Summary
Rupture de la barrière hémato-encéphalique facilite la prestation de certains médicaments vers le cerveau. Mannitol livré intra-artérielle se rétrécit cellules entourant les vaisseaux sanguins afin de perturber physiquement la barrière.
Abstract
Les cellules endothéliales de jonctions serrées le long de la membrane basale et pieds astrocytaires entourent extrémité vaisseaux sanguins cérébraux pour former la barrière hémato-encéphalique 1. La barrière exclut sélectivement les molécules du croisement entre le sang et le cerveau en fonction de leur taille et de charge. Cette fonction peut entraver la fourniture de traitements pour les troubles neurologiques. Un certain nombre de médicaments chimiothérapeutiques, par exemple, ne sera pas efficace traverser la barrière hémato-encéphalique pour atteindre les cellules tumorales 2. Ainsi, l'amélioration de l'administration de médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique est un domaine d'intérêt.
Les méthodes les plus répandues pour améliorer la délivrance de médicaments au cerveau sont directement perfusion cérébrale et barrière hémato-encéphalique rupture 3. Des garanties directes liées à la perfusion intra-cérébrales que les thérapies atteignent le cerveau, mais cette méthode a une capacité limitée pour disperser le médicament 4. Rupture de la barrière hémato-encéphalique (BBBD) almédicaments à bas découler directement de l'appareil circulatoire dans le cerveau et donc d'atteindre plus efficacement les cellules tumorales dispersées. Trois méthodes de rupture de la barrière comprennent rupture de la barrière osmotique, rupture de la barrière pharmacologique et ultrasons focalisés avec des microbulles. Perturbation osmotique, mis au point par Neuwelt, utilise une solution hypertonique de mannitol 25% qui déshydrate les cellules de la barrière hémato-encéphalique les obligeant à se rétrécir et perturber leurs jonctions serrées. Rupture de la barrière peut également être réalisé avec des composés pharmacologiquement vasoactifs tels que l'histamine 5 et 6 bradykinine. Cette méthode, cependant, est sélective principalement pour la barrière hémato-tumorale 7. En outre, la RMP-7, un analogue du peptide bradykinine, a été jugée inférieure par rapport tête-à-tête avec BBBD osmotique avec le mannitol 25% 8. Une autre méthode, ultrasons focalisés (FUS) en conjonction avec microbulles agents de contraste ultrasonores, a également été montréde manière réversible ouvrir la barrière hémato-encéphalique 9. En comparaison avec le FUS, cependant, le mannitol 25% a une longue histoire de tolérance chez des patients humains qui en fait un outil éprouvé pour la recherche translationnelle 10-12.
Afin d'accomplir BBBD, le mannitol doit être livré à un taux élevé directement dans la circulation artérielle du cerveau. Chez l'homme, un cathéter endovasculaire est guidé vers le cerveau où la rapidité, le débit direct ne peut être accompli. Ce protocole modèles humaine BBBD aussi étroitement que possible. Suite à la réduction jusqu'à la bifurcation de l'artère carotide commune, un cathéter est inséré rétrograde dans la CEA et utilisés pour apporter le mannitol directement dans l'artère carotide interne (ACI) la circulation. Propofol et de N 2 O anesthésie sont utilisés pour leur capacité à maximiser l'efficacité de 13 rupture de la barrière. Si exécuté correctement, cette procédure a la capacité de manière sûre, efficace et réversible ouvrir la barrière hémato-encéphalique et improvisatione l'administration de médicaments qui ne sont pas habituellement atteignent le cerveau 8,13,14.
Protocol
1. Préparer des animaux et de l'équipement pour la procédure
- Avant de commencer la chirurgie, la préparation du champ opératoire et l'animal. Faire le cathéter carotidien en insérant une aiguille de calibre 23 émoussée dans une extrémité de 12 "de PE50 tube. Couper un biseau d'environ 45 ° à l'extrémité opposée du cathéter. Stériliser le matériel avant l'intervention. Porter un chapeau cheveux, masque chirurgical , et des gants stériles.
- Placez un coussin chauffant sur la surface où l'opération sera effectuée. Activez-le et laissez-le chauffer. Couvrir la zone avec un tampon absorbant banc.
- Vérifiez que vous disposez du mannitol 25% en solution, sans cristaux. Si les cristaux sont présents, les dissoudre en plaçant la fiole dans un bain d'eau chaude à 80 ° C et en agitant périodiquement.
- Noter la masse de l'animal.
- Faire une dilution du propofol pour la livraison à 0,8 mg / kg / min à une vitesse de 0,1 ml / min.
- Placez le rat dans la boîte à induction pendant 3 min. Réglages: 5% d'isoflurane, 2 L / mindébit sur le ventilateur.
- Au sommet d'une serviette jetable, de se raser la nuque et les deux cuisses.
2. Intuber le Rat
- Placez le dos de l'animal dans la boîte à induction pendant 3 min.
- Préparez votre tube endotrachéal avec un cathéter IV. Pour cette taille et de la souche de rat, nous utilisons un cathéter de calibre 18. Le tube doit être suffisamment grande pour permettre une ventilation adéquate, mais assez petit pour tenir dans la trachée sans causer de dommages. Sortir le pointeau du cathéter en plastique et soigneusement briser le approx aiguille. 1 cm de son extrémité pointue. L'aiguille cariés sera votre stylet. Remettez le aiguille dans le cathéter.
- Accrocher le rat par ses dents sur une surface inclinée.
- Shine a light directement contre le cou de l'animal et la queue entre ses oreilles.
- Insérez une petite spatule env. 3 cm dans l'oropharynx. Soulevez vers le haut tout en tirant doucement la langue hors de la bouche.
- Visualiser l'ouverture de la trachée. Vous aurez soich petit trou s'ouvrent et se ferment à chaque respiration.
- Insérez doucement le cathéter dans le trou. Vous pouvez parfois ressentir le plastique entre le cartilage de la trachée. La trachée est sensible. Ne pas forcer le cathéter.
- Réglez le ventilateur à 1 L / min et 60 bpm et l'isoflurane à 2%.
- Raccorder le cathéter au ventilateur et le tube de bande de la surface de commande.
- Vérifiez que l'animal est anesthésié par l'exécution d'une pincement de l'orteil.
3. Établir propofol IV Anesthésie
- Fixez le rat en collant les quatre membres et la queue à la surface d'exploitation.
- Frotter le cou rasé et les sites de l'aine avec du savon de chlorhexidine à trois reprises. Puis frotter avec de la chlorhexidine rincer trois fois.
- Fixez une seringue de propofol pour un set de rallonge IV. Monter la seringue sur une pompe à perfusion.
- À l'aide d'un scalpel, couper à travers la peau de la cuisse rasé. Évitez de couper le muscle.
- Ouvrez l'incision avec une forceps pour visualiser la veine fémorale.
- Se détacher du tissu sur l'artère afin d'exposer le navire.
- Insérez un 26 ga Monoject vétérinaire IV cathéter dans la veine. Lorsque l'aiguille perfore la paroi de la veine, vous vous sentirez-il plus facile à pousser. Rétracter l'aiguille et pousser le cathéter dans le vaisseau.
- Commencer la perfusion de propofol à 0,1 ml / min.
- 3-5 min après le début de la perfusion de propofol, passer le gaz d'anesthésie à un mélange de 50% d'O 2 et 50% de N 2 O et couper l'isoflurane.
4. Exposer la bifurcation de l'artère carotide commune
- Faire une incision médiane au niveau du cou avec une lame de scalpel.
- Couper entre les deux grandes glandes salivaires avec des ciseaux ou d'un scalpel.
- Disséquer loin tissu latéral de la ligne médiane pour exposer l'artère carotide. Utilisez une pince pour ouvrir couches de tissu. Vous pouvez utiliser des ciseaux pour enlever des morceaux qui vous exposent à la pince et de déterminer à Minimally vasculaire. Contrôler le saignement avec de la gaze, cotons-tiges, et la cautérisation si nécessaire.
- Injecter 3 ml solution saline IP s'il ya eu modérée à des saignements abondants.
- Utilisez les rétracteurs de tirer le tissu loin de la carotide. Trouvez la bifurcation.
- Exposer l'artère occipitale juste en aval de la bifurcation. Il cautériser entre la pince et le séparer avec un bistouri électrique.
- Utilisez une pince pour exposer entièrement la bifurcation carotidienne et autant de la CEA que possible.
- Exposer l'artère thyroïdienne supérieure qui bifurque de la CEA distale de l'artère occipitale. Il cautériser entre la pince et le séparer avec un bistouri électrique.
5. Sonder l'artère carotide externe
- Placez 2 longueurs de 4/0 en soie vertu de l'ECA.
- Prenez 1 longueur de suture avec votre pince hémostatique et rétracter le CEA retour caudale (vers les pieds du rat).
- Prenez la suture autre et attacher autant céphalique (vers la bouche du rat) que possible avecvec un chirurgien noeud. Cela constitue une ligature permanente de sacrifier la CEA.
- Retirez la pince hémostatique premier (celui qui a été d'appliquer une tension caudale) et prendre la suture autre (celui qui est noué autour de la CEA) et appliquer une tension douce crânienne avec la pince hémostatique.
- Attachez un autre noeud du chirurgien lâche (ne garantissent pas - laisser à peine à égalité) en aval de la bifurcation et à proximité de la ligature permanente.
- Rincer avec lidocaïne à 1% pour se détendre l'artère.
- Remplir le cathéter avec du sérum physiologique hépariné.
- Placer un clip récipient temporaire le plus près possible de la bifurcation. Clip pour vaisseau lieu à un angle de maximiser l'espace de cathétérisme. Faites glisser le noeud lâche vers le clip.
- Faire un petit artériotomie (coupe) à la CEA juste en amont de la ligature à l'aide microciseaux. Il devrait y avoir aucun saignement si le clip et la ligature sont sécurisées.
- En utilisant une pince pour contrôler les parois CEA, alimenter l'extrémité biseautée du cathéter dans le vaisseau. Fixer le cathéter avec le noeud de suture lâche. Lier l'artère autour du cathéter.
- Retirez le clip et nettoyer la zone avec un coton-tige.
- Avancer le cathéter à environ 1 mm en aval de la bifurcation. Maintenez l'artère avec une pince proximale du nœud de s'assurer que le navire est immobilisé.
6. Administrer Mannitol
- Remplissez un 8 "set de rallonge IV et une seringue de 6 ml avec le mannitol sans créer de bulles d'air Conservez ce dans l'incubateur à 37 ° C. Remarque: les travaux rapidement avec le mannitol - il sera facilement précipiter hors de la solution à la température ambiante..
- Afin de visualiser BBBD, on peut gérer colorant bleu Evans et regardez-le pénétrer dans les zones du cerveau où la barrière a été perturbé. Pour ce faire, donner à l'animal 2 ml / kg de 2% Evans Blue grâce à un nouveau site IV sur la jambe controlatérale à la perfusion de propofol.
- Fixer le prolongateur sur un 5 um filtrer et de le remplir avec du mannitol pour éliminer l'air bubbles. Ensuite, fixez le robinet d'arrêt à ce sans créer de bulles.
- Administrer mannitol à 0,09 ml / sec pendant 25 sec. Surveillez le mannitol pour atteindre l'équilibre avec le flux dans la carotide commune à un point juste en amont de l'ICA. Il devrait apparaître à impulsions à la fréquence cardiaque du rat. Si le mannitol coule simplement vers le bas vers le cœur que vous avez vaincu la pression artérielle du rat. Cela peut causer des complications potentiellement mortelles et BBBD pauvres.
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Representative Results
Figure 1. Visualisation rupture de la barrière hémato-encéphalique par l'intermédiaire de colorant bleu Evans extravasation. Colorant bleu Evans est un pigment qui se lie à l'albumine et n'est pas extravasation dans le cerveau, dans des conditions physiologiques. Rupture de la barrière hémato-encéphalique d'un côté du cerveau permet de bleu d'Evans d'entrer et de tacher le bleu hémisphère perturbé tout l'hémisphère non perturbé reste inchangé. Ainsi, il est un marqueur utile de rupture de la barrière hémato-encéphalique. Figure 1A est un exemple d'un cerveau sans rupture de la barrière hémato-encéphalique. Figure 1B est un exemple d'un bleu teinté cerveau après BBBD osmotique en utilisant le mannitol 25%. Notez qu'un hémisphère est coloré en bleu tandis que l'autre reste sans tache. Du bleu est entré dans l'hémisphère gauche, près de la fissure longitudinale médiane en tant que résultat du mélange de l'écoulement du sang à l'instant til polygone de Willis.
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Discussion
Il existe quelques moyens de maximiser l'efficacité de BBBD. Il est important de minimiser le saignement pendant la phase de coupe-bas. La pression artérielle et la fréquence cardiaque peut être affectée par des saignements importants et ces facteurs sont connus pour affecter le degré de BBBD 13. Le saignement peut être réduite en utilisant des sutures pour ligaturer les gros vaisseaux, tels que la thyroïdienne supérieure et les artères occipitales, qui doivent être divisées. En outre, l'électrocoagulation peut être utilisé pour diviser les navires et de disséquer les zones qui ont une alimentation riche en sang. Il est également important de garder à l'air et solides sur l'ensemble des lignes placées dans l'animal - en particulier le cathéter carotidien. En travaillant rapidement avec le mannitol permet de s'assurer que les cristaux ne font pas l'intérieur de la seringue ou le tube.
Il est important d'utiliser un débit mannitol qui est efficace pour la taille et la souche de rat utilisée dans cette expérience. Le débit de la perfusion de mannitol doit correspondre à la pression en commun du rat Carotid artère tels que la forte concentration des flux de mannitol dans la CIA qui coule sans la carotide commune dans le cœur et les poumons, ce qui peut causer des dommages. Les chercheurs choisissent une taille différente et la souche de rat que celui utilisé dans cette étude devraient mener des expériences pour trouver le bon débit mannitol.
Une des limites de cette procédure est qu'elle nécessite le sacrifice de la CEA. Une fois que le CEA est un cathéter, il devient difficile et peu fiable pour sonder à nouveau. Ainsi, cette procédure ne peut être effectuée deux fois sur le même hémisphère. En outre, composés donnés à la suite BBBD doivent être soigneusement testés pour la neurotoxicité. Certains médicaments qui sont normalement sans danger devenir dangereux une fois qu'ils traversent la barrière hémato-encéphalique.
Malgré ces limites, BBBD a été largement utilisée pour étudier une meilleure prestation de la chimiothérapie pour les tumeurs cérébrales 8,15-18. Il peut également être utile pour d'autres applications thérapeutiques dans wHich un médicament n'est pas efficace pour traverser la barrière hémato-encéphalique et le mannitol administration est connu pour être sûre.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation JB Marshall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Long Evans rat | Harlan Laboratories | 210-250 g, male | |
| PE 50 Tubing | Beckton-Dickinson | ||
| 18 gauge x 2.5" IV catheter | Terumo | For ET tube | |
| 30" IV extension sets | Abbott | ||
| 26 gauge veterinary IV catheter | Monoject | ||
| Evans blue dye | Sigma | E2129 | |
| Bipolar | Codman | ||
| Filter, 5 μm | Braun |
References
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