Summary
Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.
Abstract
Mammalian Hoden sehr komplexe Organe, die mehr als 30 verschiedenen Zelltypen, einschließlich somatischen Zellen und Hoden verschiedenen Stadien der Keimbahn-Zellen enthalten. Diese Heterogenität ist ein wichtiger Nachteil bezüglich der Studie von den Basen der Säuger Spermatogenese, als reiner oder angereicherter Zellpopulationen in bestimmten Stadien der Entwicklung der Spermien für die meisten molekularen Analysen 1 benötigt.
Verschiedene Strategien wie Staput 2,3, zentrifugale Elutriation 1 und Durchflusszytometrie (FC) 4,5 wurden eingesetzt, um angereichert oder gereinigt Hoden Zellpopulationen zu erhalten, um differentiellen Genexpression Studien zu ermöglichen.
Es ist erforderlich, dass die Zellen in Suspension für die meisten Anreicherung / Reinigung möglich sind. Im Idealfall wird die Zellsuspension werden Vertreter des ursprünglichen Gewebes, haben einen hohen Anteil an lebensfähigen Zellen und nur wenige multinucleates - die dazu neigen, wegen der Form,Syncytial Natur des Samenepithels 6,7 - und der Mangel Zellklumpen 1. Frühere Berichte hatten bewiesen, dass Hoden Zellsuspensionen von einem ausschließlich mechanischen Verfahren hergestellt leichter verklumpt als diejenigen trypsinierten 1. Auf der anderen Seite, enzymatische Behandlungen mit RNasen und / oder Disaggregation Enzyme wie Trypsin und Collagenase führen zu Makromolekülen Abbau, was für die bestimmten Downstream-Anwendungen ist. Der ideale Prozess sollte so kurz wie möglich und beinhalten minimale Manipulation, um so eine gute Erhaltung der Makromoleküle von Interesse, wie mRNAs zu erreichen. Diese Protokolle zur Herstellung von Zellsuspensionen aus festen Geweben sind in der Regel zeitaufwendig, sehr bedienerabhängige und wahlweise beschädigen bestimmten Zelltypen 1,8.
Das Protokoll hier vereint die Vorteile einer hoch reproduzierbar und extrem kurzen mechanischen Aufschluss mit dem einbsence der enzymatischen Behandlung, was eine gute Qualität Zellsuspensionen, die für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung 4 und anderweitige Genexpressionsstudien 9 verwendet werden kann.
Protocol
1. Herstellung von Zellsuspensionen
- Sacrifice die Probe entsprechend den Empfehlungen der Fachausschüsse wie IACUC oder gleichwertig verwendet werden (in Uruguay, Nationale Kommission für Tierversuche [CNEA]). In unserem Fall wurde eine Überdosis Pentobarbital verabreicht.
- Präparieren Sie die Hoden nach der Norm zulässigen Verfahren und legen Sie sie in einem 96 mm Glas Petrischale auf Eis, mit 10 ml eiskaltem DMEM ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum.
- Entfernen Sie die Tunica albuginea und schneiden Sie die entkapselten Hoden in quadratische Stücke von 2 - 3 mm auf jeder Seite.
- Diese Stücke werden dann in einem Medimachine eine automatisierte mechanische Mühle, wo das Gewebe in einer austauschbaren Einheit, die eine perforierte Edelstahlsieb und ein Metall Rotor aufgeschlüsselt verarbeitet wird. 5 dieser Stücke in einem 50 um Einweg-Einheit, Schalter auf der disaggregator und Prozess - Um dies zu tun, Platz 1 ml kaltem DMEM und 4 ergänzt für 50 Sekunden die folgenden, einfachen Anweisungen des Herstellers.
- Wiederherstellen der resultierende Zellsuspension aus der Aufschlüsselung Gerät mit einer 3 - 5 ml Spritze ohne Nadel.
- Man filtriert durch ein 50 um Nylon-Mesh, vorher eingeweicht mit 0,5 ml DMEM ergänzt.
- Filtern Sie die Suspension wieder mit einem getränkten 25 um Nylon-Mesh und auf Eis stellen.
- Zählen in einer Neubauer-Kammer und stellen zelluläre Konzentration auf 1 - 2 x 10 7 Zellen / ml mit DMEM ergänzt. Mindestens 4 x 10 7 Zellen / Gramm Hoden Material werden üblicherweise erhalten.
- Schließlich, fügen NDA (2-naphthol-6 ,8-disulfonsäure Dikaliumsalz) bis zu einer Endkonzentration von 0,2%, um Zelle Verklumpung verhindern.
- Optional: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen der Hoden Zellsuspensionen mit einem kommerziell erhältlichen Kit Lebensfähigkeit für tierische Zellen, nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Durchflusszytometrieanalyse
ve_content "> Wir haben ein Becton-Dickinson FACSVantage Durchflusszytometer mit einer kohärenten Argon-Ionen-Laser Resonanz bei 488 nm für die Analyse von Zellen mit hohen Konzentrationen von Propidiumiodid (PI) gefärbt emittieren eingesetzt wird. ausgestellt (PI Eintritt in unfixierten Zellen unter Stress wurde an anderer Stelle 9,10) gerichtet.- Für PI-Färbung, fügen Fluorochrom in einer Endkonzentration von 50 ug / ml der Zellsuspension, und Inkubation für 10 min bei 0 ° C in der Dunkelheit.
- Laserleistung bis 100 mW und einen 575/26 Bandpass-Filter verwendet wird, um PI-emittierten Fluoreszenz in FL2 sammeln eingestellt.
- Wir führen FC Messungen mit einem 70 um Düse. Für die Sortierung Spermatozyte Populationen gesetzt Sortierung Modus Normales-R oder normal-C, unter Verwendung von 3 sortiert Tropfen als Umschlag. Halten Sie Probe und Sammlung Röhrchen bei 3-4 ° C unter Verwendung einer Kühleinheit. Einstellen Probe Differential an Zellen mit einer Geschwindigkeit von 500 bis 1500 pro Sekunde zu analysieren.
- Verwenden CellQuest Software (BD) zu analysieren,die folgenden Parameter: forward scatter (FSC-H); Seitwärtsstreuung (SSC-H); insgesamt emittierten Fluoreszenz-oder Puls-Bereich (FL2-A) und Dauer der Fluoreszenz-Emission oder Puls-Weiten (FL2-W).
Alternativ haben wir die vitalen Farbstoff Hoechst 33342 in einer Endkonzentration von 5 ug / ml eingesetzt und inkubiert 10 min bei 37 ° C im Dunkeln. Zelle Analyse wurde mittels eines MoFlo Zytometer (DakoCytomation), ausgestattet mit einem UV-Anregungswellenlänge Laser, der bei 25 mW und mit einer Düse 70 um erfolgt. Datenmanipulation wurde mit Summit v4.3 Software (DakoCytomation) durchgeführt.
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Representative Results
Ein Beispiel für ein gut aufgeschlüsselten Zellsuspension aus Rattenhoden mit dem hier beschriebenen Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
Im Vergleich zur enzymatischen Behandlungen 6,8 und den zuvor beschriebenen mechanischen Aufschluss Verfahren 2 ist die hier vorgestellte viel schneller beinhaltet weniger Handhabung ist leicht reproduzierbar (nicht bedienerabhängige) und macht knapp Zelltrümmer (insbesondere im Vergleich zu anderen mechanischen Methoden) und nur sehr wenige multinucleates (die beschrieben worden zu bilden, als Folge der umfangreichen Gewebe Manipulation 1,2). Außerdem ist, wie enzymatische Behandlungen gegenüberliegenden, vermeidet die Verwendung von RNasen, Trypsin und Kollagenase, die Makromoleküle begünstigen könnte Abbau.
Auf der anderen Seite, obwohl früheren Berichten war nachgewiesen, dass Hoden Zellsuspensionen durch einen ausschließlich mechanischen Verfahren hergestellt leichter verklumpt als auf Trypsinn 1, übertragen die Anwendung des vorliegenden Verfahrens sehr wenig Klumpenbildung in den Zellsuspensionen, wie in 1 zu sehen ist. In diesem Sinne haben wir gefunden, die Einbeziehung der NDA sehr effizient bei der Verhinderung Zelle Verklumpung und Vermeidung Düsenverstopfung während Nachfließen Studien. Abbildung 1 zeigt auch die Knappheit der Zelltrümmer, die auch in der FC Histogramme in Abbildung 2 dargestellt, auf der Hand.
Außerdem zeigen Zellsuspensionen mit diesem Verfahren hergestellten eine angemessene Vertretung der verschiedenen Zelltypen Hoden. Dies wurde durch den Vergleich der zellulären Zusammensetzung von Hoden Zellsuspensionen durch das Verfahren hier mit Daten von Zellzahlen in Querschnitten Samenkanälchen berichtet dargestellt hergestellt abgeschlossen und mit Zellsuspensionen die mit anderen Verfahren angewendet werden (1).
FC Histogramme für Suspensionen von der prese hergestellt wurdennt-Protokoll und entweder mit Hoechst 33342 (2A) oder PI (2B) gefärbt nicht wesentlich von denen 8 bereits berichtet unterscheiden, unterstützt auch die Annahme, dass das Verfahren nicht selektiv beschädigen keine spezifischen Zelltyp.
| Hodenkrebs Zelltypen auf DNA-Gehalt bezogen | Intact Hoden a (%) | Medimachine - hergestellten Suspensionen b (%) | Trypsinisiert Suspensionen a (%) |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66,2 | 62,5 | 79,6 |
| 2C | 16,4 | 18,4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17.9 | 18,7 | 8.7 |
| Sonstiges | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66,5 | 65,5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11,5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| Eine Zelle Zählungen wurden durch mikroskopische Beobachtung beurteilt. b Die Zellzahlen wurden durch Durchflusszytometrie. | |||
Tabelle 1. Relative Anteile der erwachsenen Hoden Zellpopulationen, die sich in ihrer DNA-Gehalt für Zellsuspensionen aus Maus (A) und Meerschweinchen (B) durch die hier vorgestellte Methode hergestellt, im Vergleich zu intakten Hoden und - für Maus - to Trypsin-hergestellten Suspensionen (von Geisinger und Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet Geändert. Genome Res.. 128, 46 (2010)). DNA Inhalte sind: C (rund und elongating Spermatiden, Spermien), 2C (Hoden somatischen Zellen, Spermatogonien, Spermatozyten sekundären) und 4C (primären Spermatozyten und ein paar proliferierenden Spermatogonien in G2-Stadium).
Abbildung 1. Teilansicht einer Zellsuspension aus adulten Ratten-Hoden durch die vorliegende Protokoll erstellt und visualisiert durch Phasenkontrast-Mikroskopie. Wie man sehen kann, Zell cytoplasms sind gut erhalten. Der Balken entspricht 25 um. Übernommen aus Rodríguez-Casuriaga, et al., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).
Abbildung 2. FC DNA-Content-Analyse von Hoden Zellsuspensionen von erwachsenen Ratten, Mäuse, Meerschweinchen, und von 21 Tagen nach der Geburt (dpp) Rattenjungen, mit dem Vitalfarbstoffs Hoechst 33342 (A) oder mit PI (B) gefärbt. In allen Fällen C, 2C und 4C Zellpopulationen können leicht in den Histogrammen mit beiden Farbstoffe, sowie der scheinbar sub-haploiden Spitze auf der linken Seite des C Bevölkerung erhalten offengelegt werden. Diese letztere Peak wurde gezeigt, dass die Spermien, die als separates, weniger gefärbten Subpopulation aufgrund ihrer kondensierten Chromatin Zustand 12 genannt sind. Notieren Sie sich die Knappheit von Schutt in allen Grafiken. Dies zeigt sich besonders in der 21 dpp (Jungtiere) Profile, die Spermatiden und Spermien fehlt. Geändert von Geisinger und Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res.. 128, 46 (2010). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. 4C-Zell-Population aus einer Hoden-Zellsuspension von erwachsenen Ratte sortiert. Sortierten Zellen wurden auf saubere Poly-L-Lysin-behandelten Objektträger aufgebracht und beobachtet unter Phasen-Kontrast-Mikroskopie (A) oder Hellfeld nach Giemsa-Färbung (B). Bar = 20 um. Übernommen aus Geisinger und Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res.. 128, 46 (2010).
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. Abbildung 4 A) FC Analyse eines erwachsenen Meerschweinchen Hoden Zellsuspension mit dem Protokoll vorbereitet hier beschriebenen (a), Histogramm;. (B), Dot-Plot. Beachten Sie die beiden Subpopulationen im 4C-Zell-Population. B) Analyse der sortierten Zellen aus 4C R3 (a, b) und R4 (a ', b') Regionen. (A, a '), Epifluoreszenzmikroskop Bilder von PI-gefärbten Zellen . Beachten Sie, dass Kerne von R3 Region vergleichsweise kleiner sind. Bar: 10 um (b, b '), Laser konfokale Mikroskopie immunzytochemischer Reaktionen Spread-Zellen unter Verwendung eines Antikörpers gegen SYCP3 (Synaptonemal Komplex [SC] protein 3 eine seitliche Element-Komponente).. Das Bild lässt den Schluss zu, dass R3 Fraktion früh (lepto / Zygotän) meiocytes, in denen einfache Achsen und kurze Strecken VZ gesehen werden kann entspricht, während R4 enthält Pachytän meiocytes mit comkomplett montiert VZ. Geändert von Rodríguez-Casuriaga, et al., Durchflusszytometrie A. 79, 625 (2011). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. A) Agarose-Gelelektrophorese von Gesamt-RNA aus spermatogenic Flow-sortierten Zellfraktionen 2C, R3 und R4 (Erklärung auf den beiden letztgenannten Fraktionen ist in Abbildung 4) extrahiert. Zellsuspensionen wurden mit dem hier beschriebenen Protokoll hergestellt. B) Autoradiogramm eines denaturierenden Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel, wobei der differenzielle cDNA Bänder mittels der "mRNA differential display"-Methode (RNAimage; GenHunter Corporation, Nashville, TN) gewonnen wird, für eine der Primer-Kombinationen aus dem Satz. mRNAs aus den gleichen drei Zellpopulationen in
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Discussion
Die optimierte hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung von Zellsuspensionen aus Nagetier Hodengewebe in einem sehr schnellen und reproduzierbaren Weise vermeiden Enzym und Reinigungsmittel Behandlung und das Beibehalten der guten Integrität der Zelle und Art Proportionen. Die Kürze des Verfahrens (die 15 min Spannweite umfasst Hoden Dissektion, Schneiden von Gewebe und Verarbeitung), Aufwand ist minimal, und das Fehlen von enzymatischen Behandlungen sind nur einige der wichtigsten Vorteile. All dies würde für die gute Erhaltung des kurzen Lebens Makromolekülen, die kritisch, wenn eine repräsentative Stichprobe von Verbindungen, die in der ursprünglichen Zelle Bevölkerung erforderlich ist, ist entfallen.
In Bezug auf die Verwendung von entweder PI oder Hoechst 33342, haben wir keine offensichtlich Unterschiede in den Profilen aus Durchflusszytometrieanalyse von Hoden Zellsuspensionen mit dem Einsatz des einen oder des anderen Farbstoffs beobachtet. Der Farbstoff Wahl wird vielmehr auf die Vorlieben des Benutzers und Verfügbarkeit abhängig undüber geplante weitere Verwendung. Auf der einen Seite ist PI billiger, und der weit verbreiteten Anwendung als nicht erfordern den Einsatz von Durchflusszytometern und Sortierer mit einem UV-Laser. Auf der anderen Seite könnte obwohl wir erfolgreich PI-gefärbten Zellen für Hintergedanken Sortierung und differentiellen Genexpression Studien (Abbildung 4), Hoechst 33342 oder anderen Vitalfarbstoffs mit geringer Zytotoxizität Ebenen verwendet die bevorzugte Wahl für Anwendungen, bei denen volle Lebensfähigkeit der Zellen erforderlich sein, wie Keimzelle Kultur und / oder Transplantation 4.
Wir konnten auf bestimmte Zellpopulationen zu erreichen über 95% Reinheit entweder für ausgewählte Hoden Populationen mit unterschiedlichen DNA-Gehalt 4 (Abbildung 3) zu sortieren, oder auch für Bevölkerungsgruppen mit dem gleichen DNA-Gehalt, aber unterschiedliche Chromatinkondensation Ebenen (Abbildung 4). Letzteres kann so lange durchgeführt werden, da die Subpopulationen von Interesse an den Profilen cytometric individualisiert werden kann, particularly in der Dot-Plots. Zum Beispiel, bis jetzt konnten wir die verschiedenen Stadien von Meerschweinchen meiocytes I 9 sortieren, aber nicht zu unterscheiden und zu sortieren Subpopulationen innerhalb der Bevölkerung 2C einfach durch Färbung der DNA. Sortierten Zellen haben gute Qualität RNA gerendert, so dass nachgeschaltete Differential Genexpressionsanalysen 9 (Abbildung 5).
Wie in der Protokollbeschreibung zu sehen ist, ist es sehr einfach, leicht reproduzierbar, und erfordert nicht besonders geschultes Personal. Wir halten es für eine Vielzahl von Anwendungen, bei denen die Durchflusszytometrie oder nicht angenommen werden kann. Der ehemalige reichen von einfachen Hoden-Content-Analyse für die schnelle Überprüfung von spermatogenic Voraus, andere mit präparativer zielt wie Durchfluss Aufreinigung von spezifischen Zellpopulationen für Hintergedanken molekulare Studien, wie hier gezeigt.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch CSIC (I + D Projekt C022) und PEDECIBA unterstützt. Die Autoren wollen Mariela Bollati und Valentina Porro aus der Zellbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) danken für die großzügige Zusammenarbeit über die MoFlo Zellsortierer und Merial-Montevideo für sanft bietet alle Meerschweinchen Proben in diesem Projekt verwendet. Abbildung 1 Abbildungen 2 und 3 und Tabelle 1 mit Genehmigung der S. Karger AG, Basel;; wurde mit freundlicher Genehmigung von BioMed Central reproduziert und die Abbildungen 4 und 5 wurden reproduziert oder mit Genehmigung von John Wiley & Sons, Inc. (Copyright im Besitz angepasst Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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