允许有针对性的大鼠模型血 - 脑屏障破坏神经血管治疗

Summary

血 - 脑屏障破坏，帮助某些药物输送到大脑。甘露醇动脉内交付收缩血管周围的细胞，以扰乱障碍。

Abstract

紧密连接的内皮细胞与基底膜和星形胶质细胞末端的脚环绕脑血管的形成血-脑屏障。选择性的阻挡排除分子根据它们的大小和电荷的血液和脑之间交叉。此功能可以阻碍治疗神经系统疾病的交付。化疗药物的一些，例如，将不会有效地穿过血-脑屏障到达肿瘤细胞^2。因此，改善药物透过血 - 脑屏障的交付是感兴趣的区域。

为提高药物的交付到大脑的最普遍的方法是直接脑输注和血-脑屏障破坏^3。直接脑内输液保证疗法到达大脑，然而，这种方法具有的能力是有限的药物分散^4。血 - 脑屏障的中断（BBBD）人低点流直接从循环系统的药物 到大脑，从而更有效地达到分散的肿瘤细胞。三种方法的屏障破坏，渗透屏障破坏，药物屏障破坏，聚焦超声微泡。渗透破坏，开创Neuwelt，使用高渗溶液，25％甘露醇脱水的细胞血 - 脑屏障，使他们萎缩，瓦解他们的紧密连接。屏障破坏，也可以完成药理上具有血管活性化合物^5，如组胺，缓激肽^6。然而，该方法中，是有选择性的，主要用于脑肿瘤屏障^7。此外，RMP-7，血管舒缓激肽的肽的类似物，被发现时相比，头-对-头与渗透BBBD与25％甘露糖醇⁸差。聚焦超声（FUS）与微泡的超声造影剂的结合，另一种方法，也被证明可逆打开的血-脑屏障。在比较FUS，不过，25％甘露醇有一个较长的历史，在人类患者中的安全性，它使一个行之有效的工具转化研究^10-12。

为了实现BBBD，甘露糖醇，必须以很高的速率直接进入大脑的动脉循环交付。在人类中，血管内导管被引导到大脑，其中可以实现快速，直接流。 “本协议模型人BBBD尽可能接近。经过切口下降到常见的颈动脉分叉处，导管插入逆行进入ECA和用于提供甘露糖醇直接到内颈动脉（ICA）的循环。丙泊酚和N _{2 O}麻醉用于自己的能力发挥最大的效益屏障破坏^13。如果执行得当，此过程有安全，有效，可逆打开血 - 脑屏障和即兴表演的能力e的药物，通常不会到达大脑^8,13,14交付。

Protocol

1。准备过程的动物和设备

1. 手术开始之前，准备手术区和动物。使颈动脉导管插入到一端12“PE50管23隔距的钝针剪切在导管的另一端的约45°的斜角。消毒设备之前的程序。戴上头发阀盖，外科口罩和无菌手套。
2. 表面上放置一个加热垫，手术将进行。激活它，让它温暖。覆盖的区域的吸收性板凳垫。
3. 请确认你有25％甘露醇溶液中无晶体。如果晶体存在，溶解由小瓶放置在80℃的热水浴中，并定期搅拌。
4. 记录质量的动物。
5. 车型交付异丙酚稀释在0.8毫克/公斤/分钟的速率为0.1毫升/分钟。
6. 将大鼠在感应框3分钟。设置：5％异氟烷，2升/分钟呼吸机的流量。
7. 除一次性毛巾，刮颈部和两大腿内侧。

2。插管的大鼠

1. 将在诱导动物靠背框3分钟。
2. 准备好您的气管内插管，静脉导管。对于这种规模和应变的老鼠，我们用的18 GA导管。管必须足够大，以便有足够的气流，但小到足以容纳进气管，不会造成损坏。拔出注射针的塑料导管和小心打破了针约。其锋利的尖1厘米。短打针将你的手写笔。将针头放回导管。
3. 一个倾斜的表面上，挂在老鼠的牙齿。
4. 闪耀的光直接对动物的脖子上，列队之间的耳朵。
5. 插入一个小锅铲约。到口咽部3厘米。向上抬起，轻轻拉出舌头出了口。
6. 开幕可视化的气管。您将EA小孔打开和关闭每一次呼吸。
7. 轻轻插入导管插入孔中。有时你可以感觉到塑料进气管的软骨。气管敏感。不要强行将导管。
8. 呼吸机设置为1升/分钟，60次和至2％异氟烷。
9. 导管连接呼吸机和磁带的操作表面的管。
10. 检查动物麻醉进行掐脚趾。

3。建立丙泊酚静脉麻醉

1. 固定大鼠录音四肢和尾操作面。
2. 擦洗剃光颈部和腹股沟网站的洗必泰肥皂三次。然后擦洗洗必泰漱口液三次。
3. 将异丙酚的注射器IV扩展集。装入注射器，输液泵。
4. 使用手术刀，剃了大腿的皮肤通过削减。避免切削肌肉。
5. 打开切口力PS可视化的股静脉。
6. 扯远了组织在动脉暴露的容器。
7. 一个26 GA monoject兽医静脉导管插入静脉。当穿刺针的静脉壁，你会觉得它变得更容易推。收回该针头和导管推入容器。
8. 开始输注异丙酚在0.1毫升/分钟。
9. 3-5分钟后，开始输注异丙酚，切换麻醉气体的混合物的50％O ₂和50％N _{2 O}和关闭异氟醚。

4。暴露颈总动脉分叉的

1. 在颈部正中切开手术刀。
2. 切割用剪刀或手术刀之间的两个大唾液腺。
3. 剖析了组织横向中线暴露颈内动脉。用钳子打开各层组织。您可以用剪刀除去的作品你的镊子公开的和确定minimallŸ血管。用纱布，棉签，和烧灼必要时控制出血。
4. 注入3毫升生理盐水IP，如果出现了中度到严重出血。
5. 使用拉钩，拉距颈动脉组织。分叉。
6. 公开枕动脉远端分叉。烧灼之间的钳子和一个电灼分开。
7. 使用镊子，充分暴露颈总动脉分叉和尽可能多的ECA。
8. 公开甲状腺上动脉分支枕动脉远端的ECA。烧灼之间的钳子和一个电灼分开。

5。导尿颈外动脉

1. 将2种长度的4/0丝线在ECA。
2. 抓住您的止血钳缝合长度和收回ECA尾部向老鼠的脚。
3. 采取其他的缝合和打结，远颅向老鼠的嘴尽可能瓦特第i个外科医生的结。这形成了一个永久结扎牺牲ECA。
4. 删除第一个止血钳（一个，应用尾鳍紧张的），抢在对方缝合（一个是打结周围的ECA）和头部轻轻的张力，用止血钳。
5. 另一名外科医生的结领带松散的（没有安全 - 离开勉强并列）的分岔与永久结扎近端远端。
6. 灌溉用1％利多卡因放松动脉。
7. 请填写您的导管肝素化的盐水。
8. 将一个临时的血管夹尽可能接近的分歧。将血管夹在最大限度地提高空间的角度对导尿。将松散的结，向剪辑。
9. 做一个小的动脉切开术（切段），只是近端结扎microscissors的课外活动。如果剪辑和结扎是安全的，不应该有任何出血。
10. 到控制ECA墙，使用产钳，饲料坡口的导管进入血管。 松散的缝合打结，固定导管。领带的动脉导管周围。
11. 删除的片段，并用棉签清洁区。
12. 推进导管至约1毫米分叉远端。保持动脉近端结，以确保船舶被固定用钳子。

6。管理甘露醇

1. 填写8“IV可拓集合和6毫升注射器用甘露醇，不产生任何气泡。存储在孵化器在37°C。注：工作迅速甘露醇 - 它很容易沉淀的溶液在室温下。
2. 为了形象化BBBD，您可以管理伊文思蓝染料，看着它进入领域的大脑的障碍已经被打乱了。要做到这一点，给动物2 ml / kg的2％伊文思蓝通过一个新的IV网站的腿对侧丙泊酚输注。
3. 安装分机设置为5微米过滤器，并填写甘露醇，以去除空气小家伙绩优。然后，将不产生气泡的活塞。
4. 管理甘露醇为0.09毫升/秒，持续25秒。观看甘露醇在颈总动脉的流量达到平衡，在一个点的ICA近端。它应该出现脉冲老鼠的心脏率。如果甘露醇向心流下来，你已经克服了老鼠的血压。这可能会导致危及生命的并发症和差BBBD的。

Representative Results

图1。可视化通过血-脑屏障破坏Evans蓝染料外渗。Evans蓝染料是与白蛋白结合，未外渗进入大脑在生理条件下的颜料。血 - 脑屏障的大脑的一侧上的中断允许Evans蓝进入和染色的打乱的半球的蓝色，而在非破坏的半球不变。因此，这是一个有用的标记血-脑屏障破坏， 图1A是一个示例的脑无血-脑屏障破坏， 图1B是一个例子，使用25％甘露醇的渗透压BBBD后的脑染成蓝色。请注意，一个半球被染成蓝色，而其他保持原样。作为一个结果，在t的血流量的混合一些蓝色附近的内侧纵裂输入的左半球他Willis环。

Discussion

有几个的最大化疗效BBBD的装置。这是重要的，以尽量减少在切口向下阶段出血。血压和心脏速率可以由大出血的影响，这些因素已知影响程度BBBD ^13的 。出血可减少通过使用缝合线结扎大血管，如甲状腺上和枕动脉，必须除以。此外，电，可以用来划分的血管和剖析领域有丰富的血液供应。同样重要的是，以保持空气和固体放入动物的所有行，满分 - 尤其是颈动脉导管。与甘露醇快速工作，有助于确保晶体不形成内部的注射器或油管。

重要的是要使用甘露醇的流率，是有效的，在这个实验中使用的大鼠的大小和应变。甘露醇的流量必须大鼠的共同caroti中的压力相匹配ð动脉，使得高浓度的甘露糖醇的流量不向下流动的常见的颈动脉到心脏和肺，这可能会导致损坏的情况下进入ICA。比本研究中所用的1选择一个不同的大小和菌株的大鼠的研究人员应当进行实验，以找到正确的甘露糖醇的流量。

此过程中的局限性之一是，它需要牺牲的ECA。一旦ECA插管，它变得困难和不可靠到导尿再次。因此，此过程中不能进行两次相同的半球上。此外化合物以下BBBD的必须仔细为神经毒性测试。一些通常安全的药物，是很危险的，一旦他们穿过血 - 脑屏障。

尽管有这些限制，BBBD已广泛用于研究脑肿瘤的化疗，更好地提供^8,15-18。这也可能是有用的其他的治疗应用，在w高血压脑出血的药物并不能有效地穿过血脑屏障和管理的甘露醇被称为是安全的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun