Råttmodell av blod-hjärnbarriären avbrott Tillåt riktade Neurovaskulär Therapeutics

Summary

Blod-hjärnbarriären störningar underlättar avgivning av vissa läkemedel till hjärnan. Mannitol levererade intraarteriellt krymper celler som omger blodkärl för att fysiskt störa barriären.

Abstract

Endotelceller med tight junctions tillsammans med basalmembranet och astrocyt fötter end surround cerebrala blodkärl för att bilda blod-hjärnbarriären ^1. Barriären utesluter selektivt molekyler från att passera mellan blodet och hjärnan baserat på deras storlek och laddning. Denna funktion kan hindra leverans av terapeutika för neurologiska sjukdomar. Ett antal kemoterapeutiska läkemedel, till exempel, inte kommer att effektivt passera blod-hjärnbarriären för att nå tumörceller ^2. Sålunda, förbättrar avgivningen av läkemedel genom blod-hjärnbarriären är ett område av intresse.

De vanligaste metoderna för att förbättra tillförsel av läkemedel till hjärnan är direkt cerebralt infusion och blod-hjärnbarriären störningar ^3. Direkta intracerebral infusion garanterar att terapier nå hjärnan, men har denna metod en begränsad förmåga att dispergera läkemedlet ^4. Blod-hjärnbarriären störningar (BBBD) aldalar droger för att flöda direkt från cirkulationssystemet in i hjärnan och därmed mer effektivt nå dispergerade tumörceller. Tre metoder för barriär störningar inkluderar osmotiska barriär störningar, farmakologisk barriär störningar, och fokuserade ultraljud med mikrobubblor. Osmotiskt störningar uppfunnen av Neuwelt, använder en hyperton lösning med 25% mannitol som torkar cellerna i blod-hjärnbarriären vilket får dem att krympa och störa deras tight junctions. Barriär störningar kan också åstadkommas med farmakologiskt vasoaktiva föreningar, såsom histamin ⁵ och bradykinin ^6. Denna metod är emellertid selektiv främst för hjärnan-tumör barriären ^7. Dessutom var RMP-7, en analog av peptiden bradykinin, befanns vara underlägsen jämfört head-to-head med osmotisk BBBD med 25% mannitol ^8. En annan metod, fokuserat ultraljud (FUS) i kombination med mikrobubblor ultraljudskontrastmedel, har också visatsatt reversibelt öppna blod-hjärnbarriären ^9. I jämförelse med FUS, men har 25% mannitol en längre historia av säkerhet hos människor som gör det ett beprövat verktyg för translationell forskning ^10-12.

För att åstadkomma BBBD måste mannitol avges vid en hög hastighet direkt in i hjärnans arteriella cirkulationen. Hos människa är en endovaskulär kateter leds till hjärnan där snabb, direkt flöde kan åstadkommas. Detta protokoll modeller människa BBBD så nära som möjligt. Efter en cut-down till bifurkationen av den gemensamma halsartären, en kateter retrograd i ECA och används för att leverera mannitol direkt in i den inre halsartären (ICA) cirkulation. Propofol och N ₂ O anestesi används för sin förmåga att maximera effektiviteten hos barriären störningar ^13. Om avrättades rätt har detta förfarande möjlighet att säkert, effektivt och reversibelt öppna blod-hjärnbarriären och förbättrae leverans av läkemedel som inte normalt når hjärnan ^8,13,14.

Protocol

1. Förbered Djur och utrustning för förfarande

1. Innan operation, förbereda operationsområdet och djuret. Gör halspulsådern katetern genom att sätta en 23-gauge trubbig nål in i en ände av 12 "av PE50 rör. Skär en ca 45 ° avfasning i den motsatta änden av katetern. Sterilisera utrustningen före ingreppet. Bär en hår motorhuv, kirurgisk mask och sterila handskar.
2. Placera en värmedyna på den yta där operationen ska utföras. Aktivera den och låt den bli varm. Täck området med en absorberande bänk dyna.
3. Kontrollera att du har 25% mannitol i lösning utan kristaller. Om kristaller är närvarande, upplösa dem genom att placera ampullen i ett varmt vattenbad vid 80 ° C och omröring periodiskt.
4. Notera den totala massan hos djuret.
5. Gör en propofol utspädning för leverans vid 0,8 mg / kg / min med en hastighet av 0,1 ml / min.
6. Placera råttan i induktion rutan under 3 min. Inställningar: 5% isofluran, 2 l / minflöde på respirator.
7. På toppen av en disponibel handduk, raka halsen och båda inre lår.

