Summary
Kv canal disfunción se asocia con arritmias cardíacas. Con el fin de estudiar los mecanismos moleculares que conducen a tales arritmias que utilizan un protocolo sistemático para el aislamiento de cardiomiocitos auriculares y ventriculares de Kv de canal ratones knockout auxiliares de subunidades. Cardiomiocitos aislados a continuación, puede ser utilizado inmediatamente para estudios electrofisiológicos celulares, bioquímicos o inmunofluorescencia (IF) ensayos.
Abstract
KCNE genes codifican para una pequeña familia de canales Kv subunidades auxiliares que forman complejos con heteroméricos Kv canal subunidades alfa para modificar sus propiedades funcionales. Las mutaciones en los genes de KCNE se han encontrado en pacientes con arritmias cardiacas tales como el síndrome de QT largo y / o la fibrilación auricular. Sin embargo, la fisiopatología precisa molecular que conduce a estas enfermedades sigue siendo difícil de alcanzar. En estudios previos de las propiedades electrofisiológicas de la enfermedad que causa mutaciones en estos genes han sido estudiados principalmente en sistemas de expresión heterólogos y no podemos estar seguros de si los efectos reportados directamente se puede traducir en cardiomiocitos nativos. En nuestro laboratorio, por lo tanto, utilizar un enfoque diferente. Nuestros estudiar los efectos de la supresión de genes KCNE en cardiomiocitos aislados de los ratones knockout de electrofisiología celular - una técnica única que se describe en este número de la Revista de experimentos visualizados. Los corazones de la geneticaLLY diseñaron ratones KCNE se extirparon rápidamente y se montaron en un aparato Langendorff por canulación aórtica. Gratis Ca 2 + en el miocardio está obligado por EGTA, y la disociación de los miocitos cardíacos se consigue después de una perfusión retrógrada de las arterias coronarias con un especializado bajo Ca 2 + que contiene tampón de colagenasa. Atria, la pared libre del ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo se puede separar por técnicas de microcirugía. El calcio se añade entonces lentamente de nuevo a cardiomiocitos aislados en un paso múltiple que comprende procedimiento de lavado. Cardiomiocitos auriculares y ventriculares de apariencia sana sin contracciones espontáneas son entonces inmediatamente se sometió a análisis electrofisiológicos mediante la técnica de patch clamp o otros análisis bioquímicos dentro de las primeras 6 horas después del aislamiento.
Protocol
1. Animal Anestesia y sustracción de órganos
- Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (ip) de inyección de ketamina (200 mg / kg de peso corporal) y xilazina (20 mg / kg BW).
- Para anticoagular inyectar ip 250 UI de heparina para evitar la formación de trombos y coágulos sanguíneos.
- Esperar hasta que la narcosis se alcanza, que se caracteriza por arreflexia. Para comprobar si hay prueba de reflejo arreflexia corneal tocando suavemente la córnea o el reflejo vuelo de prueba de pellizco cola.
- Transferir el ratón sobre mesa de operaciones y fijarlo en posición supina.
- Incisión de la piel y la pared abdominal por debajo del apéndice xifoides y realizar una toracotomía clamshell: Extender el corte a lo largo de ambos lados del arco costal y posteriormente cortar las costillas en la línea axilar media, desviar hacia arriba la caja torácica.
- Abra pericardio, localizar los grandes vasos. Presione suavemente caudal corazón para mostrar mejor la aorta. Sujete la aorta utilizando fórceps.
- Colocar el corazón en la concavidad de un par de s cissors y diseccionar todos los barcos que conectan con un solo corte. Asegúrese de preservar una parte suficientemente grande de la aorta ascendente para la canulación de Langendorff.
- Transferir corazón extirpados inmediatamente a una placa de Petri llena de hielo frío y pre-oxigenada solución 1 (para soluciones, véase la Tabla 1).
2. Preparación de perfusión del corazón y Langendorff
- Canular la aorta con una cánula de acero 1.8F. Asegúrese de evitar una embolia gaseosa.
- Fije aorta en la cánula con una sutura quirúrgica y coronarias ras con 1 ml de solución 1.
- Conectar la cánula con un aparato Langendorff.
- Asegúrese de que el tiempo de toracotomía de la canulación Langendorff no exceda de 120 segundos para evitar extendida por isquemia / reperfusión en el miocardio.
- Corazón perfundir con 10 ml de Ca 2 + libre solución 2 (4 ml / min).
- Corazón perfundir con solución de colagenasa 3 de 8 min (4 ml / min).
- Transferencia de corazón en una pre-calentado 100-mm placa de Petri que contiene bajo Ca 2 + solución 4.
- Retire con cuidado la aorta y otros no-tejido cardíaco con unas tijeras y lo descarta.
- Aurículas y los ventrículos separados y continuar con cada cámara por separado. Mantener las células sumergidas en solución 4. Utilizar volúmenes pequeños (menos de 5 ml).
4. Disociación Además de los cardiomiocitos
- Cardiomiocitos auriculares:
- Para individualizar miocitos auriculares transferir las aurículas en un aparte precalentado placa de cultivo de 100 mm y disociar el tejido a través de él con cuidado separando con unas pinzas finas. Asegurar una disociación casi completa del tejido.
- Usar una pipeta de 1 ml con una vista ampliada pulida al fuego punta de pipeta de plástico para suspender las células en 1 ml de solución de 5 por 5 min.
- Se separan las células de los desechos mediante el uso de un filtro celular (200 micras de malla). <li> Añadir 5 ml de solución 5 a la suspensión de células y se centrifuga durante 2 min a 16 xg a la temperatura ambiente.
- Los siguientes pasos se hacen funcionar bajo una campana de cultivo de células. Eliminar el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 5 ml de solución 6.
- Después de la sedimentación por gravedad durante 10 min en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 1 min a 16 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante. Volver a suspender las células en función de su cantidad en 1-5 ml de solución 6.
- Diseccionar la región ventricular izquierda de interés con unas pinzas finas en 5 ml de solución 4.
- Suspender las células pipeteando suavemente hasta que la mayoría de las células se separan. Transferir la solución de células después de la filtración (200 micras de malla) en un tubo de 50 ml, añadir un volumen de 25 ml.
- Centrifugar durante 2 min a 16 xg a la temperatura ambiente.
- Los siguientes pasos se hacen funcionar bajo una campana de cultivo de células. Remover el sobrenadante, resuspender el precipitado en 25 ml desolución de 6 y permitir la sedimentación de las células durante 10 min.
- Contar las células y eliminar el sobrenadante, añadir 25 a 50 ml de solución 6 en las células.
5. Preparación de cardiomiocitos de Electrofisiología Celular, Bioquímica o si los estudios
- Para los estudios de electrofisiología, mantener los miocitos en solución en un tubo de 6 ml y 50 inhiben la sedimentación.
- Para los estudios bioquímicos, formación de imágenes por ejemplo, calcio, miocitos placa sobre laminina plato recubierto cultivo de células (concentración final 20 mg / ml de laminina en PBS).
- Para la tinción de inmunofluorescencia preparar un cultivo de células placa plato con cubreobjetos de vidrio y recubierto con una solución de laminina (concentración final 50 mg / ml de laminina en PBS).
- Retire la solución antes de miocitos galvanoplastia. Placa de las células y controlar la densidad de las células utilizando un microscopio.
- Deje que los miocitos se adhieren a cubreobjetos durante 1 hora a 37 ° C en 2% de CO 2, eliminar la solucióny comenzar inmediatamente con un protocolo de tinción procedimiento estándar.
- Incubar con fijador, por ejemplo, 4% de PFA en PBS (pH 7,5) durante 10 min a temperatura ambiente y sigue con tres pasos de lavado con PBS durante 5 min cada uno.
- Para permeabilizar las células y de inhibir la unión de anticuerpos inespecíficos incubar los miocitos con 10% de suero, 0,3% de Triton, 0,2% de BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar con el anticuerpo primario durante 1 hora a 37 ° C y se lavan como se ha descrito antes.
- Se incuba con el anticuerpo secundario durante 1 hr a temperatura ambiente. Para contrateñir los núcleos y α-actinina uso DAPI y phalloidin fluorocromo conjugado (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
- Después del lavado, transferir la cubierta de cristal se desliza con cuidado en silano portaobjetos tratados y las células incrustar en medio de fluorescencia de montaje.
6. Electrofisiología Celular
- Realizar Plenario de células patch-clamp grabaciones en frecuenciashly aislado cardiomiocitos auriculares y ventriculares a temperatura ambiente.
- Transferir sanos cardiomiocitos que aparecen en la cámara de perfusión llena con un volumen definido de la solución de baño extracelular. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM de MgCl 2, 3 mM CoCl 2, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM, y 0,02 mM de tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Utilice NaOH para ajustar el pH de valor.
- Utilice el equipo de patch clamp (es decir IX71 microscopio invertido, un amplificador 700B MultiClamp, un sistema Digidata 1440A adquisición y PC con pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
- Usar pipetas de patch con resistencias de 3-5 mW cuando se llena con una solución intracelular contenía 130 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2 GTP, 5 mM Na 2 CP y 4,9 mM CaCl 2 (pH 7,2). Use KOH para el ajuste del valor de pH.
- Evocar exterior K + corrientes duanillo 4,5-sec pasos de voltaje para probar potenciales entre -60 y +50 mV en incrementos de 10-mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV después de un 20-mseg prepulso a -40 mV.
- Asegúrese de que las corrientes de fuga son siempre <100 pA.
- Para la disección de K + corrientes utilizar diferentes inhibidores específicos tales como 4-aminopiridina (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, EE.UU.), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) o tetraetilamonio (TEA, Sigma). Las soluciones madre se preparan en solución extracelular baño, y se aplica directamente a la zona más cercana posible de la célula a través de una micropunta después de "base" grabaciones. El equilibrio se debe permitir durante 2-3 min antes de "medicamentos" grabaciones.
- Para el análisis de normalizar las amplitudes de corriente en las células individuales a tamaño celular (células enteras capacitancia de la membrana). Analizar los datos sin conexión mediante pClamp10.3 software (Molecular Devices) o software similar.
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Representative Results
Aislamiento de cardiomiocitos adultos murinos procedentes de ratones modificados genéticamente para estudiar la función de genes específicos de interés in vitro se ha convertido en una herramienta poderosa para entender mejor la fisiopatología cardíaca. Este método es utilizado actualmente por sólo un número pequeño pero creciente de laboratorios de ciencias básicas en todo el mundo. Sin embargo, el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares adultos murinos puede ser complicado y necesita ser hecho a fondo y repetitivamente por manos expertas. Figura 1 muestra recién cardiomiocitos aislados ejemplares auriculares y ventriculares. Para obtener cardiomiocitos ventriculares se recomienda utilizar sólo en forma de bastón, miocitos ventriculares estriados de aspecto saludable sin contracciones espontáneas. En comparación con los miocitos ventriculares, miocitos auriculares son más cortas y más delgadas. La estriación característica y la varilla de forma de cardiomiocitos ventriculares falta en adultos cardiomiocitos murinos auriculares. El rendimiento de los cardiomiocitos ventriculares aisladosde un corazón de ratón intacto es 5x10 5 - 1x10 6. Para miocitos auriculares es significativamente menor. Por lo general, esperan aislar alrededor de 5 - 25.000 células auriculares del corazón de un ratón. Una vez aislados, los cardiomiocitos se puede someter a diferentes técnicas in vitro incluyendo registros electrofisiológicos (Figura 1). Recomendamos el uso de cardiomiocitos aislados dentro de las primeras 6 horas después del aislamiento. Figura 1 muestra ejemplares Kv grabaciones de canales exteriores (a la derecha) de los miocitos auriculares y ventriculares evocados por diferentes pasos despolarización de células enteras técnica de patch clamp. La forma característica de murino adulto ventricular y auricular canal Kv repolarización corrientes puede ser visto a través de un curso de tiempo definido (aquí 4 segundos, Figura 1). Por favor, tenga en cuenta que la amplitud de la corriente es significativamente menor en murinas miocitos auriculares adultos en comparación con cardiomycytes ventriculares.
| Solución | Contenidos (en mm, si no se especifica otra cosa) |
| 1 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosa |
| 2 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 + Glucosa 229,5 mM EGTA |
| 3 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 glucosa, CaCl 2 0,1 + 0,8 g / L de colagenasa tipo 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 glucosa, CaCl 2 0,2 + 0,8 g / L de colagenasa tipo 2 (300 U / l) * + BSA (1 g / L) |
| 5 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 glucosa, CaCl 2 0,5 + BSA (1 g / L) |
| 6 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 glucosa, CaCl 2 1,0 + BSA (1 g / L) |
Tabla 1. Soluciones de aislamiento. Equilibró durante 10 min con carbógeno (95% O 2, 5% de CO 2), a 37 ° C pH = 7,4 (NaOH). Actividad * puede depender de número de lote, la prueba anterior para la actividad de colagenasa se recomienda.
Figura 1 superior izquierdo:. Ejemplar manchado cardiomiocitos ventriculares con DAPI (núcleos, azul) y Alexa Harina 488 phalloidin (α-actinina, verde) superior derecho:. Ejemplos de restos de células patch clamp todograbación Inferior izquierda:.. Ejemplar manchado cardiomiocitos auricular con DAPI (núcleos, azul) y faloidina fluorocromo conjugado (α-actinina, verde) Abajo a la derecha: huellas ejemplares de grabación clamp de células enteras patch.
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Discussion
Con el desarrollo creciente de cepas de ratón genéticamente modificados para el estudio de la función cardiaca y la patología cardíaca relacionada con una deleción del gen también hay un creciente interés en métodos especializados para estudiar los efectos de la deleción del gen específico in vitro. En nuestro laboratorio se estudia el papel de una familia de canales Kv subunidades accesorias sobre la repolarización cardiaca. Los genes KCNE comprenden una familia de 5 genes (KCNE1-5) que desempeñan papeles importantes en el ventrículo humano y repolarización auricular 11, 15. KCNEs son únicos dominios transmembrana Kv subunidades de los canales auxiliares que no pueden pasar las corrientes de potasio por sí mismos, pero pueden formar complejos con subunidades Kv de canal alfa y modular sus propiedades funcionales, tales como una puerta, conductancia, la farmacología y el tráfico dentro de la célula de manera significativa. Las mutaciones y polimorfismos comunes en KCNE2 por ejemplo, se asocian a las formas heredadas y adquiridas of el síndrome de QT largo (SQTL) 1, 16.
El trabajo pionero en el aislamiento y caracterización electrofisiológica de las diferentes subunidades Kv de canales alfa y su contribución a la rata pero también ventricular y la repolarización auricular murino ha sido realizada por el grupo del Dr. Nerbonne en la Universidad Washington de St. Louis en la década de 1990 3, 5, 7. Sin embargo, significativamente menos se sabe acerca de la contribución de los canales Kv subunidades auxiliares a la repolarización ventricular y auricular dentro del roedor miocardio. KCNEs han sido estudiado sobre todo en sistemas de expresión heterólogos tales como células CHO y de los ovocitos de Xenopus laevis. El uso de estas subunidades KCNE métodos han demostrado ser altamente promiscuas en la formación de complejos heteroméricos de canales Kv identificación de una gama de diferentes subunidades Kv de canal alfa como socios potenciales para KCNEs 10. Sin embargo, no podemos estar seguros de si estos específico heteromeric Kv canal complexes también se producen en los cardiomiocitos nativos o si los observados heteroméricos KCNE Kv subunidad alfa del canal asociaciones son heterólogos 1 artefactos de expresión. Por lo tanto, adoptó la técnica de aislamiento y Kv protocolos de grabación de canal desde el laboratorio Nerbonne y modificado como se indica en la sección de protocolo de este artículo para diseccionar los canales Kv diferentes en la repolarización murino, que son controlados por genes KCNE. Usando este enfoque ha descubierto recientemente que el canal Kv subunidad accesoria KCNE2 controla dos corrientes distintas de Kv en el miocardio ventricular murino (Kslow I, 1 y I, f). Por la aplicación de inhibidores específicos para diferentes canales de potasio que fueron capaces de mostrar que la deleción del gen murino KCNE2 provoca una reducción significativa en ambos Kv1.5 y Kv4.2 corrientes 14. Reglamento de Kv1.5 por KCNE2 no se conocía previamente, wheregulación reas de Kv4.2 por KCNE2 ya se ha demostrado in vitro mediante estudios de expresión heterólogos 20.
La fibrilación auricular (FA) es la arritmia sostenida más frecuente en la práctica clínica y se asocia con una morbilidad y mortalidad 4. Las mutaciones en todos los KCNEs diferentes han sido recientemente asociadas con AF en los seres humanos. Recientemente, dos mutaciones no sinónimas se encontraron en KCNE1 en pacientes con AF que no estaban presentes en el grupo de control (Olesen et al., 2012). Mecánicamente, los estudios de expresión heteróloga identificó un efecto de ganancia de función en KCNQ1 corrientes como el mecanismo subyacente probable. Además, recientemente se ha demostrado que KCNE1 - / - ratones sufren de episodios espontáneos de FA paroxística 17. En un estudio que evaluó 28 familias chinas no relacionados con FA aislada, Yang et al. identificado una mutación en KCNE2,lo que resultó en una sustitución de arginina a cisteína (R27C). El análisis funcional del canal mutante en estudios de expresión heterólogos reveló un efecto de ganancia de función en KCNQ1 canales (I Ks) 18. Sin embargo, KCNE2 también pueden formar complejos con una variedad de otros canales Kv α-subunidades incluyendo Kv1.5, que también ha sido implicado en la FA. Recientemente hemos demostrado que KCNE2 pueden modular las corrientes Kv1.5 en el ventrículo murino conduce a una prolongación de la APD ventricular en ratones 15. Por lo tanto, la interrupción de las corrientes Kv1.5 auriculares por disfunción KCNE2 también puede representar el mecanismo subyacente arritmogénica de FA en nuestra KCNE2 - / - modelo de ratón y / o en los pacientes portadores de la mutación en KCNE2 que sufren de AF. Las mutaciones en KCNE3 también han sido recientemente identificados en un paciente con AF familiar 8. Los registros electrofisiológicos revelaron un increactividad ASED de Kv4.3/KCNE3 y Kv11.1/KCNE3 generado por las corrientes de la mutación, lo que confiere susceptibilidad de portadores de la mutación a la repolarización cardiaca potencial de acción más rápido y por tanto la vulnerabilidad a wavelets re-entrantes en las aurículas. La mutación de sentido erróneo KCNE3 V17M sin embargo no tuvo efecto KCNE3/KCNQ1 corrientes a pesar del hecho de que KCNE3 forma complejos funcionales con KCNQ1 en el miocardio. Por otra parte, KCNE3 fue recientemente demostrado ser regulado hasta en una población humana con valvular AF apoya la hipótesis de que KCNE3 juega un papel no sólo en la FA familiar, pero también valvular AF 6. Recientemente, un polimorfismo de un solo nucleótido (G / T) fue identificado en KCNE4 que resulta en un ácido glutámico (Glu, E) / ácido aspártico (Asp, D) sustitución en la posición 145 del péptido KCNE4 19. Posterior análisis funcional de este polimorfismo reveló que el polimorfismo KCNE4ejerce el efecto de "ganancia de función" en la KCNQ1 canales 9. Una vez más, estos estudios se llevaron a cabo en sistemas de expresión heterólogos y la evidencia experimental de cardiomiocitos nativos que falta todavía. Más recientemente, un aislado no familiar caso de AF con un sentido erróneo (L65F) mutación ha sido identificada en una cohorte danesa de 158 pacientes con AF 12. Además, un polimorfismo en KCNE5 (C97T) fue identificado dentro de la misma población de estudio, lo que se asoció con un mayor riesgo para el desarrollo de AF 13. La interacción de ambos mutante β-subunidades (KCNE2 y KCNE5) con el canal KCNQ1 produce un efecto de ganancia de función con el aumento de las corrientes de conocimientos indígenas. El KCNQ1 α-subunidad del canal IKs puede asociar con una cualquiera de las cinco accesorio β-subunidades (KCNE1-5). Por lo tanto KCNQ1 parece ser un probable candidato de la subunidad α socio en la búsqueda de un sustrato molecular in la patogénesis de KCNE asociada a AF. Sin embargo, dada la promiscuidad pronunciado de las subunidades de KCNE otras dianas moleculares son posibles y por lo tanto, la intención de investigar específicamente estas posibles KCNE / Kv subunidad alfa-interacciones. Los estudios realizados en nuestro laboratorio, por lo tanto también en la actualidad el objetivo de dilucidar los mecanismos detrás de KCNE asociada AF utilizando la técnica descrita en este artículo - Aislamiento de cardiomiocitos murinos auriculares y posteriores en las grabaciones electrofisiológicos in vitro con la aplicación de inhibidores específicos para diferentes subunidades Kv de canales alfa y Los análisis bioquímicos de los cardiomiocitos nativos de ratones knockout KCNEx.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz Thyssen-Stiftung y Charité / MDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
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