Summary
El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.
Abstract
Mientras que los estudios clínicos han establecido que las vacunas de DC cargadas con antígeno son seguros y prometedora terapia para los tumores 1, su eficacia clínica queda por establecer. El método descrito a continuación, preparado de conformidad con las Buenas Proceso de Fabricación (GMP) directrices, es una optimización del procedimiento de preparación ex vivo más común para la generación de un gran número de países en desarrollo para los estudios clínicos 2.
Nuestro método utiliza el TLR 3 agonista sintético poliinosínico-policitidílico Carboximetilcelulosa-ácido poli-L-lisina (poli-ICLC) para estimular los países en desarrollo. Nuestro estudio anterior estableció que poli-ICLC es el más potente estímulo de maduración individual para países en desarrollo humano según lo evaluado por una regulación positiva de CD83 y CD86, la inducción de la interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma inducida proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), y los interferones tipo I (IFN), y la interleucina mínima 10 (IL-10) de producción. Países en desarrollo se diferencian a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs congeladas) obtenidos por leucoféresis. PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y se congelaron en alícuotas. En el Día 1, las PBMC se descongelan y se sembraron en matraces de cultivo tisular para seleccionar para los monocitos que se adhieren a la superficie de plástico después de 1-2 horas de incubación a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido. Después de la incubación, los linfocitos se eliminan mediante lavado y los monocitos adherentes se cultivaron durante 5 días en presencia de interleucina-4 (IL-4) y el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) para diferenciar a los DC inmaduras. En el día 6, las DC inmaduras son pulsadas con la proteína hemocianina de lapa californiana (KLH), que sirve como control para la calidad de la vacuna y puede aumentar la inmunogenicidad de la vacuna 3. Los países en desarrollo son estimulados a madurar, cargados de antígenos de péptido, y se incubaron durante la noche. En el día 7, las células se lavaron, y se congelaron en alícuotas de 1 ml que contienen4-20 x 10 6 células usando un congelador de velocidad controlada. Pruebas de liberación del lote para los lotes de centros de datos se lleva a cabo y debe cumplir con las especificaciones mínimas antes de ser inyectadas en pacientes.
Protocol
1. El aislamiento y la criopreservación de PBMC 4
- Asépticamente pico de uno de los puertos de acceso en la bolsa de leucaféresis utilizando un conjunto de transferencia de plasma. Usando una jeringa de 60 ml, transferir la aféresis obtenidos de pacientes en un frasco estéril de 500 ml.
- Ajustar el volumen de la leucaféresis a 2x su volumen original utilizando medio RPMI a temperatura ambiente. Mezclar bien.
- Mezcle suavemente la botella de Ficoll-Paque PLUS. Añadir 12 ml de Ficoll-Paque PLUS en el tubo cónico estéril de 50 ml.
- Suavemente capa de 30 ml del producto leucaféresis diluido a cada tubo cónico estéril de 50 ml que contiene Ficoll. Tenga cuidado de no molestar a la interfaz entre el Ficoll y la suspensión celular.
- Repetir los pasos 1.3 y 1.4 hasta que todo el leucaféresis se ha acodado.
- Centrifugar los tubos cónicos de 50 ml a 1000 × g durante 20 min a temperatura ambiente sin freno.
- Cosechar cuidadosamente la capa turbia de PBMC de cada tubo y transfer para nuevos tubos estériles de 50 ml.
- Añadir medio RPMI a cada tubo a un volumen final de 50 ml. Mezclar suavemente por inversión.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 10 min a 4 ° C con el freno completo.
- Retirar los sobrenadantes de cada tubo. Resuspender los sedimentos de células de cada tubo y añadir medio RPMI a un volumen final de 50 ml. Mezclar suavemente por inversión.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 6 min a 4 ° C.
- Retirar los sobrenadantes de cada tubo. Volver a suspender y poner en común las suspensiones de células en un tubo cónico de 50 ml.
- Llevar el volumen de las PBMC agrupados hasta 50 ml con medio RPMI más. Mezclar suavemente por inversión.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 6 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 50 ml de RPMI. Mezclar con cuidado para asegurarse de suspensión celular uniforme.
- Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables.
- Centrifugar las células a 300× g durante 6 min a 4 ° C. Preparar los medios de congelación. Medios de congelación se compone de 10% dimetil sulfóxido (DMSO; Miltenyi Biotec) en el suero humano AB (Valle Biomédica).
- Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células a una concentración final de 2 x 10 8 células / ml en medio de congelación frío.
- Hacer alícuotas de 1 ml en 1,8 ml crioviales.
- Transfiera los crioviales en el congelador de velocidad controlada y comenzar la carrera de congelación, Programa 1. Al final de la carrera, la transferencia de los crioviales congelados inmediatamente en la fase de vapor del congelador de nitrógeno líquido.
2. Día 0: La diferenciación de las células dendríticas a partir de monocitos
- Añadir 30 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo a un tubo cónico de 50 ml estéril.
- Descongelar las alícuotas de PBMC congelados por agitación suave en el baño de agua a 37 ° C. Cuando completamente descongelado, transferir el contenido de los viales al tubo cónico estéril de 50 ml. Mezclar bien.
- Centrifugar las células durante 6 mina 500 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en un pequeño volumen de RPMI / 1% de plasma autólogo. A continuación, añadir más RPMI / 1% de plasma autólogo a un volumen final de 50 ml. Mezclar bien.
- Centrifugar las células de nuevo durante 6 min a 500 x g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Mezclar bien.
- Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables.
- Placa de 1,40 x 10 8 células en 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo a 225 cm 2 EasYFlask. Repita hasta que todas las células se han plateado.
- Incubar las EasyFlasks planas en su lado para 1 - 2 horas a 37 ° C en el incubador de cultivo tisular que contiene 5% de CO 2 para permitir que los monocitos se adhieran al matraz.
- Cuando la incubación se completa, retire el EasYFlask de la incubadora y se lava dos veces para eliminar las células no adherentes USI30 ng ml de medio RPMI precalentado.
- Después del segundo lavado, añadir 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo con 400-1.000 UI / ml de IL-4 y 100-1.000 UI / ml de GM-CSF 5-8. En este protocolo, estamos usando 400 UI / ml de IL-4 y 100 UI / ml de GM-CSF.
- Incubar las EasyFlasks durante 2 días a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido que contenía 5% de CO 2.
3. Día 2: La alimentación de las células dendríticas con IL-4 y GM-CSF
- Añadir 4 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo con 400-1.000 UI / ml de IL-4 y 100-1.000 UI / ml de GM-CSF a cada EasYFlask. Mezclar por agitación y balanceándose de lado.
- Incubar las EasyFlasks para 3 días más (hasta el día 5) a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido que contenía 5% de CO 2.
4. Día 5: La recolección de las células dendríticas inmaduras
- Recoger las culturas agitando vigorosamente los frascos y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender las células no adherentes y poco adheridos. Transferir elcélulas cosechadas a nuevos tubos cónicos de 50 ml.
- Centrifugar los tubos a 500 xg durante 6 min a temperatura ambiente. Retirar los sobrenadantes y resuspender el sedimento celular en 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Mezclar bien.
- Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables.
- Centrifugar los tubos a 500 xg durante 6 min a temperatura ambiente. Placa de 1-2 x 10 6 células por pocillo en 3 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo con 400 UI / ml de IL-4 y 100 UI / ml de GM-CSF en placas de cultivo tisular de 6 pocillos.
- Incubar las placas a 37 ° C en el incubador de cultivo tisular que contiene 5% de CO 2 durante la noche.
5. Día 6: Maduración y Antigen carga de las células dendríticas
- Añadir 10 g / ml de KLH a 1/3 de los pocillos en las placas de cultivo de 6 pocillos. Remolino de las placas para mezclar. KLH sólo se añade a 1/3 de los pozos debido a KLH sólo se utiliza para la primera vacuna DC. Tras DC vacunas conTain sólo los péptidos antigénicos tumorales.
- DC puede ser estimulado para madurar el uso de diferentes estímulos. Los estímulos de maduración más comunes que se han utilizado en estudios clínicos ha sido un cóctel de citoquinas (IL-1 β, TNF, e IL-6) y la prostaglandina E2 (PGE2) 9,10. Más recientemente, el uso de agonistas de receptores de tipo Toll (TLR) han ganado popularidad 11,12. En este protocolo, agregue 2 mg / ml poliinosínico-policitidílico Carboximetilcelulosa ácido poli-L-lisina (poli-ICLC) a los pocillos y mezclar bien. Poli-ICLC es la formulación de grado clínico de poli-IC que se estabiliza con poli-L-*-lisina y carboximetilcelulosa (fabricado por Oncovir, Inc.).
- Añadir 100 g / ml antígenos peptídicos largos (NY-ESO-1 y / o Melan-A/MART-1) a sus pocillos designados, cada pocillo recibe sólo un único péptido para evitar competencia cruzada 13.
- Incubar las placas a 37 ° C en el incubador de cultivo tisular que contiene 5% de CO <sub> 2 O / N.
6. Día 7: La criopreservación de las células dendríticas
- Preparar la solución de congelación DC con plasma autólogo y 10% DMSO. Centrifugar la solución de congelación DC en 2000 × g durante 20 min a 4 ° C para eliminar cualquier material particulado. Transferir el sobrenadante a un nuevo marcado con 15 ml de tubo cónico. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
- Cuando se termina la incubación durante la noche, la cosecha y la piscina todos los pocillos que contienen los DC pulsados con los péptidos en tubos cónicos de 50 ml.
- Centrifugar los tubos a 500 g durante 6 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de células en 5 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Llevar el volumen total hasta 50 ml con RPMI / 1% de plasma autólogo. Mezclar bien.
- Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables.
- Centrifugar los tubos a 500 xg durante 6 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 5 ml steriLe NaCl al 0,9%, USP y transferencia a nuevos tubos cónicos de 15 ml. Llevar a cada suspensión de células a 14 ml con más estéril de NaCl al 0,9%, USP. Tapar y mezclar por inversión.
- Repita el paso anterior dos veces. Después de la última centrifugación, eliminar los sobrenadantes, conseguir lo más cerca posible a los gránulos de las células sin molestar a los gránulos.
- Resuspender los sedimentos celulares en DC Solución congelación a 4 - 20 x 10 6 células / ml y la alícuota de 1 ml a cada uno 1,8 ml frasco CRIOTUBO.
- Utilice el congelador de velocidad controlada, Programa 1, para congelar por las partes alícuotas de las vacunas de DC y transferir inmediatamente en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
7. Pruebas de liberación de lotes
- Cada lote de vacuna contra la DC debe ser evaluado y cumple con los criterios específicos de liberación de lotes (Tabla 1), antes de ser declarada apta para la inyección en los pacientes en el estudio, por lo general de 5 a 6 semanas después de la preparación de la vacuna.
- Viabilidad:Evaluar la viabilidad de la vacuna DC a través de un contador de células automatizado. La especificación mínima viabilidad aceptable es> 70%.
- Identidad: Evaluar la identidad de la DC maduras (CD11c + CD14-CD83 +) por citometría de flujo. El porcentaje de células CD11c + debe ser> 50%. El porcentaje de células CD11c + y CD14 + debería ser <30% y el porcentaje de CD11c +, CD14-, CD83 + y células deben ser> 50%.
- Esterilidad: Prueba de la vacuna contra la DC para detectar la presencia de bacterias y hongos anaeróbicos y aeróbicos por cultivo directo y tinción de Gram. Evaluar la presencia de micoplasma utilizando un sistema de cultivo directo y ADN fluorocromo ensayo de tinción con la línea celular indicadora. Para estas pruebas, el conjunto de especificación mínima es que no se observa crecimiento de todas las culturas.
- La endotoxina: Evaluar el contenido de endotoxina utilizando el ensayo cromogénico LAL cinético-Kinetic QCL y debe ser <50 EU / ml para satisfacer los criterios mínimos.
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Representative Results
Entre el 10 - 20% de PBMCs de partida se diferencian en países en desarrollo al final del periodo de cultivo. DC maduras son CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, y CCR7 + (Figura 1). Ellos expresan altos niveles de MHC de clase I y II y las moléculas de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Poli-ICLC también indujo niveles más bajos de PDL-1 en comparación con otros agonistas de TLR 14. Además, estos poli-IC-DCs maduradas segregan grandes cantidades de IL-12 (Figura 2 y 15,16) e inducir la proliferación de células T alogénicas (Figura 3).
Figura 1. Representante fenotipo de las DC totalmente diferenciadas maduras con poli-IC. Todos los países en desarrollo eran cerrada en las declaraciones prospectivas, y la trama dispersión lateral. Países en desarrollo se identificó uns CD11c + y CD14-. La maduración de las DC en respuesta a la poli-ICLC se evaluó (línea gruesa) sobre la base de la expresión de CD83, CD40 y CCR7 y se compara con países en desarrollo sin estimular (color gris). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. DC madurado con poli-IC producir altos niveles de citoquinas. Sobrenadantes de los países en desarrollo diferenciadas a partir de 3 donantes sanos se recogieron después de la maduración de las DC durante la noche con poli-IC. Las citoquinas producidas se midieron por citoquinas de bolas Array (CBA) citoquinas inflamatorias Humanos Kit (BD Biosciences), que mide la IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β, IL-8.
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Figura 3. DC madurado con poli-ICLC inducir la proliferación de células T alogénicas. Poli-ICLC-madurado DC de donantes sanos fueron incubadas 1:10 con diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-marcado las células T alogénicas. Después de 6 días, la proliferación (A) se evaluó por citometría de flujo por gating en la población CD3 + células T. Eje X muestra la dilución de CFSE, como una medida de la proliferación, en las diversas condiciones de co-cultivo: las células T solas, sin estimular DC, poli-ICLC estimulado DC, y las células T (PHA) estimuladas con fitohemaglutinina. La secreción de citocinas (B) durante la proliferación se evaluó a partir de los sobrenadantes de los cultivos utilizando el BD CBA humano de citoquinas Th1/Th2 Kit II (BD Biosciences) que mide IFN, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, y IL-2. Sólo IFN se muestra como no se detectaron las otras citoquinas a niveles medibles en el ensayo./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
| Prueba | Método | Criterios |
| Viabilidad | Guayaba Análisis Celular Personal con el reactivo ViaCount | > 70% |
| Identidad | Citometría de Flujo -% de células CD11c + | > 50% |
| Citometría de Flujo -% de células CD11c + CD14 + | <30% | |
| % De células CD11c + CD14-CD83 + - Citometría de Flujo | > 50% | |
| Esterilidad | Los cultivos de bacterias y hongos | Negativo |
| Mycoplasma: Direct cultivo celular | Negativo | |
| La endotoxina | Cinético cromogénico LAL Ensayo | <50 EU / ml |
| Función | Reacción mixta de linfocitos | Informe de Resultados |
Tabla 1. Lote Criterios para el lanzamiento.
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Discussion
Fase I y II de los ensayos clínicos de los DC derivadas de monocitos he demostrado que inducen la respuesta inmune en los pacientes sin embargo el éxito clínico ha sido limitado 1. Esto puede deberse en parte a la falta de consenso sobre la forma de generar los países en desarrollo óptimos para el uso de inmunoterapia tumoral. Aunque hay numerosas maneras de generar los DC de grado clínico, estos métodos varían en términos de la utilización de citoquinas usados para diferenciar los monocitos, los estímulos utilizados para inducir la maduración, y los métodos de carga de antígeno. La fórmula para la generación de los países en desarrollo óptimos todavía queda por definir 2.
Recientes estudios in vitro han mostrado que las CD maduras con un cóctel de citoquinas proinflamatorias 10 que se ha utilizado en la mayoría de los ensayos clínicos, en particular, la presencia de PGE2, puede inducir la diferenciación de células T reguladoras y las respuestas de Th2 17, expresa IDO 18, y son deficientes en IL-12p70producción 19. Estos efectos debilitan significativamente la capacidad de la vacuna para inducir la respuesta inmune y por lo tanto compatible con la necesidad de evaluar los métodos alternativos de maduración países en desarrollo con el fin de optimizar sus efectos in vivo.
El uso de agonistas de TLR, en particular, el agonista de TLR 3 Poli-IC, para madurar los países en desarrollo pueden mejorar la eficacia clínica de las DC. En los estudios in vitro han demostrado que los países en desarrollo poli-IC-madurado retenidos alta expresión estable de las moléculas de MHC y CD83 y moléculas coestimuladoras CD40, CD80, y CD86 14,15,20. DC Adicionalmente, poli-IC-madurado producen altos niveles de IL-12, 14,16,20 una citoquina importante para la generación de la respuesta anti-tumoral 21, así como otras citoquinas proinflamatorias tales como TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10, y los IFN tipo I 14. Más importante, como se ha demostrado en modelos de tumores murinos, los DC pulsados con virus del papiloma humano (VPH) y antígenos madurado wrespuestas de células T poli-IC-priming citotóxicos ith eran capaces de erradicar establecido HPV16 tumores que expresan 22. A medida que el estado de maduración de las DC y la presencia de IL-12 parecen estar en correlación con la eficacia en los ensayos clínicos 23,24, el uso de poli-IC de DC maduras puede ser un paso importante para alcanzar la meta de éxito clínico.
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Disclosures
Los autores han recibido apoyo financiero de las siguientes opciones: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 y AI084578 K08 (Miller)), la Fundación Bill y Melinda Gates, la Fundación Doris Duke Charitable, Instituto de Investigación del Cáncer, la Alianza para la Investigación de Lupus y la Esmeralda Fundación. Nina Bhardwaj es un co-inventor de patentes relacionadas con la preparación y el uso de células dendríticas para manipular la inmunidad. Los autores no tienen otras relaciones relevantes o de activos financieros con ninguna organización o entidad que tenga un interés financiero en o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito, aparte de los descritos.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Andrés Salazar (Oncovir, Inc.) por el don de la poli-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
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