Summary
La méthode la plus couramment utilisée pour générer un grand nombre de cellules dendritiques autologues (CD) pour l'utilisation dans l'immunothérapie tumorale est décrite. La méthode utilise IL-4 et GM-CSF pour différencier les PED à partir de monocytes. Les DC immatures sont stimulées à maturité, puis chargé avec des antigènes avant qu'ils ne soient réinjectées au patient.
Abstract
Bien que des études cliniques ont établi que les vaccins DC antigène chargées sont sûrs et thérapie prometteuse pour les tumeurs 1, leur efficacité clinique reste à établir. La méthode décrite ci-dessous, préparé conformément aux bonnes processus de fabrication (BPF) des lignes directrices, est une optimisation de la méthode de préparation ex vivo la plus courante pour générer un grand nombre de pays en développement pour les essais cliniques 2.
Notre méthode utilise le TLR synthétique 3 agoniste POLYINOSINIQUE-polycytidylique Carboxymethylcellulose acide poly-L-lysine (Poly-ICLC) afin de stimuler les PED. Notre précédente étude a établi que Poly-ICLC est le stimulus de maturation individuelle la plus puissante pour les PED humains telle qu'elle est évaluée par une régulation positive de CD83 et CD86, l'induction de l'interleukine-12 (IL-12), le facteur de nécrose tumorale (TNF), l'interféron gamma induite Protéines 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), et interférons de type I (IFN) et l'interleukine minimal 10 (IL-10) de production. PED sont différenciées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP surgelés) obtenues par cytaphérèse. PBMC sont isolées par gradient de Ficoll centrifugation et congelées en portions. Le Jour 1, CMSP sont décongelés et étalées sur des flacons de culture de tissus à choisir pour les monocytes qui adhèrent à la surface du plastique après 1-2 heures d'incubation à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire. Après incubation, les lymphocytes sont lavés et les monocytes adhérents sont cultivées pendant 5 jours en présence d'interleukine 4 (IL-4) et granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) se différencier pour les CD immatures. Au jour 6, DC immatures sont puisées avec la patelle protéines trou de serrure (KLH), qui sert de contrôle pour la qualité du vaccin et peut stimuler l'immunogénicité du vaccin 3. Les pays en développement sont encouragés à mûrir, chargées avec des antigènes peptidiques, et incubées pendant la nuit. Au jour 7, les cellules sont lavées, et congelés dans aliquotes de 1 ml contenant4 - 20 x 10 6 cellules en utilisant un congélateur à vitesse contrôlée. essai de libération du lot pour les lots des PED est effectuée et doit respecter les spécifications minimales avant d'être injectés dans patients.
Protocol
1. L'isolement et la cryoconservation des PBMC 4
- Aseptiquement pointe l'un des orifices d'accès à la poche de cytaphérèse aide d'un ensemble de transfert de plasma. En utilisant une seringue de 60 ml, transférer la cytaphérèse provenant de patients dans un flacon de 500 ml stérile.
- Réglez le volume de la cytaphérèse 2x son volume initial en utilisant la température ambiante RPMI. Mélanger soigneusement.
- Mélanger délicatement la bouteille de Ficoll-Paque PLUS. Ajouter 12 ml PLUS Ficoll-Paque dans le tube conique stérile de 50 ml.
- Couche doucement 30 ml de produit de leucaphérèse dilué dans chaque tube conique stérile de 50 ml contenant de Ficoll. Veillez à ne pas perturber l'interface entre le Ficoll et la suspension cellulaire.
- Répétez les étapes 1.3 et 1.4 jusqu'à ce que toute la cytaphérèse a été posé.
- Centrifuger les tubes coniques de 50 ml à 1000 g pendant 20 min à température ambiante sans frein.
- Récolter soigneusement la couche nuageuse de CMSP de chaque tube et transfer pour les nouveaux tubes stériles de 50 ml.
- Ajouter dans chaque tube du RPMI pour obtenir un volume final de 50 ml. Mélanger doucement par inversion.
- Centrifuger les cellules à 500 g pendant 10 min à 4 ° C avec plein frein.
- Retirer le surnageant de chaque tube. Remettre en suspension les culots de cellules de chaque tube et ajouter RPMI à un volume final de 50 ml. Mélanger doucement par inversion.
- Centrifuger les cellules à 500 g pendant 6 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant de chaque tube. Remettre en suspension et la piscine ensemble les suspensions de cellules dans un tube conique de 50 ml.
- Porter le volume des CMSP communs jusqu'à 50 ml avec plus RPMI. Mélanger doucement par inversion.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 6 min à 4 ° C.
- Eliminer le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 50 ml de RPMI. Mélanger doucement afin d'assurer suspension cellulaire uniforme.
- Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables.
- Centrifuger les cellules à 300G pendant 6 min à 4 ° C. Préparer les milieux de congélation. Milieux de congélation se compose de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO; Miltenyi Biotec) dans le sérum humain AB (Vallée biomédicale).
- Eliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 2 x 10 8 cellules / ml dans un milieu froid glacial.
- Faire aliquotes de 1 ml dans 1,8 ml cryovials.
- Transférer les tubes cryogéniques dans le congélateur à vitesse contrôlée et commencer la course congélation, programme 1. A la fin de la course, transférer les cryotubes congelés immédiatement dans la phase de vapeur de la congélation à l'azote liquide.
2. Jour 0: La différenciation des cellules dendritiques à partir de monocytes
- Ajouter 30 ml de RPMI / 1% de plasma autologue dans un tube conique ml stérile 50.
- aliquotes de dégel CMSP gelés par une légère agitation dans le 37 ° C au bain d'eau. Quand il est complètement dégelé, transférer le contenu des flacons au tube conique stérile de 50 ml. Mélanger soigneusement.
- Centrifuger les cellules pendant 6 minà 500 × g à la température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un petit volume de RPMI / 1% de plasma autologue. Ensuite, ajouter de RPMI / 1% de plasma autologue à un volume final de 50 ml. Mélanger soigneusement.
- Centrifuger les cellules pendant 6 min à 500 g à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ml de RPMI / 1% de plasma autologue. Mélanger soigneusement.
- Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables.
- Plaque 1,40 x 10 8 cellules dans 40 ml de RPMI / 1% de plasma autologue sur 225 cm 2 EasyFlask. Répétez jusqu'à ce que toutes les cellules ont été étalées.
- Incuber les EasyFlasks plat sur le côté pour 1 - 2 heures à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2 pour permettre les monocytes adhèrent au ballon.
- Lorsque l'incubation est terminée, retirez le EasyFlask de l'incubateur et laver deux fois pour éliminer les cellules non-adhérentes using 30 ml de RPMI préchauffé.
- Après le second lavage, ajouter 40 ml de RPMI / 1% de plasma autologue avec 400-1000 UI / ml d'IL-4 et 100-1000 UI / ml de GM-CSF 5-8. Pour ce protocole, nous utilisons 400 UI / ml d'IL-4 et 100 UI / ml de GM-CSF.
- Incuber les EasyFlasks pendant 2 jours à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2.
3. Jour 2: Nourrir des cellules dendritiques avec IL-4 et GM-CSF
- Ajouter 4 ml de RPMI / 1% de plasma autologue avec 400-1000 UI / ml d'IL-4 et 100-1000 UI / ml de GM-CSF à chaque EasyFlask. Mélanger en agitant et en faisant tourner sur le côté.
- Incuber les EasyFlasks pour 3 jours (jusqu'au 5ème jour) à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2.
4. Jour 5: La récolte des cellules dendritiques immatures
- Récolter les cultures en agitant vigoureusement les flacons et par pipetage de haut en bas pour remettre en suspension les cellules non adhérentes et peu adhérente. Transférer lecellules récoltées à de nouveaux tubes 50 ml fond conique.
- Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 50 ml de RPMI / 1% de plasma autologue. Mélanger soigneusement.
- Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables.
- Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min à température ambiante. Plate 1-2 x 10 6 cellules par puits dans 3 ml de RPMI / 1% de plasma autologue avec 400 UI / ml d'IL-4 et 100 UI / ml de GM-CSF dans des plaques de culture tissulaire à 6 puits.
- Incuber les plaques à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2 pendant la nuit.
5. Jour 6: Maturation et Antigen Chargement des cellules dendritiques
- Ajouter 10 pg / ml KLH à 1/3 des puits dans des plaques de culture à 6 puits. Swirl les plaques pour bien mélanger. KLH est seulement ajouté à 1/3 du puits, car KLH est utilisé uniquement pour le premier vaccin de courant continu. Après DC vaccins conmaintenir seulement les peptides antigéniques tumoraux.
- PED peut être stimulée à mûrir en utilisant différents stimuli. Les stimuli de maturation plus courants qui ont été utilisés dans les études cliniques a été un cocktail de cytokines (IL-1 β, TNF et IL-6) et de prostaglandine E2 (PGE2) 9,10. Plus récemment, l'utilisation d'agonistes des récepteurs Toll-like (TLR) ont gagné en popularité 11,12. Dans ce protocole, ajouter 2 mg / ml POLYINOSINIQUE-polycytidylique Carboxymethylcellulose acide poly-L-lysine (Poly-ICLC) dans les puits et bien mélanger. Poly-ICLC est la formulation de qualité clinique du Poly-IC qui est stabilisé avec de la poly-L-lysine-* et de la carboxyméthylcellulose (fabriqué par Oncovir, Inc.).
- Ajouter 100 g / antigènes peptidiques longs ml (NY-ESO-1 et / ou Melan-A/MART-1) à leurs puits désignés, chaque puits recevant une seule peptide d'éviter compétition croisée 13.
- Incuber les boîtes à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO <sub> 2 O / N.
6. Jour 7: La cryoconservation des cellules dendritiques
- Préparer la solution de congélation DC en utilisant du plasma autologue et 10% de DMSO. Centrifuger la solution de congélation DC à 2.000 g pendant 20 min à 4 ° C pour éliminer toute matière particulaire. Transférer le surnageant dans un nouveau tube avec étiquette conique de 15 ml. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Lorsque la nuit d'incubation est terminée, la récolte et la piscine tous les puits contenant les PED puisées avec les peptides en tubes coniques de 50 ml.
- Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min. Retirer le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 5 ml de RPMI / 1% de plasma autologue. Porter le volume total à 50 ml avec du RPMI / 1% de plasma autologue. Mélanger soigneusement.
- Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables.
- Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 5 ml Sterile NaCl à 0,9%, USP et le transfert de nouvelles 15 ml tubes coniques. Apportez chaque suspension cellulaire à 14 ml de NaCl plus stérile à 0,9%, USP. Cap et mélanger par inversion.
- Répétez l'étape précédente deux fois. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant, se rapprochant le plus possible de les culots cellulaires sans perturber les pastilles.
- Remettre en suspension les culots cellulaires dans la solution de congélation DC à 4 - 20 x 10 6 cellules / ml et aliquote de 1 ml dans chaque flacon de CryoTube 1,8 ml.
- Utilisez le congélateur à vitesse contrôlée, programme 1, de geler le bas les portions de vaccins DC et transférer immédiatement dans la phase vapeur d'un congélateur à azote liquide pour le stockage à long terme.
7. Lot essais de libération
- Chaque lot de vaccin DC doit être évalué et répondent à des critères de libération des lots spécifiques (tableau 1) avant qu'il soit libéré pour injection à des patients dans l'étude, typiquement 5 à 6 semaines après la préparation du vaccin.
- Viabilité:Évaluer la viabilité du vaccin DC en utilisant un compteur de cellules automatisé. Les spécifications minimales de viabilité acceptable est> 70%.
- Identité: Évaluer l'identité du CD matures (CD11c + CD14-CD83 +) par cytométrie de flux. Le pourcentage de cellules + CD11c doit être> 50%. Le pourcentage de CD11c + et CD14 + des cellules doit être <30% et le pourcentage de CD11c +, CD14-, CD83 + et les cellules doivent être> 50%.
- La stérilité: Test du vaccin à courant continu pour la présence de bactéries et de champignons anaérobies et aérobies par culture directe et les taches de Gram. Évaluer la présence de mycoplasmes en utilisant un système de culture directe et ADN fluorochrome essai de coloration avec indicateur lignée cellulaire. Pour ces tests, l'ensemble des spécifications minimum est qu'aucune croissance est observée à partir de toutes les cultures.
- Endotoxine: Évaluer la quantité d'endotoxine en utilisant l'énergie cinétique test LAL chromogénique cinétique QCL et il doit être <50 EU / ml pour répondre aux critères minimaux.
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Representative Results
Entre 10 - 20% des CMSP départ se différencient en DC à la fin de la période de culture. CD matures sont CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, et CCR7 + (Figure 1). Ils expriment des niveaux élevés de molécules CMH de classe II et I et les molécules de co-stimulation CD80 et CD86. Poly-ICLC a également induit des niveaux inférieurs de PDL-1 par rapport à d'autres agonistes TLR 14. En outre, ces Poly-IC-mûri PED sécrètent de grandes quantités d'IL-12 (Figure 2 et 15,16) et induisent la prolifération des cellules T allogéniques (Figure 3).
Figure 1. Phénotype représentant des PED pleinement différenciés mûri avec Poly-IC. Toutes les PED étaient bloquées sur le terrain et avant dispersion latérale. PED ont identifié uns CD11c + et CD14-. La maturation des CD en réponse à Poly-ICLC (trait gras) a été évaluée sur la base de l'expression de CD83, CD40, et CCR7 et comparé aux PED non stimulées (nuances de gris). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. PED mûri avec Poly-IC produire des niveaux élevés de cytokines. Surnageants des PED différenciées à partir de 3 donneurs sains ont été recueillies après la maturation du jour au lendemain des PED avec Poly-IC. Les cytokines produites ont été mesurés par des cytokines réseau de billes (CBA) cytokines inflammatoires humaines kit (BD Biosciences) qui mesure l'IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β et d'IL-8.
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Figure 3. PED mûri avec Poly-ICLC induire la prolifération des cellules T allogéniques. Poly-ICLC mûri PED provenant de donneurs sains ont été incubés à 1:10 avec les cellules T allogéniques Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) étiquetés-. Après 6 jours, la prolifération (A) a été évaluée par cytométrie de flux par gating sur le CD3 + population de cellules T. L'axe des X montre la dilution de CFSE, comme une mesure de la prolifération, dans les diverses conditions de co-culture: les cellules T à eux seuls, non stimulées DC, Poly-ICLC stimulé DC, et les lymphocytes T (PHA) stimulées par la phytohémagglutinine. la sécrétion de cytokines (B) au cours de la prolifération a été évaluée à partir des surnageants des cultures à l'aide de la BD ABC Human Th1/Th2 cytokines Kit II (BD Biosciences) qui mesure IFN, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, et l'IL-2. Seulement IFN est indiqué que les autres cytokines n'ont pas été détectés à des niveaux mesurables dans le dosage./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
| Test | Méthode | Critères |
| Viabilité | Guava Personal Cell Analysis avec le réactif ViaCount | > 70% |
| Identité | cytométrie en flux -% + cellules CD11c | > 50% |
| cytométrie en flux -% CD11c + CD14 + cellules | <30% | |
| cytométrie en flux -% CD11c + CD14-CD83 + cellules | > 50% | |
| Stérilité | Cultures bactériennes et fongiques | Négatif |
| Mycoplasma: Direct Culture cellulaire | Négatif | |
| Endotoxine | Kinetic chromogénique LAL Assay | <50 EU / ml |
| Fonction | Réaction lymphocytaire mixte | Résultats du rapport |
Tableau 1. critères de libération des lots.
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Discussion
Phase I et II des essais cliniques de DC dérivées de monocytes ont montré qu'ils induisent des réponses immunitaires chez les patients mais le succès clinique a été limitée 1. Cela peut être dû en partie à l'absence de consensus sur la façon de générer les PED optimale pour une utilisation immunothérapie des tumeurs. Bien qu'il existe de nombreuses façons de générer des contrôleurs de qualité clinique, ces méthodes varient en fonction de l'utilisation de cytokines utilisées pour différencier les monocytes, les stimuli utilisés pour induire la maturation, et les méthodes de chargement de l'antigène. La formule pour la génération des SCD optimale reste encore à définir 2.
Des études récentes in vitro ont montré que les pays en développement sont arrivés à échéance avec un cocktail de cytokines pro-inflammatoires 10 qui a été utilisé dans la majorité des essais cliniques, en particulier la présence de PGE2, peuvent induire la différenciation de cellules régulatrices T et des réponses Th2 17, expresse IDO 18, et qui sont déficientes en IL-12p70production 19. Ces effets minent considérablement la capacité du vaccin à induire des réponses immunitaires et donc soutenir la nécessité d'évaluer des méthodes alternatives de PED à échéance, afin d'optimiser leurs effets in vivo.
L'utilisation d'agonistes TLR, en particulier le TLR 3 agoniste Poly-IC, à mûrir les pays en développement peuvent améliorer l'efficacité clinique des PED. Des études in vitro ont montré que les PED Poly-IC-mûri conservés stable à haute expression des molécules du CMH et CD83 et molécules de co-stimulation CD40, CD80, CD86 et 14,15,20. PED En outre, Poly-IC-mûri produit des niveaux élevés d'IL-12, 14,16,20 une cytokine importante pour la génération de la réponse anti-tumorale 21, ainsi que d'autres cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10 et IFN de type I 14. Plus important encore, comme cela a été montré dans des modèles tumoraux murins, DC puisées par le virus du papillome humain (VPH) des antigènes et mûri wréponses des lymphocytes T Poly-IC-apprêté cytotoxiques vec étaient capables d'éradiquer établi HPV16 tumeurs exprimant 22. Comme l'état de maturation des CD et de la présence d'IL-12 semblent être en corrélation avec efficacité dans des essais cliniques 23,24, l'utilisation de Poly-IC à DC matures peut être une étape importante vers la réalisation de l'objectif de réussite clinique.
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Disclosures
Les auteurs ont reçu un soutien financier de ce qui suit: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 et AI084578 K08 (Miller)), la Fondation Bill et Melinda Gates, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, l'Alliance pour Lupus Research, et le Emerald Fondation. Nina Bhardwaj est un co-inventeur de brevets relatives à l'élaboration et à l'utilisation des cellules dendritiques pour manipuler l'immunité. Les auteurs n'ont pas d'autres affiliations pertinentes ou la participation financière de toute organisation ou entité ayant un intérêt financier ou conflit financier avec l'objet ou de matériaux discuté dans le manuscrit en dehors de ceux décrits.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Andres Salazar (Oncovir, Inc.) pour le don de la Poly-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
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