Summary
एंजाइमों और डिटर्जेंट से बचने कृंतक सामग्री से वृषण सेल निलंबन, के यांत्रिक तैयारी के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल में वर्णित है. विधि बहुत सरल, तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और प्रवाह छँटाई और शाही सेना निकासी के लिए उपयुक्त हैं, जो अच्छी गुणवत्ता सेल निलंबन, renders.
Abstract
स्तनधारी वृषण दैहिक वृषण कोशिकाओं और germline कोशिकाओं के विभिन्न चरणों सहित 30 से अधिक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं कि बहुत जटिल अंग हैं. इस विविधता शुक्राणु विकास के कुछ चरणों में शुद्ध या समृद्ध सेल आबादी सबसे आणविक विश्लेषण 1 के लिए आवश्यक हैं, के रूप में स्तनधारी शुक्राणुजनन के ठिकानों के अध्ययन के विषय में एक महत्वपूर्ण कमी है.
ऐसे Staput 2,3, केन्द्रापसारक धावन 1, और प्रवाह के रूप में विभिन्न रणनीतियों (एफसी) 4,5 अंतर जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए सक्षम करने के क्रम में समृद्ध या शुद्ध वृषण सेल आबादी प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है.
यह कोशिकाओं सबसे संवर्धन / शुद्धि दृष्टिकोण के लिए निलंबन में हैं कि आवश्यक है. आदर्श रूप में, सेल निलंबन मूल ऊतक के प्रतिनिधि होंगे, व्यवहार्य कोशिकाओं और कुछ multinucleates की एक उच्च अनुपात है - क्योंकि के रूप में करते हैं जोऔर कमी सेल clumps 1 - बीजदार उपकला 6,7 की syncytial प्रकृति. पिछली रिपोर्टों से एक विशेष रूप से यांत्रिक विधि से तैयार वृषण सेल निलंबन trypsinized वाले 1 से अधिक आसानी से clumped कि इसका सबूत था. RNases और / या trypsin और कुछ बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अवांछनीय है जो विशिष्ट अणुओं गिरावट, को collagenase नेतृत्व तरह disaggregating एंजाइमों के साथ दूसरी ओर, एंजाइमी उपचार. आदर्श प्रक्रिया ऐसी mRNAs के रूप में ब्याज के अणुओं का एक अच्छा संरक्षण प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में संभव के रूप में कम हो सकता है और न्यूनतम हेरफेर को शामिल करना चाहिए. ठोस ऊतकों से सेल निलंबन की तैयारी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल आमतौर पर समय लेने वाली है, अत्यधिक ऑपरेटर पर निर्भर हैं, और चुनिंदा कुछ सेल प्रकार 1,8 नुकसान हो सकता है.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक साथ एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अत्यंत संक्षिप्त यांत्रिक disaggregation के लाभों को जोड़ती हैप्रवाह cytometric विश्लेषण और छँटाई 4, और गुप्त जीन अभिव्यक्ति पढ़ाई 9 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अच्छी गुणवत्ता सेल निलंबन के लिए अग्रणी एंजाइमी उपचार के bsence,.
Protocol
1. सेल निलंबन की तैयारी
- ऐसे IACUC या समकक्ष के रूप में विशेष समितियों की सिफारिशों के बाद इस्तेमाल किया जा नमूना बलिदान (उरुग्वे, राष्ट्रीय आयोग में पशु प्रयोगों के लिए [CNEA]). हमारे मामले में, pentobarbital की एक ज्यादा administrated था.
- मानक अनुमोदित प्रक्रियाओं का पालन वृषण काटना और ठंडा DMEM के 10 मिलीलीटर युक्त, बर्फ पर एक 96 मिमी गिलास पेट्री डिश में उन्हें जगह 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक.
- आवरक झिल्ली धवल निकालें और 2 के चौकोर टुकड़ों में Decapsulated वृषण काट - प्रत्येक पक्ष पर 3 मिमी.
- उन टुकड़ों को फिर एक Medimachine, ऊतक एक छिद्रित स्टेनलेस स्टील स्क्रीन और एक धातु रोटर युक्त एक डिस्पोजेबल इकाई के अंदर disaggregated है जहां एक स्वचालित यांत्रिक चक्की में कार्रवाई कर रहे हैं. एक 50 माइक्रोन डिस्पोजेबल इकाई, disaggregator पर स्विच, और इस प्रक्रिया में इन टुकड़ों की 5 - ऐसा करने के लिए, ठंड की जगह 1 मिलीलीटर DMEM और 4 पूरक निर्माता से सरल निर्देशों का पालन 50 सेकंड के लिए.
- सुई के बिना 5 मिलीलीटर सिरिंज - एक 3 का उपयोग disaggregation इकाई से उत्पन्न सेल निलंबन की वसूली.
- 0.5 मिलीलीटर DMEM पूरक के साथ पहले से लथपथ एक 50 माइक्रोन नायलॉन जाल, के माध्यम से फ़िल्टर करें.
- एक लथपथ 25 माइक्रोन नायलॉन जाल, और बर्फ पर जगह का उपयोग कर फिर से निलंबन फ़िल्टर.
- एक Neubauer कक्ष में गणना और 1 के लिए सेलुलर एकाग्रता समायोजित - 2 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल पूरक DMEM के साथ. कम से कम 4 x 10 7 कोशिकाओं / वृषण सामग्री के ग्राम आमतौर पर प्राप्त कर रहे हैं.
- अंत में, सेल clumping को रोकने के क्रम में 0.2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए (2 naphthol-6, 8-disulfonic एसिड, Dipotassium नमक) राजग जोड़ें.
- वैकल्पिक: निर्माता के निर्देशों का पालन, पशु कोशिकाओं के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध व्यवहार्यता किट के साथ वृषण सेल निलंबन की सेल व्यवहार्यता की जांच.
2. प्रवाह cytometric विश्लेषण
ve_content "> हम propidium आयोडाइड की उच्च सांद्रता (पीआई) के साथ दाग कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए 488 एनएम पर फेंकना से परिचित एक सुसंगत आर्गन आयन लेजर से लैस एक बेक्टन, डिकिन्सन FACSVantage प्रवाह cytometer का इस्तेमाल किया है. (unfixed में गड़बड़ी प्रवेश द्वार के मुद्दे तनाव के तहत कोशिकाओं) कहीं 9,10 संबोधित किया गया है.- पीआई धुंधला के लिए, 50 सेल निलंबन को ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में fluorochrome जोड़ने, और 0 पर 10 मिनट ° अंधेरे में सी के लिए सेते हैं.
- लेजर बिजली 100 मेगावाट और एक 575/26 बैंड पास फिल्टर FL2 में गड़बड़ी उत्सर्जित प्रतिदीप्ति एकत्र करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए निर्धारित है.
- हम एक 70 माइक्रोन नोक साथ एफसी माप प्रदर्शन. Spermatocyte आबादी छँटाई के लिए, लिफाफा के रूप में 3 क्रमबद्ध बूंदों का उपयोग कर, सामान्य, आर या सामान्य सी में मोड छँटाई सेट. 3 में नमूना और संग्रह ट्यूब रखें - 4 डिग्री सेल्सियस एक प्रशीतन इकाई का उपयोग करके. प्रति सेकंड 1500 को 500 की दर से कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए नमूना अंतर को समायोजित करें.
- विश्लेषण करने CellQuest सॉफ्टवेयर (बी) का उपयोग करेंनिम्नलिखित मानकों: आगे तितर बितर (FSC द्वारा एच); ओर तितर बितर (एसएससी-एच); कुल उत्सर्जित प्रतिदीप्ति या नाड़ी क्षेत्र (FL2-ए), और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन या पल्स चौड़ाई (FL2-डब्ल्यू) की अवधि.
वैकल्पिक रूप से, हम 5 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण डाई Hoechst 33342 कार्यरत हैं और 37 पर 10 मिनट ° अंधेरे में सी के लिए incubated है. सेल विश्लेषण एक MoFlo cytometer (DakoCytomation) का अर्थ है 25 मेगावाट पर एक यूवी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य लेजर संचालन के साथ सुसज्जित है और एक 70 माइक्रोन नोक का उपयोग करके किया गया था. आंकड़ों में गड़बड़ी शिखर सम्मेलन v4.3 सॉफ्टवेयर (DakoCytomation) के साथ प्रदर्शन किया गया था.
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Representative Results
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के साथ तैयार चूहा वृषण से एक अच्छी तरह से disaggregated सेल निलंबन का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है.
एंजाइमी उपचार 6,8 करने के लिए और पहले से वर्णित यांत्रिक disaggregation तरीकों 2 की तुलना में, यहाँ प्रस्तुत एक (विशेष रूप से अन्य यांत्रिक की तुलना में बहुत तेजी से कम से निपटने शामिल है,, (नहीं ऑपरेटर पर निर्भर) आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और दुर्लभ सेल मलबे renders विधि) और बहुत कुछ multinucleates (व्यापक ऊतक हेरफेर 1,2 का एक परिणाम के रूप में करने के लिए फार्म में वर्णित किया गया है). इसके अलावा, एंजाइमी उपचार करने के लिए विरोध के रूप में, यह बड़े अणुओं गिरावट के पक्ष में हो सकता है कि RNases, trypsin और collagenase, के प्रयोग से बचा जाता है.
दूसरी ओर, हालांकि पिछली रिपोर्टों एक विशेष रूप से यांत्रिक विधि से तैयार वृषण सेल निलंबन पर trypsinized से अधिक आसानी से clumped कि इसका सबूत थातों 1, वर्तमान विधि के आवेदन चित्रा 1 में देखा जा सकता है के रूप में बहुत कम है, सेलुलर निलंबन में clumping गाया. इस संदर्भ में, हम सेल clumping को रोकने, और बाद में प्रवाह अध्ययन के दौरान clogging नोजल से बचने में राजग का समावेश बहुत ही कुशल पाया है. चित्रा 1 भी चित्रा 2 में दिखाया गया एफसी हिस्टोग्राम में भी स्पष्ट है जो सेल मलबे की कमी का पता चलता है.
इसके अलावा, इस विधि से तैयार सेल निलंबन अलग वृषण सेल प्रकार की एक पर्याप्त प्रतिनिधित्व दिखाते हैं. इस बीजदार tubules के पार वर्गों में कोशिकाओं की गिनती से रिपोर्ट डेटा के साथ यहाँ प्रस्तुत विधि द्वारा तैयार वृषण सेल निलंबन के सेलुलर संरचना की तुलना करके निष्कर्ष निकाला है, और सेल निलंबन के साथ ही अन्य तरीकों (1 टेबल) का उपयोग कर तैयार किया गया था.
एफसी हिस्टोग्राम prese द्वारा तैयार निलंबन के लिए प्राप्तNT के प्रोटोकॉल और Hoechst 33342 (2A चित्रा) या पीआई (चित्रा 2 बी) के साथ या तो दाग को काफी हद तक भी प्रक्रिया चुनिंदा किसी विशेष सेल प्रकार नुकसान नहीं है कि इस धारणा का समर्थन है, जैसा कि पहले बताया वाले 8 से अलग नहीं है.
| डीएनए सामग्री पर आधारित वृषण सेल प्रकार | अक्षत वृषण एक (%) | Medimachine - तैयार निलंबन ख (%) | एक (%) trypsinized निलंबन |
| ए) मुसलमानों मस्कुलस | |||
| सी | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ P> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| अन्य लोग | - | - | 4.6 |
| बी) Cavia porcellus | |||
| सी | 66.5 | 65.5 | एन / डी |
| 2C | 11.0 | 11.5 | एन / डी |
| 4C | 22.5 | 23.0 | एन / डी |
| एक सेल मायने रखता है अति सूक्ष्म अवलोकन द्वारा मूल्यांकन किया गया. ख सेल मायने रखता प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया. | |||
तालिका 1. माउस के लिए - - माउस (ए) और अक्षत वृषण और की तुलना में इसके द्वारा प्रस्तुत विधि द्वारा तैयार गिनी पिग (बी), से सेल निलंबन के लिए उनके डीएनए सामग्री में भिन्न वयस्क वृषण सेल आबादी के सापेक्ष प्रतिशत टी(Geisinger और Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet से संशोधित. जीनोम रेस. 128, 46 (2010)) ओ trypsin तैयार निलंबन. डीएनए सामग्री हैं: सी (गोल और elongating spermatids, शुक्राणु), -2 सी (वृषण दैहिक कोशिकाओं, spermatogonia, माध्यमिक spermatocytes), और 4C (प्राथमिक spermatocytes और G2 चरण में कुछ proliferating spermatogonia).
चित्रा 1. वर्तमान प्रोटोकॉल द्वारा तैयार और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना वयस्क चूहे वृषण से एक सेल निलंबन के आंशिक दृश्य. देखा जा सकता है, सेल cytoplasms अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं. बार 25 माइक्रोन से मेल खाती है. Rodríguez-Casuriaga, एट अल., बॉय से Reproduced. Proced. ऑनलाइन. 11, 184 (2009).
चित्रा 2. वयस्क चूहों, चूहों, गिनी सूअरों, और महत्वपूर्ण डाई Hoechst 33342 (ए) या पीआई के साथ (बी) के साथ दाग 21 दिन प्रसवोत्तर (डीपीपी) चूहे पिल्ले, से से वृषण सेल निलंबन के एफसी डीएनए सामग्री विश्लेषण. सभी मामलों में सी 2 सी और 4C सेल आबादी को आसानी से दोनों रंगों, साथ ही सी आबादी के बाईं ओर जाहिरा तौर पर उप अगुणित चोटी के साथ प्राप्त हिस्टोग्राम में बताया जा सकता है. यह बाद शिखर उनके गाढ़ा chromatin राज्य 12 के कारण एक अलग, कम दाग subpopulation के रूप में दिखाई देते हैं जो शुक्राणु होते हैं, के लिए प्रदर्शन किया गया है. सभी ग्राफिक्स में मलबे की कमी नोट. इस spermatids और शुक्राणु की कमी है जो 21 डीपीपी (किशोर नमूनों) प्रोफाइल, में विशेष रूप से स्पष्ट है. Geisinger और Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet से संशोधित. जीनोम रेस. 128, 46 (2010). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. 4C सेल आबादी वयस्क चूहे के एक वृषण सेल निलंबन से हल. छाँटे कोशिकाओं साफ पाली एल lysine का इलाज स्लाइड्स पर जमा और Giemsa धुंधला (बी) के बाद चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (ए) या उज्ज्वल क्षेत्र के तहत मनाया गया. बार = 20 माइक्रोन. Geisinger और Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet से Reproduced. जीनोम रेस. 128, 46 (2010).
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. प्रोटोकॉल के साथ तैयार एक वयस्क गिनी पिग वृषण सेल निलंबन की चित्रा 4 ए) एफसी विश्लेषण यहाँ वर्णित (एक), हिस्टोग्राम;. (ख), डॉट साजिश. 4C सेल आबादी में दो subpopulations ध्यान दें. क्रमबद्ध 4C R3 से कोशिकाओं (क, ख) और R4 (एक 'ख') क्षेत्रों की बी) विश्लेषण. (एक, एक '), के epifluorescence माइक्रोस्कोप छवियों गड़बड़ी से सना हुआ कोशिकाओं . आर 3 क्षेत्र से नाभिक अपेक्षाकृत छोटे होते हैं कि ध्यान दें. बार: 10 माइक्रोन (ख, ख '), Sycp3 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग प्रसार कोशिकाओं पर immunocytochemical प्रतिक्रियाओं की लेजर confocal माइक्रोस्कोपी (Synaptonemal जटिल [एससी] प्रोटीन 3, एक पार्श्व तत्व घटक).. R4 के pachytene meiocytes होता है जबकि तस्वीर कॉम के साथ, R3 के अंश सरल कुल्हाड़ियों और अनुसूचित जातियों की कम फैला देखा जा सकता है, जिसमें शीघ्र (पतला / zygotene) meiocytes, से मेल खाती है निष्कर्ष है कि अनुमति देता हैpletely जातियों को इकट्ठा किया. Rodríguez-Casuriaga, एट अल., Cytometry से संशोधित ए. 79, 625 (2011). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. Spermatogenic प्रवाह क्रमबद्ध कक्ष भिन्न -2 सी, R3 और R4 (दो उत्तरार्द्ध भिन्न पर स्पष्टीकरण चित्रा 4 में है) से निकाले कुल RNAs के ए) agarose जेल वैद्युतकणसंचलन. सेल निलंबन यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के साथ तैयार थे. एक denaturing की बी) Autoradiogram किट से प्राइमर संयोजनों में से एक के लिए, "mRNA के अंतर प्रदर्शन" विधि (GenHunter निगम, नैशविले, तमिलनाडु RNAimage) के माध्यम से प्राप्त अंतर सीडीएनए बैंड दिखा polyacrylamide वैद्युतकणसंचलन जेल. के रूप में ही तीन सेल आबादी से mRNAs
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Discussion
यहाँ वर्णित अनुकूलित विधि एंजाइम और डिटर्जेंट उपचार से बचने और अच्छा सेल अखंडता और प्रकार के अनुपात को बनाए रखने, एक बहुत तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में कृंतक वृषण ऊतक से सेल निलंबन की तैयारी के लिए सक्षम बनाता है. प्रक्रिया (15 मिनट अवधि वृषण विच्छेदन, ऊतक काटने, और प्रसंस्करण शामिल है), शामिल न्यूनतम हैंडलिंग, और एंजाइमी उपचार के अभाव की संक्षिप्तता मुख्य लाभ में से कुछ हैं. ये सभी मूल सेल आबादी में मौजूद यौगिकों का एक प्रतिनिधि नमूने की आवश्यकता है जब महत्वपूर्ण है जो छोटे जीवन अणुओं का अच्छा संरक्षण, के लिए खाते में जाएगा.
गड़बड़ी या Hoechst 33342 या तो के उपयोग के संबंध में, हम एक या अन्य डाई के रोजगार के साथ वृषण सेल निलंबन के प्रवाह cytometric विश्लेषण से उत्पन्न प्रोफाइल में कोई स्पष्ट अंतर देखा है. डाई पसंद बल्कि उपयोगकर्ता की वरीयताओं और availabilities पर निर्भर करती है, और होगायोजना के आगे उपयोग पर. एक तरफ, पीआई सस्ता है, और बड़े पैमाने पर आवेदन के रूप में प्रवाह cytometers और एक यूवी लेजर होने sorters के उपयोग की आवश्यकता नहीं है. दूसरी ओर, हम सफलतापूर्वक कम cytotoxicity स्तर के साथ गुप्त छंटाई और अंतर जीन अभिव्यक्ति अध्ययन (चित्रा 4), Hoechst 33342 या एक और महत्वपूर्ण डाई के लिए पीआई से सना हुआ कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, हालांकि, पूर्ण सेल व्यवहार्यता आवश्यक है जहां अनुप्रयोगों के लिए बेहतर विकल्प हो सकता है रोगाणु सेल संस्कृति और / या प्रत्यारोपण 4 के रूप में इस तरह के.
हम, या यहां तक कि एक ही डीएनए सामग्री लेकिन विभिन्न chromatin संक्षेपण स्तर (चित्रा 4) के साथ subpopulations के लिए अलग डीएनए सामग्री 4 (चित्रा 3) के साथ चयनित वृषण आबादी के लिए या तो 95% से अधिक शुद्धता को प्राप्त करने के लिए विशेष सेल आबादी को सॉर्ट करने में सक्षम है. ब्याज की subpopulations cytometric प्रोफाइल में व्यक्तिगत जा सकता है के रूप में यह बाद देहात, लंबे समय के रूप में पूरा किया जा सकता हैrticularly डॉट भूखंडों में. उदाहरण के लिए, अब तक हम गिनी पिग meiocytes मैं 9 के विभिन्न चरणों को सॉर्ट करने में सक्षम है, लेकिन बस डीएनए धुंधला करके -2 सी आबादी के भीतर subpopulations के भेदभाव और सॉर्ट करने के लिए नहीं. हल कोशिकाओं बहाव अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 9 (चित्रा 5) की अनुमति, अच्छी गुणवत्ता आरएनए प्रदान की गई है.
प्रोटोकॉल विवरण में देखा जा सकता है, यह आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बहुत सरल है, और विशेष रूप से कुशल कर्मियों की आवश्यकता नहीं है. हम यह प्रवाह cytometry या नहीं जुड़े अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए अपनाया जा सकता है पर विचार करें. spermatogenic अग्रिम की तेजी से जाँच के लिए सरल वृषण सामग्री विश्लेषण से, तैयारी के साथ दूसरों के लिए पूर्व रेंज यहाँ दिखाया गया है, इस तरह के गुप्त आणविक पढ़ाई के लिए विशेष सेल आबादी का प्रवाह शोधन के रूप में करना है.
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Acknowledgments
इस काम आंशिक रूप से CSIC (मैं + डी परियोजना C022) और PEDECIBA द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों धीरे इस परियोजना में इस्तेमाल गिनी पिग नमूने उपलब्ध कराने के लिए MoFlo सेल सॉर्टर, और Merial-मोंटेवीडियो के विषय में उनके उदार सहयोग के लिए सेल बायोलॉजी यूनिट (Institut पाश्चर डे मोंटेवीडियो) से Mariela Bollati और वेलेंटीना पोरो धन्यवाद देना चाहता हूँ. चित्रा 1 आंकड़े 2 और 3, और एस Karger एजी, बेसल की अनुमति के साथ तालिका 1, Biomed मध्य की अनुमति के साथ reproduced किया गया था और आंकड़े 4 और 5 जॉन विले एंड संस, इंक (के स्वामित्व कॉपीराइट की अनुमति के साथ reproduced या रूपांतरित किया गया विले- ब्लैकवेल, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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