血液脳関門の破壊のラットモデルは、対象となる神経血管治療を許可する

Summary

血液脳関門の乱れは、脳にある種の薬物の送達を助ける。動脈配信マンニトールは、物理的障壁を破壊するために、血管周囲の細胞を縮小します。

Abstract

基底膜とアストロサイトの端の足と一緒に、タイトジャンクションと内皮細胞が血液脳関門^1を形成する脳血管を囲んでいます。障壁は、選択的に血液とそのサイズと電荷に基づいて脳間交雑種の分子を排除する。この関数は、神経疾患の治療薬の送達を妨げることができます。化学療法薬の数は、例えば、効果的に腫瘍細胞^2に到達するために血液脳関門を越えることはありません。従って、血液脳関門を横切る薬物の送達を改善することは興味のある分野である。

脳への薬物の送達を増強するための最も一般的な方法は、直接脳注入および血液脳関門の崩壊³アール。直接脳内注入は、治療が脳に到達することを保証しますが、この方法は、薬^4を分散する能力が制限されています。血液脳関門の破壊（BBBD）アル循環系から直接流れる安値薬 脳になるため、より効果的に分散した腫瘍細胞に到達する。バリアの破壊には3つの方法が浸透バリアの破壊、薬理学的なバリアの破壊、そしてマイクロバブルによる集束超音波を含む。 Neuweltによって開拓浸透破壊は、彼らのタイトジャンクショ​​ンを縮小し、混乱させる原因となって、血液脳関門の細胞を脱水25％マンニトールの高張液を使用しています。バリアの破壊はまた、ヒスタミン及びブラジキニン^{5 6}などの血管作動性化合物を用いて薬理学的に行うことができます。しかし、この方法は、主に脳の腫瘍関門⁷用に選択的である。さらに、RMP-7、ブラジキニンペプチドのアナログは、25％マンニトール⁸と浸透BBBDと頭に頭を比較した場合、劣ることが判明した。もう一つの方法は、マイクロバブル超音波造影剤と共に集束超音波（FUS）も示されている可逆的に血液脳関門^9を開きます。 FUSのと比較して、しかし、25％のマンニトールはトランスレーショナル·リサーチ^10月12日のための実証済みのツールとなって、人間の患者における安全性の長い歴史を持っています。

BBBDを達成するために、マンニトールは、直接脳の動脈循環に高いレートで配信される必要があります。ヒトでは、血管内カテーテルは迅速、直接の流れを達成することができる脳へと導かれる。このプロトコルモデル人間はできるだけ密接BBBD。総頸動脈分岐部にカットダウンに続いて、カテーテルにECAに逆行性に挿入し、内頸動脈（ICA）の循環に直接マンニトールを配信するために使用されています。プロポフォールとN ₂ O麻酔はバリアの破壊¹³の効果を最大限に発揮する能力のために使用されます。適切に実行された場合、この手順は安全に、効果的に、かつ可逆的に血液脳関門と即興を開く機能を持っている通常の電子頭脳^8,13,14に達し^ていない薬剤の送達。

Protocol

1。手続きのための動物と機器を準備

1. 手術を開始する前に、手術部位や動物を準備します。 PE50のチューブ12の一端 "に23ゲージのブラント針を挿入することにより、頸動脈にカテーテルを作る。カテーテルの反対側の端では約45°の斜面をカットします。前の手順と機器を滅菌する。ヘアボンネット、外科用マスクを着用する、無菌手袋。
2. 手術が行われる表面に加熱パッドを配置します。それをアクティブにし、それが温まることができます。吸収ベンチパッドを使用して領域をカバーしています。
3. あなたが結晶せずに溶液中で25％のマンニトールを持っていることを確認します。結晶が存在する場合は、80℃の温水浴でバイアルを置き、定期的に攪拌することにより、それらを溶かす。
4. 動物の質量を記録する。
5. 0.1ミリリットル/分の速度で0.8ミリグラム/ kg /分で配達のためのプロポフォール希釈を作る。
6. 3分間インダクションボックスにラットを配置します。設定：5％イソフルラン、2L /分人工呼吸器の流量。
7. 使い捨てタオルの上に、首、両内側の太ももを剃る。

2。ラットを挿管

1. 3分間インダクションボックスの動物の背中を置きます。
2. IVカテーテルを使用して気管内チューブを準備します。このサイズとラットの歪みのために、私たちは18 GAのカテーテルを使用しています。チューブが損傷を引き起こすことなく、十分な通気を確保できるように十分な大きさですが、気管内に収まるように十分に小さくなければならない。プラスチック製のカテーテルの針を引き出し、慎重に針約を破る。その鋭い先端から1cm。 bunted針はあなたのスタイラスになります。カテーテルに針をしなさい。
3. 傾斜面にその歯によってラットを掛けます。
4. 動物の首に直接光を当てると耳の間に並んでいた。
5. 小さなへら約を挿入します。中咽頭への3センチメートル。そっと口から舌を引き出しながら上方に持ち上げます。
6. 気管の開口部を視覚化します。あなたは、そういうものでしょうEA小さな穴が開き、各息を閉じます。
7. そっと穴にカテーテルを挿入します。あなたは時々プラスチックは気管の軟骨を入力感じることができます。気管と小文字が区別されます。カテーテルを無理に押し込まないでください。
8. 1 L /分、60拍と2％イソフルレンに人工呼吸器を設定します。
9. 操作面への人工呼吸器とテープチューブにカテーテルを接続します。
10. 動物がつま先のピンチを行うことにより、麻酔であることを確認します。

3。プロポフォール静脈麻酔を確立

1. 操作面に四肢と尾をテーピングすることによりラットを固定します。
2. クロルヘキシジン石鹸で剃って、首と脚の付け根の部位3回こすります。クロルヘキシジンが3回すすぎ次いでスクラブ。
3. IVの拡張セットにプロポフォールの注射器を取り付けます。輸液ポンプにシリンジをマウントします。
4. 剃ら太ももの皮膚を切ってメスを使用している場合。筋肉を切ることは避けてください。
5. 力で切開を開くpsの大腿静脈を可視化する。
6. 血管を露出させるために動脈を介して組織を引き離します。
7. 静脈内に26 GA monoject獣医静脈カテーテルを挿入します。針が静脈の壁を穿刺するときには、それが押しやすくなって感じることができる。針を撤回し、血管内にカテーテルを押してください。
8. 0.1ミリリットル/分でプロポフォール点滴を開始します。
9. 3-5分プロポフォール注入を開始した後、50％O _{2、50％N 2} Oの混合物に麻酔ガスを切り替えて、イソフルランを遮断してください。

4。総頸動脈分岐部を露出

1. メスの刃で首に正中切開を行います。
2. ハサミやメスを持つ2つの大唾液腺の間で切断。
3. 頸動脈を露出させるために正中線に対して横方向に組織を離れて解剖する。組織の層を開くためにピンセットを使用しています。あなたは鉗子で公開している部分を削除し、minimallあることを決定するためにハサミを使用することができますyの血管。必要に応じてガーゼ、綿棒、焼灼で出血をコントロール。
4. 中等度から重度の出血があった場合には3ミリリットル生理食塩水IPを注入します。
5. 頸動脈から組織を引き離しトラクタを使用しています。分岐を探す。
6. 分岐のすぐ遠位後頭動脈を公開します。鉗子の間それを焼灼し、電気メスを使って区切ります。
7. 完全に頸動脈分岐部、できるだけECAの限りを公開するためにピンセットを使用しています。
8. 後頭動脈の遠位にECAを分岐上甲状腺動脈を公開します。鉗子の間それを焼灼し、電気メスを使って区切ります。

5。外頸動脈にカテーテルを挿入する

1. ECAの下4/0シルクの2の長さを置く。
2. あなたの止血と縫合糸の長さは1をつかんで、（ラットの足に向かって）背尾側にECAを引っ込める。
3. 限り頭側（ラットの口に向かって）可能なワットなどの他の糸とネクタイを取るi番目の外科医の結び目。これにより、ECAを犠牲にする恒久的な合字を形成している。
4. 第一止血（尾側張力をかけたもの）を削除し、他の縫合（ECAの周りに結ばれているもの）を取得し、止血と頭側で穏やかな緊張を適用します。
5. 分岐から遠位および永久結紮の近位 - 疎（かろうじて結ばまま固定しないでください）​​別の外科医の結び目を作る。
6. 1％は動脈をリラックスさせるリドカイン洗浄してください。
7. ヘパリン加生理食塩水を使用してカテーテルを埋める。
8. 分岐点のできるだけ近くに一時的な血管クリップを配置します。カテーテル挿入のためのスペースを最大限にするための角度で置き血管クリップ。クリップに向かって緩い結び目をスライドさせます。
9. microscissorsを使用してリガチャーの直近のECAの小さな切開（カット）を行う。クリップとリガチャーが安全である場合も出血があってはなりません。
10. ECAの壁を制御するためにピンセットを用いて、血管内にカテーテルの面取り端を養う。 緩い縫合糸の結び目でカテーテルを固定します。カテーテルの周りの動脈を縛る。
11. クリップを外して、綿棒でその領域をきれいにしてください。
12. 分岐部の遠位に約1mmにカテーテルを進める。容器が固定化されていることを確認するために結び目の近位に鉗子で動脈を開催しています。

6。マンニトール投与

1. 気泡を作成せずにマンニトールを持つ8 "IVの拡張セットと6 mlの注射器を埋める37℃インキュベーターでこれを℃で保存注：マンニトールで迅速に仕事 - それは容易に室温で溶液から析出されます。
2. BBBD可視化するためには、エバンスブルー染料を投与することができる、それがバリアが破壊されている脳の領域を入力見守る。これを行うには、プロポフォール注入に反対脚の、新しいIVサイトを通じて動物を2％エバンスブルーの2ミリリットル/ kgを与える。
3. 5μmのフィルターに設定拡張子を取り付け、エアーバブを削除するにはマンニトールでそれを埋めるBLES。その後、泡を作成せずにコックにこれを添付してください。
4. 0.09 25のml /秒秒でマンニトールを管理します。 ICAの直近時点での総頸動脈の流れに平衡に達するのにマンニトールを監視します。これは、ラットの心拍数を持つパルスに見えるはずです。マンニトールは、単に心臓に向かって流下する場合は、ラットの血圧を克服している。これは、生命を脅かす合併症と貧しいBBBDを引き起こす可能性があります。

Representative Results

図1。エバンスブルー色素の血管外漏出を介して血液脳関門の崩壊を可視化する。エバンスブルー色素は、アルブミンに結合して、生理的条件下で脳内に溢出されていない顔料である。非中断半球が変わらないまま、脳の片側の血液脳関門の破壊は、エバンスブルーが中断半球青を入力して染色することができます。したがって、それは血液脳関門破壊の有用なマーカーである。 図1Aは、血液脳関門を中断せずに脳の一例です。 図1Bは、25％のマンニトールを用いた浸透BBBD後の脳青く染色の例です。他の残骸は汚れのない、一方の半球が青色に染色されることに注意してください。いくつかの青がtで血流の混合の結果として、内側縦裂に近い左半球に入っているウィリスの彼はサークル。

Discussion

BBBDの効果を最大化するいくつかの手段があります。カットダウンフェーズ中に、出血を最小限に抑えることが重要です。血圧と心拍数はかなりの出血の影響を受ける可能性があり、これらの要因はBBBD ¹³の程度に影響を及ぼすことが知られている。出血は分割しなければならないような優れた甲状腺および後頭部動脈などの主要な血管を、結紮する縫合糸を使用することで軽減することができます。さらに、電気焼灼は、血管を分割し、豊富な血液供給を持っている分野を分析するために使用できます。特に頚動脈カテーテル - それは動物に置かれたすべての行のうち、空気と固体を維持することも重要です。マンニトールで素早く作業する結晶はシリンジやチューブの内側に形成されないことを確認するのに役立ちます。

この実験で用いたラットのサイズと歪みに効果的であるマンニトール流量を使用することが重要です。マンニトール輸液の流量は、ラットの普通caroti内の圧力と一致する必要がありますこのような損傷を引き起こす可能性があり、心臓や肺に総頸動脈を流下せず、ICAにマンニトールフローの高濃度はd動脈。本研究で使用したものとは異なるサイズやラットの系統を選ぶ研究者が正しいマンニトール流量を見つけるために実験を行う必要があります。

このプロシージャの制限の一つは、それがECAの犠牲を必要とすることです。 ECAをカテーテルを挿入されると、それは再びカテーテルを挿入することが困難と不確実になりますしたがって、この手順は同じ半球を二度実行することはできません。さらに、BBBDの後に続いてい化合物が注意深く神経をテストする必要があります。彼らは血液脳関門を通過した後、通常、安全である、いくつかの薬が危険になる。

これらの制限にもかかわらず、BBBDは、脳腫瘍に対する化学療法の改善配達^8,15-18を研究するために広く使用されています。また、wの他の治療への応用に有用であり得るHICHは、薬物を効果的に血液脳関門を通過しないと管理マンニトールは安全であることが知られている。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun