Summary
Se describe un nuevo protocolo para la preparación mecánica de suspensiones de células testiculares de material de roedor, evitando enzimas y detergentes,. El método es muy simple, rápido, reproducible, y hace que las suspensiones de células de buena calidad, que son adecuados para la clasificación de flujo y la extracción de RNA.
Abstract
Testículos de mamíferos son órganos muy complejos que contienen más de 30 tipos diferentes de células, incluyendo las células somáticas testiculares y las diferentes etapas de las células germinales. Esta heterogeneidad es un inconveniente importante relación con el estudio de las bases de la espermatogénesis de mamíferos, ya que se necesitan poblaciones de células puros o enriquecidos en ciertas etapas del desarrollo de los espermatozoides para la mayoría de los análisis moleculares 1.
Varias estrategias tales como Staput 2,3, elutriación centrífuga 1, y citometría de flujo (FC) 4,5 se han empleado para obtener poblaciones de células testiculares enriquecidos o purificados con el fin de permitir a los estudios de expresión génica diferencial.
Se requiere que las células están en suspensión para la mayoría de los enfoques de enriquecimiento / purificación. Idealmente, la suspensión celular será representativo del tejido original, tienen una alta proporción de células viables y unos multinucleates - que tienden a formar debido a lasincitial naturaleza del epitelio seminífero 6,7 - y grupos de células falta 1. En informes anteriores habían evidenciado que las suspensiones de células testiculares preparados por un método exclusivamente mecánica agrupados más facilidad que las tratadas con tripsina 1. Por otra parte, los tratamientos enzimáticos con RNAsas y / o enzimas disgregantes como tripsina y la colagenasa conducen a la degradación de macromoléculas específica, lo cual es indeseable para ciertas aplicaciones industriales. El proceso ideal debe ser tan corta como sea posible e implicar un mínimo de manipulación, a fin de lograr una buena conservación de las macromoléculas de interés, tales como ARNm. Los protocolos actuales para la preparación de suspensiones de células de tejidos sólidos son por lo general mucho tiempo, altamente dependiente del operador, y pueden dañar selectivamente ciertos tipos de células 1,8.
El protocolo presentado aquí combina las ventajas de una desagregación mecánica altamente reproducible y extremadamente breve con la unabsence de tratamiento enzimático, que conduce a suspensiones de células de buena calidad que se pueden utilizar para análisis de citometría de flujo y clasificación 4, y ulteriores estudios de expresión génica 9.
Protocol
1. Preparación de las suspensiones celulares
- Sacrificar la muestra para ser utilizados siguiendo las recomendaciones de las comisiones especializadas como IACUC o equivalente (en Uruguay, la Comisión Nacional de Experimentación Animal [CNEA]). En nuestro caso, se administró una sobredosis de pentobarbital.
- Diseccionar los testículos siguientes procedimientos aprobados normales y colocarlos en un vaso de 96 mm de placa de Petri en hielo, que contiene 10 ml de DMEM enfriado con hielo suplementado con 10% de suero de ternera fetal.
- Retire la túnica albugínea y cortar los testículos descapsulados en trozos cuadrados de 2 a 3 mm en cada lado.
- Esas piezas se procesan entonces en un Medimachine, un molino mecánico automatizado donde el tejido se desagrega el interior de una unidad desechable que contiene una pantalla de acero inoxidable perforada y un rotor de metal. Para ello, colocar 1 ml de DMEM complementado fría y 4-5 de estas piezas en una unidad de 50 micras, desechable, encienda el disaggregator, y el proceso de para 50 seg siguiendo las instrucciones simples del fabricante.
- Recuperar la suspensión de células resultante de la unidad de desagregación usando un 3 - 5 de jeringa ml sin aguja.
- Filtrar con un 50 micras de malla de nylon, previamente remojadas con 0,5 ml DMEM suplementado.
- Se filtra la suspensión de nuevo con un empapado 25 micras de malla de nylon, y el lugar en el hielo.
- Contar en una cámara de Neubauer y ajustar la concentración celular a 1 - 2 x 10 7 células / ml con DMEM suplementado. Al menos 4 x 10 7 células / gramo de material testicular por lo general se obtiene.
- Por último, añadir NDA (2-naftol-6 ,8-disulfónico, sal dipotásica) a una concentración final de 0,2% con el fin de evitar la aglutinación de células.
- Opcional: comprobar la viabilidad celular de las suspensiones de células testiculares con un kit de viabilidad comercialmente disponible para las células animales, siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Análisis de citometría de flujo
ve_content "> Hemos utilizado un Becton-Dickinson FACSVantage citómetro de flujo equipado con un láser de iones de argón coherente sintonizado para emitir a 488 nm para el análisis de las células teñidas con altas concentraciones de yoduro de propidio (PI) (El tema de la entrada en PI no fijadas. Las células sometidas a estrés se ha abordado en otra parte 9,10).- Para la tinción PI, añadir fluorocromo a una concentración final de 50 mg / ml a la suspensión de células, y se incuba durante 10 min a 0 ° C en la oscuridad.
- La potencia del láser se ajusta a 100 mW y un filtro de paso de 575/26 banda se utiliza para recoger PI-la fluorescencia emitida en FL2.
- Realizamos mediciones de FC con una boquilla de 70 micras. Para ordenar las poblaciones spermatocyte, establezca el modo de clasificación en Normal o Normal-R-C, con 3 gotas clasificados como sobre. Mantenga la muestra y los tubos de recogida en 3 - 4 ° C mediante el uso de una unidad de refrigeración. Ajuste diferencial de la muestra a analizar las células a una velocidad de 500 a 1.500 por segundo.
- Utilice el software CellQuest (BD) para analizarlos siguientes parámetros: dispersión frontal (FSC-H); dispersión lateral (SSC-H); fluorescencia emitida o total de pulso-área (FL2-A), y la duración de la emisión de fluorescencia o de ancho de pulso (FL2-W).
Alternativamente, hemos empleado el colorante vital Hoechst 33342 a una concentración final de 5 g / ml y se incubaron durante 10 min a 37 ° C en la oscuridad. Análisis celular se realizó por medio de un citómetro MoFlo (DakoCytomation) equipados con una excitación de longitud de onda UV láser que opera a 25 mW y el uso de una boquilla de 70 micras. Manipulación de los datos se realizó con el software Summit v4.3 (Dako).
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Representative Results
Un ejemplo de una suspensión de células y desagregada de testículos de ratas preparadas con el protocolo descrito aquí se muestra en la Figura 1.
En comparación a los tratamientos enzimáticos 6,8 y para los métodos descritos anteriormente desagregación mecánica 2, la que se presenta aquí es mucho más rápido, implica menos manipulación, es fácilmente reproducible (no depende del operador), y hace que los desechos celulares escasos (especialmente en comparación con otros mecánicos métodos) y muy pocos multinucleates (que se han descrito para formar como consecuencia de la extensa manipulación de los tejidos 1,2). Por otra parte, frente a los tratamientos enzimáticos, que evita el uso de RNAsas, la tripsina y la colagenasa, que podrían favorecer la degradación de las macromoléculas.
Por otro lado, aunque los informes anteriores habían evidenciado que las suspensiones de células testiculares preparados por un método exclusivamente mecánica agrupados más fácilmente que con tripsina enes 1, la aplicación del presente método hace muy poca formación de grumos en las suspensiones celulares, como puede verse en la Figura 1. En ese sentido, hemos encontrado la inclusión de NDA muy eficiente en la prevención de formación de grumos de células, y evitar la obstrucción del inyector durante los estudios de flujo posteriores. Figura 1 también revela la escasez de restos de células, que también es evidente en los histogramas FC representados en la Figura 2.
Además, las suspensiones de células preparadas con este método muestran una representación adecuada de los diferentes tipos de células testiculares. Esto se concluyó mediante la comparación de la composición celular de las suspensiones de células testiculares preparados por el método que aquí se presenta con los datos presentados a partir de los recuentos de células en las secciones transversales de los túbulos seminíferos, y con suspensiones de células preparó usando otros métodos, así (Tabla 1).
FC histogramas obtenidos para suspensiones preparadas por la preseprotocolo nt y se tiñeron con Hoechst 33342 o bien (Figura 2A) o PI (Figura 2B) no difieren sustancialmente de los previamente reportados 8, que también apoya la suposición de que el procedimiento no daña selectivamente cualquier tipo de célula específica.
| Tipos de células testiculares basados en el contenido de ADN | Intacto un testículo (%) | Suspensiones preparadas b (%) - Medimachine | Suspensiones Trypsinized un (%) |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| Otros | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| un recuento de células se evaluó por observación microscópica. b Los recuentos de células se evaluaron por citometría de flujo. | |||
Tabla 1. Porcentajes relativos de las poblaciones de células testiculares en los adultos que difieren en su contenido de ADN para suspensiones de células de ratón (A) y conejillo de indias (B) preparado por el método que aquí se presenta, en comparación con testículos intactos y - para ratón - to suspensiones tripsina preparados (Modificado de Geisinger y Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res. genoma. 128, 46 (2010)). Contenido de ADN son: C (espermátidas redondas y elongación, espermatozoides), 2C (células somáticas testiculares, espermatogonias, espermatocitos secundarios) y 4C (espermatocitos primarios y algunos espermatogonias proliferan en la fase G2).
Figura 1. Vista parcial de una suspensión de células de testículo de rata adulta preparados por el presente protocolo y se visualizaron por microscopía de contraste de fase. Como puede verse, citoplasmas de células están bien conservados. La barra corresponde a 25 micras. Reproducido de Rodríguez-Casuriaga, et al., Biol.. Proced. . Línea 11, 184 (2009).
Figura 2. FC análisis de contenido de ADN de las suspensiones de células testiculares de ratas adultas, ratones, cobayas, y de 21 días posparto (DPP) crías de rata, se tiñeron con el colorante vital Hoechst 33342 (A) o con PI (B). En todos los casos poblaciones de células C, 2C y 4C pueden ser fácilmente dan a conocer en los histogramas obtenidos con ambos colorantes, así como el pico aparentemente sub-haploides a la izquierda de la población C. Este último pico se ha demostrado para contener los espermatozoides, que aparecen como una subpoblación separada, menos manchado debido a su estado de cromatina condensada 12. Tenga en cuenta la escasez de los desechos en todos los gráficos. Esto es especialmente evidente en el 21 dpp (ejemplares juveniles) perfiles, que carecen de espermátidas y espermatozoides. Modificado de Geisinger y Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res genoma. 128, 46 (2010). Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 3. Población de células 4C ordenadas a partir de una suspensión de células de testículo de rata adulta. Las células clasificadas se depositaron en portaobjetos de poli-L-lisina-tratadas limpias y se observaron bajo microscopía de contraste de fase (A) o de campo brillante después de la tinción de Giemsa (B). Bar = 20 micras. Reproducido de Geisinger y Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res genoma. 128, 46 (2010).
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. Figura 4 A) FC análisis de un conejillo de indias suspensión de células de testículo adulto preparado con el protocolo descrito aquí (a), histograma;. (B), gráfico de puntos. Tenga en cuenta que las dos subpoblaciones en la población celular 4C. B) Análisis de células clasificadas de 4C R3 (a, b) y R4 (a ', b') regiones (a, a ')., Imágenes de microscopio de epifluorescencia de células teñidas con PI . Tenga en cuenta que los núcleos de la región R3 son comparativamente más pequeño. Bar: 10 m (b, b '), láser de microscopía confocal de reacciones inmuno sobre células propagadas utilizando un anticuerpo contra SYCP3 (complejo Sinaptonémico [SC] proteína 3, un componente del elemento lateral).. La imagen permite concluir que la fracción R3 corresponde a meiocytes temprana (lepto / zygotene), en la que los ejes simples y tramos cortos de las SC se pueden ver, mientras que R4 contiene meiocytes pachytene, con comcompletamente montado SC. Modificado de Rodríguez-Casuriaga, et al., Citometría A. 79, 625 (2011). Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 5. A) electroforesis en gel de agarosa de los ARN totales extraídos de espermatogénica de flujo ordenados-fracciones de células 2C, R3 y R4 (explicación en las dos últimas fracciones se encuentra en la Figura 4). Las suspensiones celulares se prepararon con el protocolo descrito aquí. B) Autorradiograma de un desnaturalizante electroforesis en gel de poliacrilamida que muestra diferenciales bandas de ADNc obtenidos por medio del método "diferencial de mRNA pantalla" (RNAimage; GenHunter Corporation, Nashville, TN) para una de las combinaciones de cebadores del kit. mRNAs de los mismos tres poblaciones de células como en
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Discussion
El método optimizado descrito aquí permite la preparación de suspensiones de células a partir de tejido testicular roedor de una manera muy rápida y reproducible, evitando enzima y detergente tratamiento y mantener una buena integridad de la célula y las proporciones de tipo. La brevedad del procedimiento (el lapso de 15 min incluye disección testículo, corte de tejido, y el procesamiento), la manipulación mínimos correspondientes, y la ausencia de tratamientos enzimáticos son algunas de las principales ventajas. Todos estos podrían dar cuenta de la buena conservación de las macromoléculas de vida cortos, lo cual es crítico cuando se requiere una muestra representativa de los compuestos presentes en la población original de células.
En cuanto a la utilización de cualquiera de PI o Hoechst 33342, hemos observado diferencias evidentes en los perfiles resultantes de análisis de citometría de flujo de suspensiones de células testiculares con el empleo de uno u otro colorante. La elección tinte en lugar dependerá de las preferencias del usuario y la disponibilidad, yen uso más planificada. Por un lado, el PI es más barato, y de aplicación generalizada como no requiere el uso de citómetros de flujo y clasificadores que tienen un láser UV. Por otro lado, aunque hemos utilizado con éxito células teñidas con PI para la clasificación ulterior y estudios de expresión diferencial de genes (Figura 4), Hoechst 33342 u otro colorante vital con bajos niveles de citotoxicidad podrían ser las opciones preferibles para aplicaciones donde se requiere la viabilidad celular completo, como el cultivo de células germinales y / o trasplante de 4.
Hemos sido capaces de clasificar poblaciones de células específicas logro de más del 95% de pureza o bien para las poblaciones seleccionadas testiculares con diferente contenido de ADN 4 (Figura 3), o incluso para subpoblaciones con el mismo contenido de ADN, pero diferentes niveles de condensación de la cromatina (Figura 4). Este último se puede lograr siempre que las subpoblaciones de interés pueden ser individualizados en los perfiles de citometría, PArticularly en los gráficos de puntos. Por ejemplo, hasta ahora hemos sido capaces de resolver las diferentes etapas de conejillo de indias meiocytes I 9, pero no discriminar y clasificar las subpoblaciones dentro de la población 2C simplemente tiñendo el ADN. Las células clasificadas han rendido buenos ARN de calidad, lo que permite posteriores análisis de expresión diferencial de genes 9 (Figura 5).
Como puede verse en la descripción del protocolo, que es muy simple, fácilmente reproducible, y no requiere personal especialmente cualificado. Consideramos que puede ser adoptada para una amplia variedad de aplicaciones que implican citometría de flujo o no. La primera gama de análisis de contenido testicular simple para el control rápido de avance espermatogénesis, a otros con preparativa pretende, como la purificación del flujo de poblaciones celulares específicas para los estudios moleculares ulteriores, como se muestra aquí.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por el CSIC (I + D del proyecto C022) y PEDECIBA. Los autores desean agradecer a Mariela Bollati y Valentina Porro de la Unidad de Biología Celular (Institut Pasteur de Montevideo) por su generosa colaboración relativo a la clasificación de células MoFlo y Merial-Montevideo para proporcionar gentilmente todos los ejemplares de cuyes utilizados en este proyecto. Figura 1 se reproducen con autorización de BioMed Central, las figuras 2 y 3, y en la Tabla 1 con el permiso de S. Karger AG, Basilea, y las figuras 4 y 5 fueron reproducidas o adaptadas con permiso de John Wiley & Sons, Inc (copyright propiedad de Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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