2. Intubera Rat

1. Placera djuret tillbaka i induktion rutan under 3 min.
2. Förbered din endotrakealtub med en IV-kateter. För denna storlek och stam av råtta, använder vi en 18 GA kateter. Röret måste vara tillräckligt stor för att tillåta tillräckligt luftflöde, men liten nog att passa in i luftstrupen utan att orsaka skada. Dra ut nålen ur plasten katetern och försiktigt bryta nålen ca. 1 cm från dess skarpa spets. Den bunted nål blir pennan. Sätt nålen tillbaka in i katetern.
3. Häng råtta genom sina tänder på en vinklad yta.
4. Skina ett ljus direkt mot djurets hals och uppradade mellan öronen.
5. Sätt in en liten spatel ca. 3 cm in i orofarynx. Lyft uppåt samtidigt som du försiktigt drar tungan ut ur munnen.
6. Visualisera öppningen av luftstrupen. Du kommer att seea litet hål öppna och stänga med varje andetag.
7. Försiktigt in katetern i hålet. Du kan ibland känna plasten in brosket i luftstrupen. Luftstrupen är känslig. Tvinga inte katetern.
8. Ställ ventilatorn till 1 l / min och 60 slag per minut och den isofluran till 2%.
9. Anslut katetern till ventilatorn och tejpen röret till den operativa ytan.
10. Kontrollera att djuret bedövas genom att utföra en tå nypa.

3. Upprätta Propofol IV Anestesi

1. Säkra råttan genom att tejpa alla fyra benen och svansen till operativsystemet yta.
2. Skrubba rakade nacke och sidor ljumske med klorhexidin tvål tre gånger. Sedan skrubba med klorhexidin skölj tre gånger.
3. Bifoga en spruta av propofol till en IV förlängningssats. Montera sprutan på en infusionspump.
4. Med hjälp av en skalpell, skär genom huden på rakade låret. Undvika att skära muskler.
5. Öppna snittet med kraftps att visualisera den femorala venen.
6. Dra bort vävnad över artären för att exponera kärlet.
7. Sätt in en 26 ga monoject veterinär IV kateter i venen. När nålen punkterar väggen i venen du kommer att känna det att bli lättare att driva. Dra in nålen och tryck katetern in i kärlet.
8. Starta propofol infusionen vid 0,1 ml / min.
9. 3-5 min efter börjar propofol infusion växla anestesigas till en blandning av 50% O ₂ och 50% N ₂ O och stänga av isofluran.

4. Exponera bifurkation av gemensamma halsartären

1. Gör en mittlinjesnitt i nacken med skalpell blad.
2. Klipp mellan de två stora spottkörtlarna med sax eller skalpell.
3. Dissekera bort vävnad lateralt mot mittlinjen för att exponera halspulsådern. Använd pincett för att öppna lager av vävnad. Du kan använda sax för att ta bort bitar som du utsätter med pincett och bestämma att minimally vaskulär. Kontroll blödning med gasväv, kompresser bomull och kauterisation vid behov.
4. Injicera 3 ml saltlösning IP om det har skett måttlig till kraftig blödning.
5. Använd upprullningsdon att dra vävnad från halspulsådern. Hitta bifurkationen.
6. Exponera occipital artären precis distalt till förgreningen. Bränna den mellan pincett och separera den med en diatermi.
7. Använd pincett för att helt frilägga carotis bifurkation och så mycket av ECA som möjligt.
8. Exponera den överlägsna sköldkörteln artär avgrenas revisionsrätten distalt occipital artär. Bränna den mellan pincett och separera den med en diatermi.

5. Kateterisera den yttre halspulsådern

1. Placera 2 längder 4/0 silke enligt revisionsrätten.
2. Grab 1 suturlängd med hemostat och dra ECA tillbaka kaudalt (mot råtta fötter).
3. Ta den andra suturen och slips så långt kranialt (mot råttans mun) som möjligt wed en kirurg knut. Detta bildar en permanent ligatur att offra revisionsrätten.
4. Ta den första hemostat (den som tillämpade kaudal spänning) och ta den andra sutur (den som är knuten runt ECA) och tillämpa mild spänning kranialt med hemostat.
5. Tie annan kirurg knut löst (inte inte säkra - lämna knappt bundna) distalt till bifurkationen och proximala till den permanenta ligaturen.
6. Skölj med 1% lidokain för att koppla artären.
7. Fyll din kateter med hepariniserad saltlösning.
8. Placera en tillfällig kärl klipp så nära som möjligt bifurkationen. Placera kärl klipp i en vinkel för att maximera utrymme för kateterisering. Skjut den lösa knuten mot klippet.
9. Gör en liten arteriotomi (cut) i ECA bara proximalt om ligaturen med microscissors. Det bör inte finnas någon blödning om klippet och ligaturen är säkra.
10. Använd pincett för att styra ECA väggarna, mata den avfasade änden av katetern in i kärlet. Säkra katetern med den lösa sutur knuten. Knyt artären runt katetern.
11. Ta bort clipset och rengör området med en bomullspinne.
12. För fram katetern till ca 1 mm distalt bifurkation. Håll artären med pincett proximalt till knut för att säkerställa att fartyget är immobiliserad.

6. Administrera Mannitol

1. Fyll en 8 "IV förlängningssetet och en 6 ml spruta med mannitol utan att skapa några luftbubblor Förvara i inkubator vid 37 ° C. Anmärkning: arbete snabbt med mannitol - det kommer lätt fälls ut ur lösningen vid rumstemperatur..
2. För att visualisera BBBD kan du administrera Evans blått färgämne och se den in i områden av hjärnan där barriären har brutits. För att göra detta, ge djuret 2 ml / kg 2% Evans Blue genom en ny IV-stället på benet kontralateralt till propofol infusion.
3. Fäst förlängningen inställd på en 5 um filter och fyll den med mannitol att avlägsna luft bubgrönsaker. Sedan fäster detta till kran utan att skapa bubblor.
4. Administrera mannitol vid 0,09 ml / sek för 25 sek. Se till mannitol att nå jämvikt med flödet i carotis vid en punkt strax proximalt till ICA. Det ska visas att pulsera med råttans hjärtfrekvens. Om mannitol bara strömmar ned mot hjärtat du har övervunnit råttans blodtryck. Detta kan orsaka livshotande komplikationer och dålig BBBD.

Representative Results

Figur 1. Visualisering blod-hjärnbarriären störningar via Evans blå färgämne extravasation. Evans blått färgämne är ett pigment som binder till albumin och inte extravasation in i hjärnan under fysiologiska betingelser. Störning av blod-hjärnbarriären på ena sidan av hjärnan kan Evans blått för att komma in och färga den sönderdelade hemisfären blå medan den icke-störd hemisfären förblir oförändrad. Sålunda, är det en användbar markör av blod-hjärnbarriären störningar. Figur 1A är ett exempel på en hjärna utan blod-hjärnbarriären störningar. Figur 1B är ett exempel på en hjärna färgade blått efter osmotisk BBBD användning av 25% mannitol. Notera att en hemisfär färgas blå medan den andra förblir ofärgade. Vissa blå har kommit in i vänstra hjärnhalvan nära den mediala längsgående spricka som ett resultat av blandning av blodflödet vid tHan Circle of Willis.

Discussion

Det finns några sätt att maximera effekten av BBBD. Det är viktigt att minimera blödning under cut-down fas. Blodtryck och hjärtfrekvens kan påverkas av betydande blödning och dessa faktorer är kända för att påverka graden av BBBD ^13. Blödning kan minskas genom att använda suturer att ligera stora fartyg, som överlägsna sköldkörteln och occipital artärer, som måste delas upp. Dessutom kan diatermi kan användas för att dela fartyg och dissekera områden som har en rik blodtillförsel. Det är också viktigt att hålla luft och fastämnen från alla linjer placerade i djuret - särskilt carotis katetern. Arbeta snabbt med mannitol bidrar till att kristaller inte bildas inuti sprutan eller slangen.

Det är viktigt att använda en mannitol flödeshastighet som är effektiv för storlek och stam av råtta användes i detta experiment. Flödeshastigheten av mannitol infusionen måste matcha trycket i råttans gemensamma carotid artär så att en hög koncentration av mannitol strömmar in i ICA utan rinner ner carotis i hjärtat och lungorna, vilket kan orsaka skador. Forskare välja en annan storlek och stam av råtta än den som används i denna studie bör genomföra experiment för att hitta rätt mannitol flöde.

En av begränsningarna av detta förfarande är att den kräver offer revisionsrätten. När revisionsrätten har kateter, blir det svårt och opålitlig att kateterisera igen. Sålunda kan detta förfarande inte utföras två gånger på samma halvklotet. Dessutom måste föreningar ges efter BBBD noggrant testas för neurotoxicitet. Vissa läkemedel som är normalt säkra blir farliga när de passerar blod-hjärnbarriären.

Trots dessa begränsningar har BBBD använts i stor utsträckning för att studera bättre leverans av kemoterapi till hjärntumörer ^8,15-18. Det kan även vara användbara för andra terapeutiska applikationer i which ett läkemedel inte effektivt korsar blod-hjärnbarriären och administrera mannitol är känt för att vara säker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun