliza uma solução hipertónica de 25% de manitol que desidrata as células da barreira sangue-cérebro, causando-lhes a encolher e perturbam as suas junções apertadas. Ruptura da barreira também pode ser realizada com compostos farmacologicamente vasoactivos, tais como a histamina ⁵ e ^{6 de} bradicinina. Este método, no entanto, é selectiva em primeiro lugar para a barreira cérebro-tumoral ^7. Além disso, RMP-7, um análogo do péptido bradiquinina, verificou-se ser inferior quando comparado cabeça-a-cabeça com BBBD osmótico com manitol 25% ^8. Outro método, de ultra-som focado (FUS) em conjunto com agentes de contraste de microbolhas de ultra-som, também tem sido demonstradoa reversivelmente abrir a barreira sangue-cérebro ^9. Em comparação com o FUS, porém, manitol 25% tem um longo histórico de segurança em pacientes humanos que o torna uma ferramenta comprovada para pesquisa translacional ^10-12.

A fim de realizar BBBD, manitol devem ser entregues a uma taxa elevada directamente na circulação arterial cerebral. Em seres humanos, um cateter endovascular é guiado para o cérebro, onde o fluxo rápido e directo pode ser realizado. Este protocolo de modelos humanos BBBD tão perto quanto possível. Na sequência de um corte para baixo em relação à bifurcação da artéria carótida comum, um cateter é inserido dentro da ECA retrógrado e usados ​​para entregar o manitol directamente para dentro da artéria carótida interna (ICA) a circulação. Propofol e N ₂ O anestesia são usados ​​para a sua capacidade para aumentar a eficácia de ruptura da barreira ^13. Se for executado adequadamente, este procedimento tem a capacidade de segurança, de forma eficaz, e reversivelmente abrir a barreira sangue-cérebro e improve a entrega de medicamentos que normalmente não chegam ao cérebro ^8,13,14.

Protocol

1. Prepare Animal e Equipamentos para Procedimento

1. Antes de iniciar a cirurgia, preparar o local cirúrgico e do animal. Fazer o cateter da carótida, inserindo uma agulha de calibre 23 em uma extremidade romba, de 12 "de tubagem PE50. Cortar um chanfro de aproximadamente 45 ° na extremidade oposta do cateter. Esterilizar equipamento antes do procedimento. Usar uma capota de cabelo, máscara cirúrgica e luvas estéreis.
2. Coloque uma almofada de aquecimento sobre a superfície onde a cirurgia será realizada. Ative-a e deixe-o aquecer. Cobrir a área com um pano absorvente banco.
3. Verifique se você tem manitol 25% em solução sem cristais. Se estiverem presentes cristais, dissolvê-los, colocando o frasco num banho de água quente a 80 ° C e agitando periodicamente.
4. Registar a massa do animal.
5. Prepare uma diluição de propofol para entrega a 0,8 mg / kg / min, a uma taxa de 0,1 ml / min.
6. Colocar o rato na caixa de indução durante 3 min. Definições: 5% de isoflurano, 2 L / mintaxa de fluxo no ventilador.
7. Em cima de uma toalha descartável, fazer a barba do pescoço e duas coxas.

2. Entubar the Rat

1. Colocar a parte de trás dos animais na caixa de indução durante 3 min.
2. Prepare o seu tubo endotraqueal com cateter IV. Para este tamanho e linhagem de rato, usamos um cateter 18 ga. O tubo deve ser grande o suficiente para permitir a ventilação adequada, mas pequena o suficiente para caber na traquéia sem causar danos. Puxe a agulha para fora do cateter de plástico e cuidadosamente quebrar a cerca de agulha. 1 cm da sua ponta afiada. A agulha bunted será a sua caneta. Colocar a parte de trás da agulha no cateter.
3. Desligar o rato pelos seus dentes sobre uma superfície inclinada.
4. Brilhar uma luz diretamente contra o pescoço do animal e alinhados entre suas orelhas.
5. Inserir uma cerca pequena espátula. 3 centímetros para a orofaringe. Levante para cima, enquanto puxando a língua para fora da boca.
6. Visualize a abertura da traqueia. Você vai seeA pequeno buraco aberto e próximo com cada respiração.
7. Insira cuidadosamente cateter no orifício. Às vezes você pode sentir o plástico entrar na cartilagem da traqueia. A traquéia é sensível. Não force o cateter.
8. Definir o ventilador a 1 L / min e 60 bpm e o isoflurano a 2%.
9. Conectar o cateter ao ventilador e o tubo de fita com a superfície de operação.
10. Verificar que o animal é anestesiado, realizando um aperto do dedo do pé.

3. Estabelecer Propofol Anesthesia IV

1. Fixe o rato gravando todos os quatro membros ea cauda à superfície operacional.
2. Esfregue o pescoço raspada e sites virilha com clorexidina sabão três vezes. Em seguida, esfregue com clorexidina lavar três vezes.
3. Anexar uma seringa de propofol com um conjunto de extensão IV. Montar a seringa numa bomba de infusão.
4. Utilizando um bisturi, cortar através da pele da coxa rapada. Evitar o corte do músculo.
5. Abrir a incisão com uma forçaps para visualizar a veia femoral.
6. Puxar o tecido ao longo da artéria para expor o recipiente.
7. Insira um 26 ga Monoject veterinária cateter IV na veia. Quando a agulha perfura a parede da veia você vai sentir-se mais fácil de empurrar. Retrair a agulha e empurra o cateter dentro do vaso.
8. O início da infusão de propofol a 0,1 ml / min.
9. 3-5 min após o início da perfusão de propofol, mudar o gás de anestesia a uma mistura de 50% de O ₂ e 50% de N ₂ O e desligar o isoflurano.

4. Expor a bifurcação da artéria carótida comum

1. Faça uma incisão na linha no pescoço com lâmina de bisturi.
2. Cortar entre os dois grandes glândulas salivares com tesoura ou bisturi.
3. Dissecar o tecido lateralmente à linha média para expor a artéria carótida. Use uma pinça para abrir as camadas de tecido. Você pode usar uma tesoura para retirar peças que você expõem com a pinça e determinar a ser minimally vascular. Controlar a hemorragia com gaze, cotonetes, e cauterização, se necessário.
4. Injectar 3 IP ml de soro fisiológico se houve moderada a forte sangramento.
5. Use afastadores para puxar tecido para longe da carótida. Encontrar a bifurcação.
6. Exponha a artéria occipital apenas distal à bifurcação. Cauterizar o entre fórceps e separá-lo com uma electrocauterização.
7. Use uma pinça para expor totalmente a bifurcação da carótida e tanto quanto do ECA possível.
8. Expor a artéria tireóide superior ramificando-se o ECA distal à artéria occipital. Cauterizar o entre fórceps e separá-lo com uma electrocauterização.

5. Cateterização da artéria carótida externa

1. Coloque 2 comprimentos de 4/0 de seda sob o ECA.
2. Pegue um comprimento de sutura com sua pinça hemostática e recolher o ECA volta caudalmente (em direção aos pés do rato).
3. Tome a sutura outros e amarrar até cranialmente (para a boca do rato) como w possívelnó um cirurgião om o. Isso forma uma ligadura permanente para sacrificar o ECA.
4. Remova a pinça hemostática primeiro (o que foi aplicar tensão caudal) e pegar a sutura outro (o que é amarrado ao redor do ECA) e aplicar tensão suave cranialmente com a pinça hemostática.
5. Amarre outro nó cirurgião livremente (não proteger - deixar mal amarrado) distal para proximal da bifurcação e à ligadura permanente.
6. Irrigar com lidocaína a 1% para relaxar a artéria.
7. Preencha o seu cateter com solução salina heparinizada.
8. Colocar um clipe recipiente temporário tão perto quanto possível da bifurcação. Clipe lugar vaso em um ângulo para maximizar o espaço para a cateterização. Deslize o nó frouxo na direção do clipe.
9. Faça um pequeno arteriotomia (corte) no ECA apenas proximal à ligadura usando microtesoura. Não deve haver nenhum sangramento, se o clipe e ligadura são seguras.
10. Usando fórceps para controlar as paredes da ECA, passe a extremidade chanfrada do cateter para dentro do vaso. Fixe o cateter com o nó de sutura frouxa. Ligar a artéria ao redor do cateter.
11. Remova o clipe e limpar a área com um cotonete.
12. Avançar o cateter, para cerca de 1 mm distal à bifurcação. Segurar a artéria com uma pinça proximal ao nó de assegurar a embarcação está imobilizada.

