Summary
Роман протокол для механической подготовки яичек клеточные суспензии от грызунов материала, избегая ферментов и моющих средств, описан. Метод очень прост, быстр, воспроизводимым, и оказывает хорошее качество клеточные суспензии, которые подходят для сортировки потоков и экстракции РНК.
Abstract
Семенниках млекопитающих очень сложных органов, которые содержат более 30 различных типов клеток, в том числе соматических клетках яичек и различных стадиях половых клетках. Эта неоднородность является важным недостатком относительно изучения основы сперматогенеза у млекопитающих, в виде чистого или обогащенного популяции клеток на определенных стадиях развития спермы необходимы для большинства молекулярного анализа 1.
Различные стратегии, такие как 2,3 Staput, центробежные Отмучиванием 1, и проточной цитометрии (FC) 4,5 были использованы для получения обогащенных или очищенной популяции клеток яичек, с тем чтобы дифференциальных исследований экспрессии генов.
Это требует, чтобы клетки в суспензии в течение наиболее обогащения / очистки подходов. В идеальном случае клеточной суспензии будет представитель исходной ткани, имеют высокую долю жизнеспособных клеток и несколько multinucleates - которые имеют тенденцию формировать из-засинцитиальный природе эпителия семенных 6,7 - и отсутствие скопления клеток 1. Предыдущие доклады свидетельствуют, что яичек клеточные суспензии подготовленный исключительно механическим способом слипаются легче, чем те, трипсинизированных 1. С другой стороны, ферментативные процедуры с РНКазы и / или дезагрегации ферментов, как трипсин и коллагеназу приводят к конкретным деградации макромолекул, что является нежелательным для некоторых последующих применений. Идеальный процесс должен быть как можно короче и включают минимальные манипуляции, так как для достижения хорошей сохранности макромолекул интереса, таких как мРНК. Текущие протоколы для приготовления суспензии клеток из твердых тканей обычно времени, весьма зависит от оператора, и может выборочно повредить определенные типы клеток 1,8.
Протокол, представленные здесь сочетает в себе преимущества высокой воспроизводимостью и очень кратко механической дезагрегации сbsence ферментативной обработки, что приводит к хорошим качеством клеточных суспензий, которые могут быть использованы для анализа методом проточной цитометрии и сортировки 4 и скрытые исследования экспрессии гена 9.
Protocol
1. Приготовление клеточных суспензий
- Жертвоприношение образца, которые будут использоваться в соответствии с рекомендациями специализированных комитетов, таких как IACUC или эквивалент (в Уругвае, Национальная комиссия по экспериментов на животных [НКАЭ]). В нашем случае передозировки пентобарбитала вводили.
- Проанализируйте яичках после стандартных утвержденных процедур и разместить их в 96 мм стеклянная чашка Петри на льду, содержащую 10 мл ледяной DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
- Снимите белочной оболочки и нарезать декапсулируется яички на квадратные заготовки из 2 - 3 мм с каждой стороны.
- Эти части затем обрабатываются в Medimachine, автоматизированной механической мясорубки, где ткань в разбивке внутри одноразового единица содержит перфорированный из нержавеющей стали с плоским экраном и металла ротора. Для этого, 1 место мл холодной дополнен DMEM и 4 - 5 из этих частей в 50 мкм одноразовые аппарата включите disaggregator, и процесс в течение 50 сек следуя простым инструкциям от производителя.
- Восстановление полученной клеточной суспензии из разбивки устройства с помощью 3 - 5 мл шприц без иглы.
- Фильтруют через 50 мкм нейлоновую сетку, предварительно пропитанные 0,5 мл DMEM, дополненный.
- Суспензию фильтруют еще раз, используя пропитанную 25 мкм нейлоновую сетку, и место на льду.
- Всего в камере Нойбауэра и настроить сотовые концентрации до 1 - 2 х 10 7 клеток / мл DMEM дополнена. По крайней мере, 4 х 10 7 клеток / грамм материала яичка обычно получаются.
- Наконец, добавьте NDA (2-нафтол-6 ,8-дисульфокислоты, двухкалийна соль) до конечной концентрации 0,2%, чтобы предотвратить слипание клетки.
- Дополнительно: проверить жизнеспособность клеток яичек клеточные суспензии имеющейся в продаже комплект для жизнеспособности клеток животных, следуя инструкциям производителя.
2. Проточной цитометрии
ve_content "> Мы использовали Becton-Dickinson FACSVantage проточной цитометрии оснащен когерентной аргоновый ионный лазер настроен на излучающих на длине волны 488 нм для анализа клеток, окрашенных с высокой концентрацией йодида пропидий (PI). (вопрос о входе в PI нефиксированной Клетки в состоянии стресса была решена в другом месте 9,10).- Для окрашивания PI, добавьте флуорохромом в конечной концентрации 50 мкг / мл к суспензии клеток, и инкубировали в течение 10 мин при 0 ° C в темноте.
- Мощность лазера установлен в 100 мВт и 575/26 полосовой фильтр используется для сбора PI-испускаемых флуоресценцию в FL2.
- Мы проводим измерения с FC 70 мкм сопла. Для сортировки сперматоцит населения, установить режим сортировки в Normal-R или Normal-C, с использованием 3 капли отсортированы как конверт. Хранить образца и сбор труб на 3 - 4 ° С с помощью холодильной установки. Регулировка образец дифференциального анализа клетки со скоростью от 500 до 1500 в секунду.
- Используйте CellQuest программного обеспечения (BD) для анализаследующими параметрами: прямого рассеяния (FSC-H); бокового рассеяния (SSC-H); полной излучаемой флуоресценции или широтно-области (FL2-А), и длительность флуоресценции или широтно-импульсной (FL2-W).
Кроме того, мы использовали витальным красителем Hoechst 33342 до конечной концентрации 5 мкг / мл и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С в темноте. Сотовые анализ проводили с помощью MoFlo цитометра (DakoCytomation), снабженный УФ волны возбуждения лазера, работающего на 25 мВт и с помощью 70 мкм сопла. Данные манипуляции проводили с саммита v4.3 программное обеспечение (DakoCytomation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример хорошо дезагрегированных суспензии клеток крысы семенников приготовленные с протоколом, описанным здесь показана на рисунке 1.
По сравнению с ферментативной процедуры 6,8 и в ранее описанных механических методов дезагрегирования 2, один представленный здесь происходит гораздо быстрее, требует меньше обработки, легко воспроизводимы (не зависит от оператора), а также оказывает дефицитный клеточного дебриса (особенно по сравнению с другими механическими методы), и очень немногие multinucleates (которые были описаны для формирования в результате обширных манипуляция ткани 1,2). Более того, в отличие от ферментативной лечения, это позволяет избежать использования РНКазы, Трипсин и коллагеназу, что может способствовать деградации макромолекул.
С другой стороны, хотя и предыдущие доклады свидетельствуют, что тестикулярной клеточные суспензии подготовленный исключительно механическим способом слипаются более легко, чем на трипсиномES 1, применение данного способа оказал очень мало слипания в клеточной суспензии, как это можно видеть на фигуре 1. В этом смысле, мы обнаружили, включение NDA очень эффективным в предотвращении клетки слипания, и избежать засорения сопел в течение последующих исследований потока. 1 также показывает нехватку клеточного дебриса, что также очевидно в гистограмм FC изображено на рисунке 2.
Кроме того, клеточные суспензии, приготовленные этим способом показывают адекватного представления различных типов клеток яичек. К такому выводу пришли, сравнивая клеточного состава яичек клеточные суспензии подготовленный метод, представленный здесь с данными из клеток на поперечных срезах семенных канальцев, а также с клеточные суспензии, приготовленные с использованием других методов, а также (табл. 1).
FC гистограмм, полученных для суспензий, приготовленных в Preseнт протокол и окрашивали либо с Hoechst 33342 (фиг. 2А) или PI (фиг. 2В) по существу не отличается от ранее сообщалось те 8, также поддерживают предположение, что процедура не избирательно повредить любой конкретный тип клеток.
| Яичка типов клеток на основе содержания ДНК | Неповрежденном яичке (%) | Medimachine - приготовленных суспензий B (%) | Трипсинизированных суспензий (%) |
| А) Mus мышцы | |||
| C | 66,2 | 62,5 | 79,6 |
| 2C | 16,4 | 18,4 | 7,3 |
| 4C </ TD> | 17,9 | 18,7 | 8,7 |
| Другие | - | - | 4,6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66,5 | 65,5 | N / D |
| 2C | 11,0 | 11,5 | N / D |
| 4C | 22,5 | 23,0 | N / D |
| Количество клеток оценивали по микроскопическим наблюдением. рассчитывает б клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. | |||
Таблица 1. Относительный процент взрослых яичек клеточных популяций отличающихся по содержанию ДНК в клеточную суспензию из мыши (А) и морской свинки (B), полученного таким образом представленный метод, по сравнению с интактными яичка и - для мыши - тО трипсиноподобная приготовленных суспензий (с изменениями по Geisinger и Родригес Casuriaga, Cytogenet. Геном Res. 128, 46 (2010)). ДНК содержания: C (круглые и удлинения сперматидах, сперматозоиды), 2С (соматические клетки яичек, сперматогониях, вторичные сперматоциты) и 4C (сперматоциты и несколько пролиферирующих сперматогенов G2 этап).
Рисунок 1. Частичный вид суспензии клеток от взрослых яичка крысы подготовленный настоящего Протокола и визуализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. Как видно, сотовые цитоплазме хорошо сохранились. Бар соответствует 25 мкм. Воспроизводится по Родригес Casuriaga и соавт., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).
Рисунок 2. FC содержание ДНК анализа яичек клеточные суспензии от взрослых крыс, мышей, морских свинок, и с 21 дней после родов (DPP) крысят, окрашивали витальным красителем Hoechst 33342 (А) или с PI (B). Во всех случаях популяций С, 2C и 4C клетки могут быть легко раскрыты в гистограмм, полученных с обеих красители, а также по-видимому суб-гаплоидных пик в левой части населения C. Этот последний пик было продемонстрировано, чтобы содержать сперматозоиды, которая появляется в виде отдельной, слабозагрязненного субпопуляции из-за их конденсированного состояния хроматина 12. Обратите внимание на нехватку мусора во всех графикой. Это особенно очевидно в 21 DPP (несовершеннолетних образцов) профилей, у которых нет сперматидах и сперматозоидов. Измененный Geisinger и Родригес Casuriaga, Cytogenet. Геном Res. 128, 46 (2010). Кликните здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 3. 4C клеточной популяции сортируются от яичек суспензии клеток взрослой крысы. Отсортированных клеток наносили на чистые поли-L-лизин-обработанные слайды и наблюдали под фазово-контрастной микроскопии (А) или светлого поля после Гимза окрашивания (B). Bar = 20 мкм. Воспроизводится по Geisinger и Родригес Casuriaga, Cytogenet. Геном Res. 128, 46 (2010).
tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
. Рисунок 4) FC анализ взрослого свинки яичек клеточной суспензии приготовленные с протоколом, описанным здесь (а), гистограмма;. (Б), точка участка. Обратите внимание на две подгруппы в популяции клеток 4C. Б) анализ отсортированных клеток от 4C R3 (A, B) и R4 (А ', В') областях. (А, а '), эпифлуоресцентной изображения микроскопа PI-окрашенных клеток . Обратите внимание, что ядер из области R3 сравнительно меньше. Бар: 10 мкм (B, B '), лазерной конфокальной микроскопии иммуноцитохимическое реакции на распространение клеток с использованием антител против Sycp3 (синаптонемных комплекс [SC] белка 3, боковая составляющая элемента).. Картина позволяет сделать вывод, что R3 фракция соответствует ранним (Lepto / зиготены) мейоцитов, в котором простые топоры и короткие отрезки СК можно видеть, в то время как R4 содержит пахитены мейоцитов, с COMполностью собранном СКС. Измененный Родригес Casuriaga и соавт., Цитометрии. 79, 625 (2011). Кликните здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 5. А) Электрофорез в агарозном геле общей РНК извлекается из сперматогенеза поток отсортированных фракций клетки 2C, R3 и R4 (объяснение на двух последних фракций на фиг.4). Клеточные суспензии были подготовлены с протоколом, описанным здесь. B) авторадиограмма денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле показывающий дифференциально кДНК полос, полученных с помощью "мРНК дифференциальный индикатор" способом (RNAimage; GenHunter Corporation, Nashville, TN) для одной из комбинаций праймеров из комплекта. мРНК из тех же трех популяций клеток, как и в
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптимизированный метод, описанный здесь позволяет получать суспензии клеток с грызунами ткани яичек в очень быстрым и воспроизводимым образом, избегая фермента и моющее средство лечения и поддержания хорошей целостности клеток и типа пропорции. Краткость процедуры (15 мин участок включает рассечение яичка, ткани резки и обработки), минимальной обработкой участие, и отсутствие ферментативного лечения являются одними из основных преимуществ. Все это могло бы объяснить и хорошая сохранность коротких макромолекул жизни, что особенно важно при репрезентативной выборке соединений, присутствующих в оригинальной популяции клеток требуется.
Что касается использования либо ИП или Hoechst 33342, мы не наблюдали никаких явных различий в профилях в результате анализа методом проточной цитометрии яичек клеточные суспензии с применением одной или другой краситель. Красителя, а выбор будет зависеть от предпочтений пользователя и возможностей, ио планируемых дальнейшего использования. С одной стороны, PI дешевле, а широкое применение, поскольку не требует использования потока цитометрии и сортировки имеющие УФ-лазера. С другой стороны, хотя мы успешно использовали PI-окрашенных клеток для скрытой сортировки и дифференциальной экспрессии генов исследований (рис. 4), Hoechst 33342 или другой витальным красителем с низким уровнем цитотоксичность может быть предпочтительным выбором для применений, где полный жизнеспособность клеток не требуется, такие как зародыш культуры клеток и / или трансплантацией 4.
Мы были в состоянии разобраться конкретных популяций клеток достижения более 95% чистоты либо для выбранной яичек населения с различным содержанием ДНК 4 (рис. 3), или даже для субпопуляции с тем же содержанием ДНК, но различных уровней конденсации хроматина (рис. 4). Этот последний может быть выполнена до тех пор, субпопуляций интерес, могут быть индивидуализированы в цитометрии профилей, раrticularly в точку участков. Например, до сих пор мы были в состоянии разобраться различных этапах морской свинки мейоцитов I 9, но не различать и сортировать субпопуляции среди населения 2C просто окрашиванием ДНК. Отсортированных клеток оказали РНК хорошего качества, Нижестоящие дифференциальной экспрессии генов анализов 9 (рис. 5).
Как можно видеть в описании протокола, очень простой, легко воспроизводимым, и не требует особенно квалифицированным персоналом. Мы считаем, что могут быть приняты для самых разнообразных приложений с проточной цитометрии или нет. Бывший варьируются от простых яичек контент-анализа для быстрой проверки сперматогенных заранее, к другим с препаративных целей как поток очистки определенных популяциях клеток для скрытого молекулярных исследований, как показано здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана CSIC (I + D проектом C022) и PEDECIBA. Авторы хочу поблагодарить Мариэле Bollati и Валентина Порро из отдела клеточной биологии (Institut Pasteur Монтевидео) за их щедрую о сотрудничестве сортировщика MoFlo ячейки, а Merial-Монтевидео мягко предоставляя все свинки образцы, используемые в этом проекте. Рисунок 1 была воспроизведена с разрешения BioMed Central; рисунках 2 и 3, а в таблице 1 с разрешения С. Karger AG, Базель, а 4 и 5 были воспроизведены или адаптированы с разрешения John Wiley & Sons, Inc (авторские права принадлежащие Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
