Summary
Un nuovo protocollo per la preparazione meccanica di sospensioni di cellule testicolari di materiale roditore, evitando enzimi e detergenti, è descritto. Il metodo è molto semplice, veloce, riproducibile, e rende sospensioni cellulari di buona qualità, che sono adatti per il flusso di smistamento e l'estrazione di RNA.
Abstract
Testicoli di mammiferi sono organi molto complessi che contengono più di 30 diversi tipi di cellule, tra cui le cellule somatiche testicolari e le diverse fasi di cellule germinali. Questa eterogeneità è un importante svantaggio riguarda lo studio delle basi della spermatogenesi mammiferi, poiché sono necessari popolazioni pure o arricchito di cellule in determinate fasi dello sviluppo sperma per la maggior parte delle analisi molecolari 1.
Strategie diverse quali Staput 2,3, elutriazione centrifuga 1, e citometria a flusso (FC) 4,5 sono stati impiegati per ottenere popolazioni di cellule testicolari arricchiti o purificata per consentire studi di espressione genica differenziale.
E 'necessario che le celle siano in sospensione per la maggior parte degli approcci arricchimento / purificazione. Idealmente, la sospensione cellulare sarà rappresentativo del tessuto originale, hanno una elevata percentuale di cellule vitali e poche multinucleates - che tendono a formare a causa dellanatura sinciziale dell'epitelio seminifero 6,7 - e grumi di cellule mancanza 1. I rapporti precedenti hanno evidenziato che le sospensioni di cellule testicolari preparati da un metodo esclusivamente meccanico aggregata più facilmente di quelli trypsinized 1. D'altra parte, trattamenti enzimatici con RNasi e / o disaggregazione enzimi come tripsina e collagenasi porterebbe al degrado macromolecole specifico, che è indesiderabile per determinate applicazioni a valle. Il processo ideale dovrebbe essere il più breve possibile e coinvolgere manipolazione minima, in modo da realizzare una buona conservazione delle macromolecole di interesse come mRNA. Protocolli attuali per la preparazione di sospensioni cellulari da tessuti solidi sono solitamente richiede tempo, fortemente operatore-dipendente, e possono danneggiare selettivamente alcuni tipi di cellule 1,8.
Il protocollo presentato qui combina i vantaggi di una disaggregazione meccanica altamente riproducibile ed estremamente breve con l'unabsence di trattamento enzimatico, portando a sospensioni cellulari di buona qualità che possono essere usati per l'analisi di citometria di flusso e di smistamento 4, e ulteriori studi di espressione genica 9.
Protocol
1. Preparazione delle sospensioni cellulari
- Sacrifica il campione da utilizzare secondo le raccomandazioni delle commissioni specializzate, come IACUC o equivalente (in Uruguay, Commissione nazionale per la sperimentazione animale [CNEA]). Nel nostro caso, una overdose di pentobarbital è stato somministrato.
- Sezionare i testicoli seguenti procedure approvate standard e metterli in un bicchiere Petri 96 millimetri sul ghiaccio, contenente 10 ml di ghiacciata DMEM supplementato con siero fetale di vitello al 10%.
- Rimuovere la tunica albuginea e tagliare i testicoli decapsulati in pezzi quadrati di 2-3 mm su ogni lato.
- Quei pezzi vengono poi trattati in un Medimachine, un macinino meccanico automatizzato in cui il tessuto è disaggregato all'interno di una unità monouso contenente uno schermo di acciaio inossidabile perforato e un rotore metallo. Per fare ciò, posto 1 ml di DMEM integrato freddo e 4-5 di questi pezzi in una unità di 50 micron e getta, interruttore sul disaggregator, e il processo di per 50 sec seguendo le semplici istruzioni del produttore.
- Recuperare la sospensione risultante cellula dall'unità utilizzando una disaggregazione 3-5 ml siringa senza ago.
- Filtrare su un 50 micron nylon mesh, precedentemente ammollato con 0,5 ml DMEM integrato.
- Filtrare nuovamente la sospensione con una inzuppato 25 micron nylon mesh, e posto sul ghiaccio.
- Contare in una camera di Neubauer e regolare la concentrazione cellulare di 1-2 x 10 7 cellule / ml con DMEM integrato. Almeno 4 x 10 7 cellule / grammo di materiale testicolo sono solitamente ottenuti.
- Infine, aggiungere NDA (2-naftolo-6 ,8-disolfonico acido, sale dipotassico) ad una concentrazione finale di 0,2%, al fine di evitare grumi cella.
- Optional: verificare la vitalità cellulare delle sospensioni di cellule testicolari con un kit disponibile in commercio per la vitalità delle cellule animali, seguendo le istruzioni del produttore.
2. Mediante citometria a flusso
ve_content "> Abbiamo utilizzato un Becton-Dickinson FACSVantage citofluorimetro dotato di un laser a ioni argon Coherent sintonizzati per emettere a 488 nm per l'analisi di cellule colorate con elevate concentrazioni di ioduro di propidio (PI). (La questione di ingresso PI in unfixed cellule sotto stress è stato affrontato altrove 9,10).- Per PI colorazione, aggiungere fluorocromo ad una concentrazione finale di 50 mg / ml di sospensione cellulare, e incubare per 10 min a 0 ° C al buio.
- Potenza del laser è impostato a 100 mW e un filtro passa-banda 575/26 viene utilizzato per raccogliere PI-emessa fluorescenza in FL2.
- Eseguiamo misurazioni FC con un ugello di 70 micron. Per l'ordinamento popolazioni spermatociti, impostare la modalità di ordinamento in Normal-R o Normal-C, con 3 gocce classificate come busta. Mantenere campione e tubi di raccolta a 3 - 4 ° C utilizzando una unità di refrigerazione. Regolare differenziale campione da analizzare le cellule ad una velocità di 500 a 1500 per secondo.
- Utilizzare software CellQuest (BD) per analizzarei seguenti parametri: forward scatter (FSC-H); side scatter (SSC-H); fluorescenza totale emessa o impulso-zona (FL2-A), e la durata di emissione di fluorescenza o di larghezza di impulso (FL2-W).
Alternativamente, abbiamo impiegato il colorante vitale Hoechst 33342 per una concentrazione finale di 5 pg / ml e incubate per 10 min a 37 ° C al buio. Analisi delle cellule è stata eseguita mediante un citometro MoFlo (Dako) provvisti di eccitazione UV di lunghezza d'onda del laser funzionante a 25 mW e utilizzando un ugello di 70 micron. Manipolazione dei dati è stata effettuata con il software Summit v4.3 (Dako).
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Representative Results
Un esempio di una sospensione cellulare ben disaggregata da testicoli di ratto preparate con il protocollo qui descritto è mostrato in Figura 1.
In confronto ai trattamenti enzimatici 6,8 e precedentemente descritti metodi di disaggregazione meccanici 2, quello qui presentato è molto più veloce, comporta meno manipolazione, è facilmente riproducibile (non operatore-dipendente), e rende detriti cellulari scarsi (soprattutto rispetto ad altri meccanico metodi) e pochissime multinucleates (che sono stati descritti a formare come conseguenza della vasta manipolazione dei tessuti 1,2). Inoltre, al contrario di trattamenti enzimatici, evita l'uso di RNasi, tripsina e collagenasi, che potrebbero favorire macromolecole degradazione.
D'altra parte, anche se i rapporti precedenti avevano evidenziato che sospensioni di cellule testicolari preparati da un metodo esclusivamente meccanico clumped più facilmente di trypsinized sullaes 1, l'applicazione del presente metodo reso molto poco aggregazione nelle sospensioni cellulari, come visibile in figura 1. In questo senso, abbiamo trovato l'inclusione di NDA molto efficace nella prevenzione di aggregazione delle cellule, ed evitando l'intasamento dell'ugello durante successivi studi di flusso. Figura 1 rivela anche la scarsità di detriti cellulari, che è anche evidente negli istogrammi FC rappresentati in Figura 2.
Inoltre, sospensioni cellulari preparate con questo metodo mostrano una rappresentazione adeguata dei diversi tipi di cellule testicolari. Questo è stato concluso confrontando la composizione cellulare delle sospensioni cellulari testicolari preparato con il metodo qui presentato con i dati riportati da conteggi delle cellule nelle sezioni trasversali di tubuli seminiferi, e con sospensioni cellulari preparato utilizzando altri metodi e (Tabella 1).
FC istogrammi ottenuti per le sospensioni preparate dalla Preseprotocollo nt e colorate sia con Hoechst 33342 (Figura 2A) o PI (Figura 2B) non differiscono sostanzialmente da quelli precedentemente riportati 8, sostenendo anche l'ipotesi che la procedura non danneggia selettivamente ogni specifico tipo cellulare.
| Tipi di cellule testicolari in base al contenuto di DNA | Testicolo intatto a (%) | Sospensioni preparate b (%) - Medimachine | Sospensioni tripsinizzate a (%) |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17.9 | 18,7 | 8.7 |
| Altri | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| una cella conteggi sono stati valutati mediante osservazione microscopica. cellule B conteggi sono stati valutati mediante citometria a flusso. | |||
Tabella 1. Relative percentuali di adulti popolazioni di cellule testicolari che differiscono per il loro contenuto di DNA per sospensioni cellulari da topo (A) e di cavia (B), preparato con il metodo dichiara presentato, rispetto ai testicoli intatti e - per mouse - to sospensioni tripsina-preparati (modificato da Geisinger e Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res.. 128, 46 (2010)). Contenuto di DNA sono: C (spermatidi rotondi e allungamento, spermatozoi), 2C (cellule testicolari somatiche, spermatogoni, spermatociti secondari), e 4C (spermatociti primari e pochi spermatogoni proliferante in fase G2).
Figura 1. Vista parziale di una sospensione cellulare di testicolo di ratto adulto preparati dal presente protocollo e visualizzata da contrasto di fase. Come si vede, cytoplasms cellulari sono ben conservate. La barra corrisponde a 25 micron. Tratto da Rodríguez-Casuriaga, et al., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).
Figura 2. FC DNA analisi del contenuto delle sospensioni di cellule testicolari di ratti adulti, topi, porcellini d'India, e da 21 giorni dopo il parto (dpp) cuccioli di ratto, colorati con il colorante vitale Hoechst 33342 (A) o con PI (B). In tutti i casi popolazioni cellulari C, 2C e 4C possono essere facilmente rivelati negli istogrammi ottenuti con entrambi i coloranti, così come il picco apparentemente sub-aploide alla sinistra della popolazione C. Quest'ultimo picco è stato dimostrato per contenere gli spermatozoi, che appaiono come, sottopopolazione meno macchiato separato a causa del loro stato di cromatina condensata 12. Notare la scarsità di detriti in tutte le grafiche. Ciò è particolarmente evidente nel 21 dpp (esemplari giovani) profili, che mancano spermatidi e spermatozoi. Modificato da Geisinger e Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010). Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Popolazione cellulare 4C ordinati da una sospensione di cellule testicolari di ratto adulto. Cellule ordinati sono stati depositati su vetrini poli-L-lisina-trattati puliti ed osservati al microscopio a contrasto di fase (A) o in campo chiaro dopo Giemsa (B). Bar = 20 micron. Riprodotto da Geisinger e Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010).
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. Figura 4 A) FC analisi di una cavia sospensione cellulare testicolare adulta preparato con il protocollo qui descritto (a), istogramma;. (B), dot plot. Notare le due sottopopolazioni nella popolazione di cellule 4C. B) Analisi di cellule ordinati da R3 4C (a, b) e R4 (a ', b') le regioni. (A, a '), le immagini microscopio a epifluorescenza di cellule PI macchiato . Si noti che i nuclei da regione R3 sono relativamente più piccole. Bar: 10 micron (B, B '), laser confocale microscopia di reazioni immunocitochimiche su cellule diffusione, utilizzando un anticorpo contro Sycp3 (complesso synaptonemal [SC] proteina 3, un componente elemento laterale).. L'immagine permette di concludere che frazione R3 corrisponde ai primi (lepto / zigotene) meiocytes, in cui gli assi semplici e brevi tratti della SCS possono essere visti, mentre R4 contiene meiocytes pachitene, con comSC completamente assemblato. Modificato da Rodríguez-Casuriaga, et al., Citometria a. 79, 625 (2011). Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 5. A) agarosio gel elettroforesi di RNA totale estratto da spermatogenic-ordinati flusso frazioni cellulari 2C, R3 e R4 (spiegazione sulle due ultime frazioni è in Figura 4). Sospensioni cellulari sono state preparate con il protocollo descritto qui. B) autoradiogram di una denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide mostrando differenziali bande cDNA ottenuti per mezzo del "mRNA differential display" metodo (RNAimage; GenHunter Corporation, Nashville, TN) per una delle combinazioni di primer dal kit. mRNA degli stessi tre popolazioni cellulari come nella
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Discussion
Il metodo qui descritto ottimizzato consente la preparazione di sospensioni di cellule da tessuto testicolare roditore in modo molto veloce e riproducibile, evitando enzima e detersivo trattamento e mantenere una buona integrità delle cellule e di tipo proporzioni. La brevità della procedura (il minimo campata 15 include la dissezione testicolo, il taglio dei tessuti, e la lavorazione), una minima manipolazione coinvolto, e l'assenza di trattamenti enzimatici sono alcuni dei principali vantaggi. Tutti questi sarebbe spiegare la buona conservazione di brevi macromolecole vita, che è critica quando è richiesto un campione rappresentativo di composti presenti nella popolazione cella originale.
Concernente l'uso sia PI o Hoechst 33342, abbiamo osservato alcun evidenti differenze nei profili risultanti da analisi citofluorimetrica delle sospensioni di cellule testicolari con l'impiego di uno o l'altro colorante. La scelta colorante sarà piuttosto dipenderà preferenze dell'utente e le disponibilità, esull'ulteriore uso previsto. Da un lato, PI è più economico, e di applicazione diffusa come non richiede l'uso di citofluorimetri e la cernita aventi un laser UV. Dall'altro, anche se abbiamo usato con successo cellule PI macchiati per ulteriore cernita e studi di espressione genica differenziale (Figura 4), Hoechst 33342 o altro colorante vitale con livelli di citotossicità bassi potrebbero essere le scelte preferibili per applicazioni in cui è richiesta la vitalità cellulare completo, come coltura di cellule germinali e / o trapianto 4.
Siamo stati in grado di risolvere specifiche popolazioni cellulari ottenendo oltre il 95% di purezza o di popolazioni selezionate testicolari con contenuto di DNA differenti 4 (figura 3), o anche per sottopopolazioni con lo stesso contenuto di DNA ma diversi livelli di condensazione della cromatina (Figura 4). Quest'ultimo può essere realizzato fintanto che le sottopopolazioni di interesse possono essere personalizzati nei profili citometria, particularly nelle trame dot. Per esempio, fino ad ora siamo stati in grado di ordinare le diverse fasi della cavia meiocytes I 9, ma non discriminare e ordinare sottopopolazioni all'interno della popolazione 2C semplicemente dalla colorazione del DNA. Cellule separate hanno reso RNA di buona qualità, permettendo a valle differenziali analisi di espressione genica 9 (Figura 5).
Come si può vedere nella descrizione di protocollo, è molto semplice, facilmente riproducibile, e non richiede personale particolarmente qualificato. Riteniamo che può essere adottato per un'ampia varietà di applicazioni che coinvolgono citometria di flusso o non. Il primo vanno dalla semplice analisi del contenuto dei testicoli per il controllo rapido di anticipo spermatogenesi, ad altri con preparativo mira come il flusso di purificazione di popolazioni cellulari specifiche per studi molecolari fini, come mostrato qui.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal CSIC (I + D progetto C022) e PEDECIBA. Gli autori desiderano ringraziare Mariela Bollati e Valentina Porro dall'Unità Biologia Cellulare (Institut Pasteur de Montevideo) per la loro generosa collaborazione concernente il cell sorter MoFlo e Merial-Montevideo per fornire delicatamente tutti gli esemplari cavia utilizzati in questo progetto. Figura 1 è stato riprodotto con il permesso di BioMed Central, figure 2 e 3, e la Tabella 1 con il permesso di S. Karger AG, Basilea, e figure 4 e 5 sono stati riprodotti o adattati con il permesso di John Wiley & Sons, Inc (copyright di proprietà di Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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