Summary
Den mest benyttede metode for generering av et stort antall autologe dendrittiske celler (DC) for anvendelse i tumor immunoterapi er beskrevet. Metoden bruker IL-4 og GM-CSF for å skille DCs fra monocytter. Umodne DC blir stimulert til å modne og deretter lastet med antigener før de blir injisert tilbake i pasienten.
Abstract
Mens kliniske studier har fastslått at antigen-lastet DC vaksiner er trygge og lovende behandling for svulster 1, forblir deres kliniske effekten skal etableres. Metoden er beskrevet nedenfor, utarbeidet i samsvar med Good Manufacturing Process (GMP) retningslinjer, er en optimalisering av de vanligste ex vivo forberedelse metode for å generere et stort antall utviklingsland for kliniske studier to.
Vår metode benytter syntetisk TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) for å stimulere DCs. Våre tidligere undersøkelser fastslår at Poly-ICLC er den mest potente individuell modning stimulans for humane DC som vurdert av en oppregulering av CD83 og CD86, induksjon av interleukin-12 (IL-12), tumornekrosefaktor (TNF), interferon gamma-indusert protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) og type I-interferoner (IFN), og den minimale interleukin 10 (IL-10)-produksjon. DCs er differensiert fra frosne perifere mononukleære celler (PBMCs) fremstilt ved leukaferese. PBMC blir isolert ved Ficoll-gradientsentrifugering, og frosset i alikvoter. På dag 1 blir PBMC tint og platet ut på vevskulturflasker å selektere for monocytter som festes til plastoverflaten etter 1-2 timers inkubasjon ved 37 ° C i vevskultur-inkubator. Etter inkubasjon blir lymfocyttene vasket av, og de adherente monocytter dyrkes i 5 dager i nærvær av interleukin-4 (IL-4) og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) for å differensiere til umodne DCS. På dag seks, er umodne DCs pulserende med Nøkkelhullet limpet hemocyanin (KLH) protein som fungerer som en kontroll for kvaliteten på vaksinen, og kan øke effekten av vaksinen tre. DCS blir stimulert til å modne, lastet med peptid antigener, og inkubert over natten. På dag 7 ble cellene vasket, og frosset i en ml alikvoter inneholdende4-20 x 10 6 celler ved hjelp av en kontrollert-rate fryser. Lot utgivelsen testing for de grupper av utviklingsland er utført og må oppfylle minimum spesifikasjoner før de blir injisert i pasienter.
Protocol
En. Isolasjon og Nedfrysing av PBMCs 4
- Aseptisk pigg en av adkomstveiene havner i leukaferese bag ved hjelp av en plasma overføring sett. Ved hjelp av en 60 ml sprøyte, overfører leukaferese oppnådd fra pasienter i en steril 500 ml flaske.
- Juster volumet på leukaferese til 2x sin opprinnelige volumet ved hjelp romtemperatur RPMI. Bland godt.
- Bland flaske Ficoll-Paque PLUS. Legg 12 ml Ficoll-Paque PLUS i sterile 50 ml konisk tube.
- Forsiktig lag 30 ml av det fortynnede produkt leukaferese til hvert sterilt 50 ml konisk rør inneholdende Ficoll. Vær forsiktig så du ikke å forstyrre grensesnittet mellom Ficoll og celle suspensjon.
- Gjenta trinnene 1,3 og 1,4 inntil alle leukaferese er lagdelt.
- Sentrifuger 50 ml koniske rør ved 1000 x g i 20 min ved romtemperatur uten brems.
- Nøye høste skyet lag av PBMCs fra hvert rør og overførr til nye sterile 50 ml rør.
- Legg RPMI til hvert rør til et endelig volum på 50 ml. Bland forsiktig ved å vende.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 10 minutter ved 4 ° C med full brems.
- Fjern supernatantene fra hvert rør. Resuspender cellen pellets fra hvert rør og legg RPMI til et sluttvolum på 50 ml. Bland forsiktig ved å vende.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 6 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatantene fra hvert rør. Gjensuspender og basseng sammen cellesuspensjoner i en 50 ml konisk tube.
- Bring volumet til de oppsamlede PBMC opp til 50 ml med RPMI mer. Bland forsiktig ved å vende.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 6 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten. Cellepelleten suspenderes i 50 ml RPMI. Bland forsiktig for å sikre ensartet celle suspensjon.
- Tell antall celler og bestemme celle-levedyktighet. Beregn det totale antall levedyktige celler.
- Sentrifuger cellene ved 300G i 6 min ved 4 ° C. Forberede frysing media. Frysemedier består av 10% dimetylsulfoksid (DMSO; Miltenyi Biotec) i humant AB serum (dal Biomedical).
- Fjern supernatanten. Resuspender cellene ved en sluttkonsentrasjon på 2 x 10 8 celler / ml i kalde frysemediet.
- Gjør en ml deler i 1,8 ml cryovials.
- Overfør cryovials inn i kontrollert-rate fryser og begynne frysing løp, 1 Program. Ved slutten av kjøringen, overføre de frosne cryovials umiddelbart inn i gassfasen av den flytende nitrogen fryser.
2. Dag 0: Differensiering av dendrittiske celler fra monocytter
- Tilsett 30 ml med RPMI / 1% autologt plasma til et sterilt 50 ml konisk rør.
- Tine porsjoner av frosne PBMCs med forsiktig omrøring i 37 ° C vannbad. Når du er helt tint, overføre innholdet i hetteglass som den sterile 50 ml konisk tube. Bland godt.
- Sentrifuger cellene for 6 minved 500 x g ved romtemperatur. Fjern supernatanten og resuspender pelleterte celler i et lite volum av RPMI / 1% autologt plasma. Deretter legger mer RPMI / 1% autologt plasma til et sluttvolum på 50 ml. Bland godt.
- Sentrifuger cellene på nytt i 6 min ved 500 x g ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 50 ml RPMI / 1% autologt plasma. Bland godt.
- Tell antall celler og bestemme celle-levedyktighet. Beregn det totale antall levedyktige celler.
- Plate 1,40 x 10 8 celler i 40 ml RPMI / 1% autolog plasma på 225 cm 2 EasyFlask. Gjenta til alle cellene er blitt belagt.
- Inkuber EasyFlasks flatt på sin side for 1-2 timer ved 37 ° C i vevet kultur inkubator som inneholder 5% CO 2 for å la monocytter til å følge kolben.
- Når inkubasjonen er ferdig, fjernes EasyFlask fra inkubatoren og vask to ganger for å fjerne de ikke-adherente celler USIng 30 ml forvarmet RPMI.
- Etter den andre vask, tilsett 40 ml av RPMI / 1% autologt plasma med 400-1,000 IE / ml IL-4 og 100-1,000 IE / ml GM-CSF 5-8. For denne protokollen, bruker vi 400 IE / ml IL-4 og 100 IE / ml GM-CSF.
- Inkuber EasyFlasks for to dager ved 37 ° C i vevet kultur inkubator som inneholder 5% CO 2.
3. Dag 2: Fôring av dendrittiske celler med IL-4 og GM-CSF
- Tilsett 4 ml med RPMI / 1% autologt plasma med 400-1,000 IE / ml IL-4 og 100-1,000 IE / ml GM-CSF til hver EasyFlask. Bland ved å svinge og rock på sin side.
- Inkuber EasyFlasks i 3 dager (frem til dag 5) ved 37 ° C i vevet kultur inkubator som inneholder 5% CO 2.
4. Dag 5: Høsting av Umodne dendrittiske celler
- Høste kulturer ved kraftig virvlende kolbene og ved pipettering opp og ned for å resuspendere ikke-heftende og løst heftende celler. Overførhøstet celler til nye 50 ml koniske rør.
- Sentrifuger rørene ved 500 x g i 6 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatants og cellepelleten suspenderes i 50 ml RPMI / 1% autolog plasma. Bland godt.
- Tell antall celler og bestemme celle-levedyktighet. Beregn det totale antall levedyktige celler.
- Sentrifuger rørene ved 500 x g i 6 minutter ved romtemperatur. Plate 1-2 x 10 6 celler per brønn i 3 ml RPMI / 1% autologt plasma med 400 IU / ml IL-4 og 100 IE / ml GM-CSF, i 6-brønners vevskulturplater.
- Inkuber platene ved 37 ° C i vevskultur inkubator inneholdende 5% CO 2 over natten.
5. Dag 6: Modning og Antigen lasting av dendrittiske celler
- Tilsett 10 ug / ml KLH til 1/3 av brønnene i 6-brønners dyrkings-plater. Swirl platene til mix. KLH er bare lagt til 1/3 av brønnene fordi KLH brukes kun for første DC vaksine. Etterfølgende DC vaksiner conopprettholde bare svulsten antigen peptider.
- DCs kan bli stimulert til å modne hjelp av ulike stimuli. De vanligste modning stimuli som har vært brukt i kliniske studier har vært en cocktail av cytokiner (IL-1 β, TNFa og IL-6) og prostaglandin E2 (PGE 2) 9,10. Mer nylig har bruken av Toll-lignende reseptorer (TLR) agonister vunnet popularitet 11,12. I denne protokollen, tilsett 2 mg / ml Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) til brønnene og bland godt. Poly-ICLC er den kliniske karakter-formulering av poly-IC som er stabilisert med poly-L-lysin-* og karboksymetylcellulose (fremstilt av Oncovir, Inc.).
- Tilsett 100 ug / ml lange peptid-antigener (NY-ESO-1 og / eller Melan-A/MART-1) til sine bestemte brønner, hver brønn som bare mottok en enkelt peptid for å unngå kryss-konkurranse 13.
- Inkuber platene ved 37 ° C i vevskultur inkubator inneholdende 5% CO <sub> 2 O / N.
6. Dag 7: Nedfrysing av dendrittiske celler
- Forbered DC Frysing Solution hjelp autologt plasma og 10% DMSO. Sentrifuger DC Frysing Solution ved 2000 x g i 20 min ved 4 ° C for å fjerne eventuelt partikkelmateriale. Overfør supernatanten til en ny merket 15 ml konisk tube. Oppbevar ved 4 ° C før bruk.
- Når natten inkubasjon er ferdig, innhøsting og basseng alle brønnene som inneholder DCs pulserende med peptider i 50 ml koniske rør.
- Sentrifuger rørene ved 500 x g i 6 min. Fjern supernatantene. Resuspender cellepelleten i 5 ml RPMI / 1% autologt plasma. Bringe det totale volum opp til 50 ml med RPMI / 1% autologt plasma. Bland godt.
- Tell antall celler og bestemme celle-levedyktighet. Beregn totalt antall levedyktige celler.
- Sentrifuger rørene på 500 × g for 6 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatants og resuspender hver pellet i 5 ml sterilele 0,9% NaCl, USP og overføring til nye 15 ml koniske rør. Bringe hver cellesuspensjon til 14 ml med mer steril 0,9% NaCl, USP. Cap og bland ved inversjon.
- Gjenta forrige trinn to ganger. Etter siste sentrifugering, fjern supernatants, å komme så nært som mulig til cellen pellets uten å forstyrre pellets.
- Resuspender cellen pellets i DC Frysing Løsning på 4 - 20 x 10 6 celler / ml og delmengde 1 ml til hver 1,8 ml CryoTube hetteglass.
- Bruk med kontrollert hastighet fryser, Program 1, for å fryse ned alikvoter av DC-vaksiner og overføre umiddelbart inn i dampfasen av en flytende nitrogen fryser for langtidslagring.
7. Lot Slipp Testing
- Hver batch av DC vaksine må vurderes og innfrir spesifikke mye utslipp kriterier (tabell 1) før det slippes for injeksjon i pasienter i studien, vanligvis 5-6 uker etter vaksinen forberedelse.
- Livskraftig:Evaluere levedyktigheten av DC vaksine ved hjelp av en automatisk celleteller. Minste akseptable levedyktighet spesifikasjonen er> 70%.
- Identity: Vurdere identiteten til den modne DCs (CD11c + CD14-CD83 +) ved flowcytometri. Prosentandelen av CD11c +-celler bør være> 50%. Prosentandelen av CD11c + og CD14 + celler bør være <30% og andelen av CD11c +, CD14-og CD83 + celler bør være> 50%.
- Sterilitet: Test DC vaksine for tilstedeværelsen av anaerob og aerob bakterier og sopp ved direkte kultur og Gram flekker. Vurdere for tilstedeværelse av mycoplasma bruker en direkte kultur system og DNA fluorokrom Farging analysen med Indikator Cell linje. For disse testene, er minimum spesifikasjonen innstilt at ingen vekst observeres fra alle kulturer.
- Endotoksiner: Vurdere endotoksiner innhold ved hjelp av Kinetic-Qcl kinetisk chromogenic LAL analysen og det må være <50 EU / ml for å møte minimumskravene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mellom 10-20% av start PBMC differensierer til DC ved slutten av kulturen periode. Modne DCs er CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, og CCR7 + (Figur 1). De uttrykker høye nivåer av MHC klasse I og II molekyler og de kostimulerende molekyler CD80 og CD86. Poly-ICLC også indusert lavere nivåer av PDL-1 i forhold til andre TLR-agonister 14. I tillegg viser disse poly-IC-modnet DCS utskiller store mengder av IL-12 (figur 2 og 15,16) og indusere proliferasjon av allogene T-celler (figur 3).
Figur 1. Representativt fenotype av fullt differensierte DCs modnet med Poly-IC. Alle DCs var inngjerdet på frem-og side-spredningsdiagram. DCs ble identifisert ens CD11c + og CD14-. Modning av DCs svar på Poly-ICLC (fet linje) ble evaluert basert på uttrykk for CD83, CD40, og CCR7 og sammenlignet med unstimulated DCs (grå skygge). Klikk her for å se større figur .
Figur 2. DCs modnet med Poly-IC produsere høye nivåer av cytokiner. Supernatanter fra DCs differensiert fra tre friske blodgivere ble samlet etter natten modning av DCs med Poly-IC. Cytokiner produsert ble målt ved Cytokin Bead Array (CBA) HR inflammatoriske cytokiner Kit (BD Biosciences) som måler IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β, og IL-8.
rc = "/ files/ftp_upload/50085/50085fig3.jpg" />
Figur 3. DCs modnet med Poly-ICLC indusere spredning av allogene T-celler. Poly-ICLC-modnet DCs fra friske blodgivere ble inkubert 01:10 med Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE)-merket allogene T-celler. Etter 6 dager ble spredning (A) evaluert ved flow cytometri ved avgrensning på CD3 + T-celle-populasjonen. X-aksen viser fortynning av CFSE, som en måling av proliferasjon, i de forskjellige ko-kultur forhold: T celler alene, ustimulert DC, poly-ICLC stimulert DC, og fytohemagglutinin (PHA)-stimulerte T-celler. Cytokin sekresjon (B) i løpet av proliferasjonen ble evaluert fra supernatantene i kulturer bruk av BD CBA Humant Th1/Th2 Cytokin kit II (BD Biosciences) som måler IFNγ, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, og IL-2. Bare IFNγ er vist som de andre cytokiner ikke ble detektert til målbare nivåer i analysen./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
| Test | Metode | Kriterier |
| Livskraftig | Guava Personlig Cell Analysis med ViaCount Reagens | > 70% |
| Identity | Flowcytometrisystemer -% CD11c + celler | > 50% |
| Flowcytometrisystemer -% CD11c + CD14 + celler | <30% | |
| Flowcytometri -% CD11c + CD14-CD83 + celler | > 50% | |
| Sterilitet | Bakterielle og Fungal kulturer | Negativ |
| Mycoplasma: Direkte Cell Culture | Negativ | |
| Endotoksiner | Kinetic Kromogene LAL-analyse | <50 EU / ml |
| Funksjon | Blandet lymfocyttreaksjon | Rapport Resultater |
Tabell 1. Lot Slipp Criteria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fase I og II kliniske studier av blodmonocyttavledede DCs har vist at de indusere immunresponser hos pasienter imidlertid klinisk suksess har vært begrenset en. Dette kan delvis skyldes mangel på enighet om hvordan å generere de optimale DCs for svulst immunterapeutisk bruk. Selv om det er mange måter å generere klinisk grad DCS disse metodene varierer når det gjelder bruken av cytokiner som brukes til å differensiere monocytter er stimuleringen brukes til å indusere modningen og fremgangsmåter for antigen lasting. Formelen for å generere de optimale DCs fortsatt gjenstår å bli definert to.
Nylige studier in vitro har vist at DCS modnet med en cocktail av pro-inflammatoriske cytokiner 10 som har vært brukt i de fleste kliniske studier, spesielt for tilstedeværelsen av PGE2, kan indusere differensiering av regulatoriske T-celler og Th2-responser 17, vil uttrykkelig IDO 18, og er mangelfull i IL-12p70produksjon 19. Disse effekter signifikant svekke vaksinen evne til å indusere immunresponser og således støtter behovet for å evaluere alternative metoder for modning DC for å optimalisere deres effekter in vivo.
Bruken av TLR-agonister, særlig TLR 3 agonist Poly-IC, for å modne DCs kan forbedre den kliniske effekten av DCs. In vitro studier har vist at Poly-IC-modnet DCs beholdt stabilt høyt uttrykk av MHC molekyler og CD83 og kostimulerende molekyler CD40, CD80 og CD86 14,15,20. I tillegg, poly-IC-modnet DC produserte høye nivåer av IL-12, 14,16,20 et viktig cytokin for generering av anti-tumorrespons 21, så vel som andre pro-inflammatoriske cytokiner som TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10, og type I IFN 14. Enda viktigere, som har vært vist i murine tumor modeller, DCs pulserende med humant papillomavirus (HPV) antigener og modnet wed Poly-IC-primet cytotoksiske T-celle responser var i stand til å utrydde etablert HPV16-uttrykke svulster 22. Som modningen status DC og tilstedeværelsen av IL-12 synes å sammenfalle med effekt i kliniske studier 23,24, kan bruk av Poly-IC til modne DCs være et viktig skritt mot å nå målet om klinisk suksess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har mottatt økonomisk støtte fra følgende: NIH (AI061684, AI071078, AI044628, og K08 AI084578 (Miller)), Bill og Melinda Gates Foundation, Doris Duke Veldedige Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research, og Emerald Foundation. Nina Bhardwaj er et coinventor på patentpublikasjoner som vedrører fremstillingen og anvendelsen av dendrittiske celler for å manipulere immunitet. Forfatterne har ingen andre relevante overbevisninger eller økonomiske engasjement i enhver organisasjon eller enhet med en økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med saksforholdet eller materialer diskutert i manuskriptet bortsett fra de som er beskrevet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Andres Salazar (Oncovir, Inc.) for gaven av Poly-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O'Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants? Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