6. Administrar Manitol

1. Encher um 8 "conjunto de extensão IV e uma seringa de 6 ml com manitol sem a criação de quaisquer bolhas de ar na Conserva-se a incubadora a 37 ° C. Nota: trabalho rapidamente com manitol - será prontamente precipitar para fora da solução, à temperatura ambiente..
2. A fim de visualizar BBBD, pode administrar corante azul de Evans e vê-lo introduzir as áreas do cérebro em que a barreira tenha sido interrompida. Para fazer isso, dar ao animal 2 ml / kg de azul de Evans a 2% através de um local novo IV na perna contralateral ao propofol.
3. Coloque a extensão definida para um mM 5 filtrar e preenchê-lo com o manitol para remover o ar bubbles. Depois, fixe esta atinja a torneira sem criar bolhas.
4. Administrar manitol a 0,09 ml / seg a 25 seg. Preste atenção para o manitol para alcançar o equilíbrio com o fluxo na carótida comum em um ponto imediatamente proximal à ACI. Ele deve aparecer a pulsar com a taxa de rato coração. Se o manitol simplesmente flui para o coração que você superar a pressão do rato sangue. Isto pode causar complicações potencialmente fatais e BBBD pobres.

Representative Results

Figura 1. Visualizando hematoencefálica ruptura da barreira através de extravasamento de corante azul de Evans. Corante azul de Evans é um pigmento que se liga a albumina e não é extravasado para o cérebro, em condições fisiológicas. O rompimento da barreira sangue-cérebro de um lado do cérebro permite azul de Evans para introduzir e manchar o azul hemisfério interrompido enquanto o hemisfério não-interrompido permanece inalterado. Deste modo, é útil como marcador de sangue-cérebro ruptura da barreira. Figura 1A é um exemplo de um cérebro sem sangue-cérebro ruptura da barreira. A Figura 1B é um exemplo de um azul manchado cérebro após BBBD osmótica usando 25% de manitol. Note-se que um hemisfério está tingido de azul, enquanto a outra permanece imaculada. Alguns azul entrou no hemisfério esquerdo, perto da fenda longitudinal medial, como resultado da mistura do fluxo de sangue no instante tele Círculo de Willis.

Discussion

Existem alguns meios de maximizar a eficácia de BBBD. É importante minimizar a hemorragia durante a fase de corte para baixo. A pressão arterial ea freqüência cardíaca pode ser afetada por sangramento substancial e esses fatores são conhecidos por afetar o grau de BBBD ^13. Sangramento pode ser reduzido pelo uso de suturas para ligar grandes vasos, tais como o da tiróide superior e as artérias occipitais, as quais devem ser divididas. Além disso, a electrocauterização pode ser usado para dividir vasos e dissecar áreas que têm um fornecimento de sangue rico. É também importante para manter o ar e sólidos de todas as linhas colocadas no animal - particularmente o catéter da carótida. Trabalhar rapidamente com o manitol ajuda a assegurar que os cristais não se formam no interior da seringa ou tubo.

É importante a utilização de uma taxa de fluxo de manitol, que é eficaz para o tamanho e estirpe de rato utilizado nesta experiência. A taxa de fluxo da infusão de manitol devem coincidir com a pressão no Caroti comum do ratod artéria tal que uma elevada concentração de fluxos de manitol na ICA sem que flui para baixo a carótida comum para o coração e os pulmões, o que pode causar danos. Pesquisadores a escolha de um tamanho diferente e tensão de rato do que o utilizado neste estudo deve realizar experimentos para encontrar a taxa de fluxo correto manitol.

Uma das limitações deste procedimento é que ele requer o sacrifício da ECA. Uma vez que o ECA é cateterizada, torna-se difícil e pouco confiável a cateterização novamente. Assim, este processo não pode ser efectuada duas vezes no mesmo hemisfério. Adicionalmente, os compostos apresentados na sequência BBBD devem ser cuidadosamente testadas para a neurotoxicidade. Algumas drogas que são normalmente seguros tornar-se perigoso, uma vez que atravessa a barreira sangue-cérebro.

Apesar destas limitações, BBBD tem sido amplamente utilizado para estudar a entrega melhorada de quimioterapia para tumores cerebrais ^8,15-18. Também pode ser útil para outras aplicações terapêuticas em which uma droga eficaz não atravessa a barreira sangue-cérebro e é conhecida a administração de manitol para ser seguro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun