Summary
Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.
Abstract
Mentre gli studi clinici hanno dimostrato che i vaccini DC antigene-caricati sono al sicuro e promettente terapia per i tumori 1, la loro efficacia clinica rimane da stabilire. Il metodo descritto di seguito, redatto in conformità con buon processo di fabbricazione (GMP), è una ottimizzazione del metodo di preparazione ex vivo più comuni per la generazione di un gran numero di cellule dendritiche per gli studi clinici 2.
Il nostro metodo utilizza il TLR sintetico 3 agonista Polyinosinic-policitidilico Carbossimetilcellulosa acido poli-L-lisina (Poly-ICLC) per stimolare i PVS. Nostro studio precedente stabilito che Poly-ICLC è il più potente stimolo maturazione individuale per DCs umane valutata da una sovraregolazione di CD83 e CD86, induzione di interleuchina-12 (IL-12), fattore di necrosi tumorale (TNF), interferone gamma-indotta proteina 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e interferoni di tipo I (IFN), e minimale interleuchina 10 (IL-10) di produzione. DC sono differenziati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC congelati) ottenuti da leucaferesi. PBMC vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente Ficoll e congelati in aliquote. Il giorno 1, PBMC vengono scongelati e piastrate su fiasche di coltura tissutale di selezionare per i monociti che aderiscono alla superficie plastica dopo 1-2 ore di incubazione a 37 ° C in incubatore coltura tissutale. Dopo l'incubazione i linfociti vengono lavati via ed i monociti aderenti sono coltivate per 5 giorni in presenza di interleuchina-4 (IL-4) e granulociti macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) per differenziare a DC immature. Il giorno 6, DC immature vengono pulsate con l'emocianina di patella (KLH) keyhole proteina che serve come un controllo per la qualità del vaccino e può aumentare l'immunogenicità del vaccino 3. Le cellule dendritiche sono stimolati a maturare, caricati con antigeni peptidici, e incubate per una notte. Il giorno 7, le cellule vengono lavate, e congelati in aliquote da 1 ml contenente4 - 20 x 10 6 cellule usando un congelatore a velocità controllata. Controllo del rilascio del lotto per i lotti di DCS viene eseguito e deve soddisfare requisiti minimi prima di essere iniettati nel paziente.
Protocol
1. Isolamento e Crioconservazione di PBMC 4
- Asetticamente Spike una delle porte di accesso nella borsa leucoaferesi utilizzando un set di trasferimento del plasma. Usando una siringa da 60 ml, trasferire il leucaferesi ottenute da pazienti in una bottiglia sterile da 500 ml.
- Regolare il volume della leucaferesi a 2x il suo volume originale con temperatura ambiente RPMI. Mescolare accuratamente.
- Mescolare delicatamente il flacone di Ficoll-Paque PLUS. Aggiungere 12 ml PLUS Ficoll-Paque in sterile da 50 ml tubo conico.
- Strato delicatamente 30 ml di prodotto diluito leucaferesi per ogni tubo da 50 ml conica sterile contenente Ficoll. Fare attenzione a non disturbare l'interfaccia tra il Ficoll e la sospensione cellulare.
- Ripetere i passi 1.3 e 1.4 fino a quando tutta la leucaferesi è stato stratificato.
- Centrifugare le provette coniche da 50 ml a 1.000 xg per 20 min a temperatura ambiente senza freno.
- Raccolta accuratamente lo strato nuvoloso di PBMC da ciascuna provetta e transfer per nuovi ml provette sterili 50.
- Aggiungere a ciascun tubo RPMI ad un volume finale di 50 ml. Mescolare delicatamente per inversione.
- Centrifugare le cellule a 500 xg per 10 min a 4 ° C con freno pieno.
- Rimuovere il surnatante da ogni provetta. Risospendere il pellet di cellule provenienti da ogni provetta e aggiungere RPMI ad un volume finale di 50 ml. Mescolare delicatamente per inversione.
- Centrifugare le cellule a 500 g per 6 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante da ogni provetta. Risospendere e piscina insieme le sospensioni di cellule in una provetta da 50 ml.
- Portare il volume delle PBMC aggregati fino a 50 ml con più RPMI. Mescolare delicatamente per inversione.
- Centrifugare le cellule a 300 g per 6 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 50 ml di RPMI. Mescolare delicatamente per garantire la sospensione cellulare uniforme.
- Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali.
- Centrifugare le cellule a 300G per 6 minuti a 4 ° C. Preparare il supporto di congelamento. Congelamento dei media è costituito da 10% di dimetilsolfossido (DMSO; Miltenyi Biotec) in AB umana sierica (Valle Biomedica).
- Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 8 cellule / ml in mezzi congelamento fredde.
- Fai aliquote da 1 ml a 1,8 ml cryovials.
- Trasferire i cryovials nel congelatore a velocità controllata e iniziare la corsa di congelamento, Programma 1. Al termine della corsa, trasferire le cryovials congelati immediatamente nella fase vapore del congelatore azoto liquido.
2. Giorno 0: la differenziazione delle cellule dendritiche da monociti
- Aggiungere 30 ml di RPMI / 1% di plasma autologo di una sterile 50 ml tubo conico.
- Aliquote disgelo di PBMC congelati da parte di agitazione a 37 ° C bagnomaria. Quando completamente scongelati, trasferire il contenuto dei flaconi per la sterile da 50 ml tubo conico. Mescolare accuratamente.
- Centrifugare le cellule per 6 mina 500 xg a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule pellet in un piccolo volume di RPMI / 1% di plasma autologo. Poi aggiungere più RPMI / 1% di plasma autologo ad un volume finale di 50 ml. Mescolare accuratamente.
- Centrifugare nuovamente le cellule per 6 min a 500 xg a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 50 ml di RPMI / 1% di plasma autologo. Mescolare accuratamente.
- Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali.
- Piastra 1,40 x 10 8 cellule in 40 ml di RPMI / 1% di plasma autologo su 225 centimetri 2 EasyFlask. Ripetere l'operazione fino a che tutte le celle sono stati placcati.
- Incubare le EasyFlasks piatte sul suo lato per 1-2 ore a 37 ° C in coltura tissutale incubatore contenente il 5% di CO 2 per permettere ai monociti di aderire al pallone.
- Quando l'incubazione, rimuovere il EasyFlask dall'incubatore e lavare due volte per rimuovere le cellule non aderenti USIng 30 ml di RPMI preriscaldata.
- Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 40 ml di RPMI / 1% di plasma autologo con 400-1,000 IU / ml di IL-4 e 100-1.000 UI / ml di GM-CSF 5-8. Per questo protocollo, stiamo utilizzando 400 UI / ml di IL-4 e 100 UI / ml di GM-CSF.
- Incubare le EasyFlasks per 2 giorni a 37 ° C in incubatore coltura tissutale contenente il 5% di CO 2.
3. Giorno 2: Alimentazione delle cellule dendritiche con IL-4 e GM-CSF
- Aggiungere 4 ml di RPMI / 1% di plasma autologo con 400-1,000 IU / ml di IL-4 e 100-1.000 UI / ml di GM-CSF per ciascun EasyFlask. Mescolare accuratamente e dondolo su un fianco.
- Incubare le EasyFlasks per ulteriori 3 giorni (fino al giorno 5) a 37 ° C in incubatore coltura tissutale contenente il 5% di CO 2.
4. Giorno 5: Raccolta di cellule dendritiche immature
- Raccogliere le culture vigorosamente vorticoso i palloni e pipettando su e giù per risospendere le cellule non aderenti e vagamente aderente. Trasferire ilcellule raccolte a nuove provette coniche da 50 ml.
- Centrifugare le provette a 500 g per 6 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 50 ml RPMI / 1% di plasma autologo. Mescolare accuratamente.
- Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali.
- Centrifugare le provette a 500 g per 6 minuti a temperatura ambiente. Piastra di 1-2 x 10 6 cellule per pozzetto in 3 ml RPMI / 1% di plasma autologo con 400 IU / ml di IL-4 e 100 UI / ml di GM-CSF in piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti.
- Incubare le piastre a 37 ° C in coltura tissutale incubatore contenente il 5% di CO 2 durante la notte.
5. Giorno 6: Maturazione e Antigen Caricamento delle cellule dendritiche
- Aggiungere 10 mcg / ml KLH a 1/3 dei pozzetti nelle piastre di coltura a 6 pozzetti. Swirl le piastre per mescolare. KLH viene aggiunto solo a 1/3 dei pozzi perché KLH è usato solo per il primo vaccino DC. Successivamente DC vaccini conTain solo i peptidi antigeni tumorali.
- DC può essere stimolato a maturare con stimoli diversi. Gli stimoli maturazione più comuni che è stato utilizzato in studi clinici è stato un cocktail di citochine (IL-1 β, TNFa e IL-6) e di prostaglandina E2 (PGE2) 9,10. Più di recente, l'uso di agonisti dei recettori Toll-like (TLR) hanno guadagnato popolarità 11,12. In questo protocollo, aggiungere 2 mg / ml Polyinosinic-policitidilico Carbossimetilcellulosa acido poli-L-lisina (Poly-ICLC) ad ogni pozzetto e mescolare bene. Poli-ICLC è la formulazione clinico-grado di Poly-IC che viene stabilizzato con poli-L-lisina e *-carbossimetilcellulosa (fabbricato da Oncovir, Inc.).
- Aggiungere 100 pg / ml antigeni peptidici lunghi (NY-ESO-1 e / o Melan-A/MART-1) nei pozzetti designati, ogni pozzetto riceve solo un singolo peptide per evitare la concorrenza 13.
- Incubare le piastre a 37 ° C in coltura tissutale incubatore contenente il 5% di CO <sub> 2 O / N.
6. Giorno 7: Crioconservazione delle cellule dendritiche
- Preparare la soluzione di congelamento DC utilizzando plasma autologo e il 10% di DMSO. Centrifugare la soluzione di congelamento DC a 2.000 xg per 20 min a 4 ° C per rimuovere il materiale particolato. Trasferire il surnatante in una nuova etichetta da 15 ml tubo conico. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Quando la notte di incubazione è terminata, il raccolto e la piscina tutti i pozzetti contenenti DC pulsate con i peptidi in provette coniche da 50 ml.
- Centrifugare le provette a 500 g per 6 min. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 5 ml di RPMI / 1% di plasma autologo. Portare il volume totale fino a 50 ml con RPMI / 1% di plasma autologo. Mescolare accuratamente.
- Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali.
- Centrifugare le provette a 500 × g per 6 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 5 ml steriLe 0,9% NaCl, USP e trasferimento in nuovi tubi da 15 ml. Portare ogni sospensione cellulare a 14 ml con più sterile di NaCl 0,9%, USP. Cap e mescolare per inversione.
- Ripetere il passaggio precedente per due volte. Dopo l'ultima centrifugazione, rimuovere i surnatanti, ottenendo il più vicino possibile al pellet cellulari senza disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet di cellule in CC Solution congelamento a 4 - 20 x 10 6 cellule / ml e 1 ml aliquota ad ogni flacone CryoTube 1,8 ml.
- Utilizzare il congelatore a velocità regolata, Programma 1, di congelare le aliquote di vaccini DC e trasferire immediatamente nella fase vapore di un congelatore azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
7. Lotto controllo del rilascio
- Ogni lotto di vaccino DC deve essere valutato e rispettare determinati criteri di lotto specifico (Tabella 1) prima di essere rilasciato per iniezione in pazienti nello studio, in genere 5-6 settimane dopo la preparazione del vaccino.
- Viabilità:Valutare la sostenibilità del vaccino DC utilizzando un contatore automatico di cellule. La specifica minima redditività accettabile è> 70%.
- Identità: Valutare l'identità della DC mature (CD11c + CD14-CD83 +) in citometria a flusso. La percentuale di cellule + CD11c deve essere> 50%. La percentuale di CD11c + e CD14 + cellule dovrebbe essere <30% e la percentuale di CD11c +, CD14-, CD83 + e cellule devono essere> 50%.
- Sterilità: test del vaccino DC per la presenza di batteri anaerobici e aerobici e funghi di cultura diretta e colorazione di Gram. Valutare la presenza di micoplasma utilizzando un sistema di coltura diretta e DNA fluorocromo Assay colorazione con indicatore Cell Line. Per queste prove, il set minimo specifica è alcuna crescita viene osservato da tutte le culture.
- Endotossina: valutare il contenuto di endotossine con il Kinetic-QCL cinetico cromogenico LAL test e deve essere <50 EU / ml per soddisfare i criteri minimi.
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Representative Results
Tra il 10 - 20% delle PBMC partire differenziarsi in cellule dendritiche al termine del periodo di coltura. DC mature sono CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, e CCR7 + (Figura 1). Essi esprimono alti livelli di MHC di classe I e II e le molecole di molecole co-stimolatorie CD80 e CD86. Poli-ICLC anche indotto livelli inferiori di PDL-1 rispetto ad altri agonisti TLR 14. Inoltre, questi Poly-IC-maturati dendritiche secernono grandi quantità di IL-12 (Figura 2 e 15,16) e inducono la proliferazione delle cellule T allogeniche (Figura 3).
Figura 1. Rappresentante fenotipo delle DC completamente differenziate maturata con Poly-IC. Tutti i controller sono stati gated in avanti-e side-scatter plot. DC sono stati identificati unas CD11c + e CD14-. La maturazione delle DC in risposta a Poli-ICLC (linea in grassetto) è stata valutata in base all'espressione di CD83, CD40, e CCR7 e rispetto ai PVS non stimolate (colore grigio). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. DC maturata con Poly-IC produrre alti livelli di citochine. Surnatanti da DCS differenziati da 3 donatori sani sono stati raccolti durante la notte, dopo la maturazione delle DC con Poly-IC. Citochine prodotte sono state misurate con citochine Array perlina (CBA) umane citochine infiammatorie Kit (BD Biosciences) che misura IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β e IL-8.
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Figura 3. DC maturata con Poli-ICLC inducono la proliferazione delle cellule T allogeniche. Poly-ICLC-maturata DC da donatori sani sono state incubate 1:10 con Carboxyfluorescein Diacetato succinimidile Ester (CFSE)-etichettati cellule T allogeniche. Dopo 6 giorni, proliferazione (A) è stata valutata mediante citometria a flusso per gating sulla CD3 + popolazione di cellule T. Asse X mostra la diluizione CFSE, come misura della proliferazione, nelle diverse condizioni di co-coltura: cellule T da solo, non stimolato DC, Poly-ICLC stimolato DC e cellule T (PHA)-PBMC stimolate. Secrezione di citochine (B) durante la proliferazione è stata valutata dai surnatanti nelle colture utilizzando la BD CBA umano Th1/Th2 citochine Kit II (BD Biosciences) che misura IFNy, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, e IL-2. Solo IFNy è mostrato come le altre citochine non sono stati rilevati a livelli misurabili nel saggio./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
| Prova | Metodo | Criteri |
| Viabilità | Guava Personal Analisi cellulare con reagente ViaCount | > 70% |
| Identità | Citometria a Flusso -% CD11c + cellule | > 50% |
| Citometria a Flusso -% CD11c + CD14 + cellule | <30% | |
| Citometria a Flusso -% CD11c + CD14-CD83 + cellule | > 50% | |
| Sterilità | Colture batteriche e fungine | Negativo |
| Mycoplasma: Diretta Cell Culture | Negativo | |
| Endotossine | Cinetico cromogenico LAL test | <50 EU / ml |
| Funzione | Mixed reazione dei linfociti | Risultati dei rapporti |
Tabella 1. Lotto Criteri di rilascio.
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Discussion
Fase I e II di sviluppo clinico di DC derivate da monociti hanno dimostrato che inducono risposte immunitarie nei pazienti però il successo clinico è stato limitato 1. Ciò può essere dovuto in parte alla mancanza di consenso su come generare il DCS ottimali per uso immunotherapeutic tumore. Sebbene ci siano molti modi per generare DC ad uso clinico, questi metodi variano in termini di uso di citochine utilizzati per differenziare i monociti, stimoli usati per indurre la maturazione, e metodi di antigene carico. La formula per la generazione dei PVS ottimali rimane ancora da definire 2.
Recenti studi in vitro hanno dimostrato che le DC maturate con un cocktail di citochine proinfiammatorie 10 che è stato utilizzato nella maggior parte degli studi clinici, in particolare la presenza di PGE2, possono indurre la differenziazione delle cellule T regolatorie e le risposte Th2 17, espresso IDO 18, e sono carenti di IL-12p70produzione 19. Questi effetti minano notevolmente la capacità del vaccino di indurre risposte immunitarie e pertanto sostenere la necessità di valutare metodi alternativi di PVS scadenza per ottimizzare gli effetti in vivo.
L'uso di agonisti TLR, in particolare il TLR 3 agonista Poly-IC, di maturare il DCS possono migliorare l'efficacia clinica delle DC. Studi in vitro hanno dimostrato che le DC Poly-IC-maturati mantenuti stabili alta espressione di molecole MHC e CD83 e molecole di costimolazione CD40, CD80, CD86 e 14,15,20. PVS Ulteriormente, Poly-IC-maturati producono alti livelli di IL-12, 14,16,20, una citochina importante per la generazione di risposta anti-tumorale 21, così come altre citochine proinfiammatorie quali TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10 e IFN di tipo I. 14. Ancora più importante, come è stato dimostrato in modelli tumorali murini, DC pulsate con virus del papilloma umano (HPV), antigeni e maturato wrisposte delle cellule T Poly-IC-innescato citotossici esima erano in grado di sradicare stabilito HPV16 tumori che esprimono 22. Come lo stato di maturazione delle DC e la presenza di IL-12 appaiono correlate con l'efficacia negli studi clinici 23,24, l'uso di Poly-IC di DC mature può essere un passo importante verso raggiungere l'obiettivo di successo clinico.
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Disclosures
Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario dal seguente: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 e K08 AI084578 (Miller)), la Bill and Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research, e l'Emerald Fondazione. Nina Bhardwaj è un coinventore su brevetti relativi alla preparazione e utilizzo di cellule dendritiche per manipolare l'immunità. Gli autori non hanno altre affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o ente con un interesse finanziario in conflitto o finanziaria con l'oggetto o materiale discusso nel manoscritto oltre a quelle descritte.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Andres Salazar (Oncovir, Inc.) per il dono della Poli-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
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