Summary
ويرتبط ضعف KV قناة مع عدم انتظام ضربات القلب. من أجل دراسة الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب مثل نستخدم بروتوكول منهجية لعزل cardiomyocytes الأذيني البطيني من التبعية وكيلو فولت الفئران خروج المغلوب قناة فرعية. ويمكن بعد ذلك على الفور cardiomyocytes المعزولة أن تستخدم للدراسات الكهربية الخلوية، والكيمياء الحيوية أو المناعي (IF) المقايسات.
Abstract
الجينات ترميز KCNE لأسرة صغيرة من الوحدات الصغرى كيلو فولت الإضافية التي تشكل مجمعات قناة مغايرة التغصن مع مفارز قناة ألفا كيلو فولت لتعديل خصائصها الوظيفية. تم العثور على طفرات في الجينات KCNE في المرضى الذين يعانون من عدم انتظام ضربات القلب مثل متلازمة QT طويلة و / أو الرجفان الأذيني. ومع ذلك، فإن الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية الدقيقة التي تؤدي إلى هذه الأمراض لا يزال بعيد المنال. في الدراسات السابقة قد تم في الغالب الخصائص الكهربية للمرض تسبب الطفرات في هذه الجينات درس في أنظمة تعبير مغايرة، ونحن لا يمكن أن يكون متأكدا مما إذا كان يمكن مباشرة آثار ذكرت أن تترجم إلى cardiomyocytes الأصلية. في المختبر لدينا ونحن بالتالي استخدام نهج مختلف. ندرس آثار مباشرة حذف الجينات في KCNE cardiomyocytes المعزولة من الفئران خروج المغلوب من الكهربية الخلوية - تقنية فريدة من نوعها التي وصفنا في هذا العدد من مجلة التجارب تصور. قلوب من geneticaورفعه بسرعة الفئران المهندسة وKCNE LLY وشنت على جهاز Langendorff من كيفية تركيب الكانيولا في الأبهر. لا بد مجانا كا 2 + في عضلة القلب بواسطة EGTA، ويتم تحقيق ذلك من التفكك myocytes القلب بواسطة رذاذ الوراء الشرايين التاجية مع وكالة متخصصة منخفضة CA 2 كولاجيناز العازلة التي تحتوي على +. ويمكن بعد ذلك الأذينين، مجانا الجدار البطين الأيمن والبطين الأيسر تكون مفصولة التقنيات المجهرية. وأضاف الكالسيوم ثم العودة ببطء إلى cardiomyocytes معزولة في خطوة متعددة تشمل إجراء الغسيل. ثم يتم cardiomyocytes الأذيني البطيني من ومظهر صحي مع عدم وجود تقلصات عفوية تعرض على الفور لتحليلات الكهربية بواسطة تقنية المشبك التصحيح أو التحليلات البيوكيميائية الأخرى في غضون الساعات ال 6 الأولى بعد العزلة.
Protocol
1. تخدير الحيوانات وحصاد الجهاز
- تخدير الماوس عن طريق الحقن (IP) داخل الصفاق من الكيتامين (200 ملغ / كغ) وزيلازين (20 مغ / كغ).
- لanticoagulate ضخ 250 وحدة دولية IP الهيبارين لتجنب تشكيل تخثر الدم والجلطة.
- الانتظار حتى يتم التوصل إلى الخدر العميق، الذي يتميز رخاوة. للتحقق من ومنعكس رخاوة الاختبار، عن طريق لمس القرنية بلطف القرنية أو اختبار رد الفعل من قبل الطيران معسر الذيل.
- نقل الماوس على طاولة العمليات واصلاحها في موقف ضعيف.
- شق الجلد وجدار البطن تحت الخنجري وأداء بضع الصدر صدفي: تمديد خفض لكلا الجانبين على طول القوس الساحلية وقطع في وقت لاحق الضلوع في خط وسطي الإبطين، صرف صعودا القفص الصدري.
- فتح التأمور، موقع الأوعية الكبيرة. اضغط بلطف الذيلية قلب لعرض أفضل الشريان الأورطي. المشبك باستخدام ملقط الشريان الأورطي.
- وضع القلب في التقعر من زوج من ق cissors وتشريح جميع السفن التي تربط مع بعضها قطع واحد. تأكد من الحفاظ على جزء كبير بما فيه الكفاية من الأبهر الصاعد لكيفية تركيب الكانيولا Langendorff.
- نقل على الفور إلى رفعه القلب طبق بتري مليئة الجليد الباردة وقبل كسيجينيزيد حل 1 (عن حلول، انظر الجدول 1).
2. إعداد الإرواء القلب وLangendorff
- يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي مع قنية الصلب 1.8F. تأكد لتجنب انسداد الهواء.
- يحملق في الشريان الأورطي قنية مع خياطة الجراحية وتدفق التاجية مع 1 مل من محلول 1.
- الاتصال قنية مع جهاز Langendorff.
- تأكد من الوقت بضع الصدر لكيفية تركيب الكانيولا Langendorff لا يزيد على 120 ثانية لتجنب نقص التروية الموسعة / ضخه إصابة في عضلة القلب.
- يروي القلب مع 10 مل من الكالسيوم 2 + حل الحرة 2 (4 دقيقة مل /).
- يروي القلب مع حل كولاجيناز 3 لل8 دقيقة (4 مل / دقيقة).
- نقل القلب في طبق بتري قبل تحسنت 100-مم تحتوي على الكالسيوم منخفضة 2 + الحل 4.
- إزالة بعناية الأبهري وغيرها من الأنسجة غير القلب مع مقص وتخلص منه.
- منفصلة الأذينين والبطينين ومتابعة كل غرفة على حدة. إبقاء خلايا مغمورة في محلول 4. استخدام وحدات التخزين الصغيرة (أقل من 5 مل).
4. مزيد من التفكك لCardiomyocytes
- cardiomyocytes الأذيني:
- لتفريد cardiomyocytes الأذيني نقل الأذينين إلى منفصلة قبل تحسنت طبق الثقافة 100-ملم وفصل الأنسجة من خلال سحب برفق بعيدا مع ملقط الغرامة. ضمان التفكك شبه الكامل للنسيج.
- استخدام ماصة 1 مل مع الموسع النار مصقول ماصة بلاستيكية تلميح لتعليق الخلايا في 1 مل من محلول 5 لمدة 5 دقائق.
- فصل الخلايا من الحطام باستخدام عامل تصفية الخلية (200 ميكرون حجم فتحات الشباك). <لى> إضافة 5 مل 5 إلى حل من المعلقات الخلوية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16 XG في درجة حرارة الغرفة.
- ويتم تشغيل الخطوات التالية تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في في 5 مل من محلول 6.
- بعد الترسيب بواسطة الجاذبية لمدة 10 دقيقة في أنبوب 15 مل، الطرد المركزي ل1 دقيقة في 16 XG في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف. اعادة تعليق الخلايا اعتمادا على كميتها في 1-5 مل من محلول 6.
- تشريح المنطقة البطين الأيسر في المصالح مع ملقط الغرامة في 5 مل من محلول 4.
- تعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف حتى يتم فصل معظم الخلايا. نقل الخلية الحل بعد تصفية (200 ميكرون حجم فتحات الشباك) في أنبوب 50 مل، إضافة حجم 25 مل.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16 XG في درجة حرارة الغرفة.
- ويتم تشغيل الخطوات التالية تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة. إزالة طاف، وإعادة تعليق بيليه في 25 مل منالحل 6 و الترسيب تسمح للخلايا لمدة 10 دقيقة.
- عد الخلايا وإزالة طاف، إضافة 25 - على خلايا 50 مل حل 6.
5. إعداد Cardiomyocytes للالكهربية الخلوية، والكيمياء الحيوية أو الدراسات IF
- للدراسات الكهربية، والحفاظ على myocytes في حل 6 في أنبوب 50 مل وتمنع الترسيب.
- لالبيوكيميائية الدراسات، على سبيل المثال التصوير الكالسيوم، myocytes لوحة على laminin المغلفة خلية طبق الثقافة (تركيز النهائي 20 ميكروغرام / مل في laminin PBS).
- لتلطيخ المناعي إعداد طبق لوحة الثقافة الخلية مع تغطية زلات الزجاج والمغلفة مع حل laminin (تركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل في laminin PBS).
- إزالة الحل قبل myocytes الطلاء. لوحة الخلايا والتحكم في كثافة الخلايا باستخدام المجهر.
- السماح للmyocytes الالتزام لتغطية زلة لمدة 1 ساعة عند 37 ° C في 2٪ CO 2، إزالة الحلوتبدأ على الفور مع بروتوكول تلطيخ الإجراء العادي.
- احتضان مع PFA، على سبيل المثال مثبت 4٪ في برنامج تلفزيوني (7.5 درجة الحموضة) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واتبع الخطوات مع PBS 3 الغسيل لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- لpermeabilize الخلايا والأجسام المضادة لمنع غير محددة ملزمة احتضان myocytes مع المصل 10٪، 0.3٪ تريتون، 0.2٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ل1 ساعة عند 37 ° C ويغسل كما هو موضح من قبل.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لملون مباين نواة وα-actinin دابي استخدام وphalloidin مترافق ملون تألقي (اليكسا فلور 488، إينفيتروجن).
- بعد غسل ونقل الغطاء ينزلق الزجاج بعناية على سيلاني الشرائح المجهر والخلايا تعامل تضمين في مضان المتوسطة المتزايدة.
6. الكهربية الخلوية
- أداء خلية كاملة التصحيح، المشبك التسجيلات على الصحائفعزل shly cardiomyocytes الأذيني البطيني وعند درجة حرارة الغرفة.
- نقل صحي cardiomyocytes الظهور في غرفة مليئة نضح وحدة تخزين محددة من حل حمام خارج الخلية. كلوريد الصوديوم 117 ملم، 4 ملم بوكل، 1 ملم KH 2 PO 4، 4 مم NaHCO 3، 1،7 ملم MgCl 2، 3 مم كوكلي 2، HEPES ملي 10، 10 ملم الجلوكوز، و 0.02 سم الأسماك الرباعية الأسنان ملي (TTX)، (درجة الحموضة 7.4) . استخدام هيدروكسيد الصوديوم لتعديل قيمة الرقم الهيدروجيني.
- استخدام المعدات المناسبة المشبك التصحيح (أي IX71 المجهر المقلوب، مكبر للصوت Multiclamp 700B، عملية استحواذ 1440A Digidata النظام وPC مع pClamp10.3 البرمجيات (الأجهزة الجزيئية)).
- استخدام ماصات التصحيح مع المقاومة من 3-5 MΩ عندما مليئة حل الخلايا التي تحتوي على 130 ملم بوكل، 2 ملم MgCl 2 و 11 ملي HEPES، 11 مم EGTA، 5 مم نا 2 ATP، 0.4 مم نا 2 GTP، 5 ملي نا 2 CP و 4.9 ملي CaCl 2 (الرقم الهيدروجيني 7.2). استخدام KOH لتعديل قيمة الرقم الهيدروجيني.
- استحضار الخارج K + التيارات دوخطوات الحلقة الجهد 4.5 ثانية لاختبار إمكانات بين -60 +50 وبالسيارات في 10-بالسيارات الزيادات المحتملة من عقد -70 بالسيارات بعد 20 ميللي ثانية إلى prepulse بالسيارات -40.
- تأكد من التيارات تسرب دائما <100 باسكال.
- لتشريح K + التيارات المختلفة استخدام مثبطات محددة مثل المعراة-4 (4-AP؛ Biomedicals ICN، إرفين، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)، Heteropodatoxin 2 (HpTx2؛ Alomone) أو رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA؛ سيغما). وينبغي إعداد حلول الأسهم في حل حمام خارج الخلية، وتطبيقها مباشرة على المنطقة المجاورة أقرب ممكن من الخلية عن طريق التسجيلات microtip بعد "الأساسي". وينبغي أن يسمح لمدة 2-3 دقيقة موازنة قبل تسجيلات "المخدرات".
- لتحليل تطبيع سعة الحالية في الخلايا الفردية لحجم الخلية (خلية كاملة السعة الغشاء). تحليل البيانات دون اتصال باستخدام البرمجيات pClamp10.3 (الأجهزة الجزيئية) أو برامج مماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أصبح عزل cardiomyocytes الفئران الكبار من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة وظيفة جينات معينة ذات أهمية في المختبر أداة قوية لزيادة فهم الفيزيولوجيا المرضية القلبية. ويستخدم حاليا من قبل هذه الطريقة عدد صغير فقط ولكن زيادة معامل العلوم الأساسية في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، يمكن عزل cardiomyocytes البطين الكبار الفئران يمكن أن تكون خادعة ويجب القيام به بدقة وبشكل متكرر من قبل أيدي ذوي الخبرة. ويظهر الشكل 1 طازجة cardiomyocytes نموذج معزولة الأذيني البطيني و. لcardiomyocytes البطين نوصي لاستخدام فقط على شكل قضيب، myocytes البطين مخطط لمظهر صحي مع عدم وجود تقلصات عفوية. مقارنة مع myocytes البطين، myocytes الأذيني هي أقصر وأنحف. وتثليم مميزة ورود الشكل، من cardiomyocytes البطين مفقود في cardiomyocytes الكبار الفئران الأذيني. عزل العائد لcardiomyocytes البطينمن قلب الفأر سليمة هو 5x10 5 - 1x10 6. لcardiomyocytes الأذيني هو أقل بكثير. نتوقع عموما لعزل حوالي 5 - 25،000 خلايا القلب الأذيني من الماوس واحد. مرة واحدة معزولة، ويمكن أن تخضع لcardiomyocytes مختلفة في المختبر بما في ذلك تقنيات التسجيلات الكهربية (الشكل 1). نوصي لاستخدام cardiomyocytes معزولة داخل ساعة بعد أول 6 العزلة. الشكل 1 يبين نموذج تسجيلات قناة كيلو فولت الخارج (على اليمين) من cardiomyocytes الأذيني البطيني وأثار خطوات إزالة الاستقطاب مختلفة من خلية كاملة التصحيح تقنية المشبك. ويمكن رؤية شكل من سمات الكبار البطين الفئران والأذيني قناة كيلو فولت repolarizing التيارات أكثر من دورة زمنية محددة (4 ثانية هنا، الشكل 1). يرجى ملاحظة أن السعة الحالية هي أقل من ذلك بكثير في cardiomyocytes الفئران الكبار الأذيني البطيني مقارنة cardiomycytes.
| حل | المحتويات (في ملي، إذا لم يتم تحديد بشكل مختلف) |
| 1 | 117 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 10 HEPES، 1 KH 2 PO 4، 4 NaHCO 3، 1،7 MgCl 2 و 10 الجلوكوز |
| 2 | 117 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 10 HEPES، 1 KH 2 PO 4، 4 NaHCO 3، 1،7 MgCl 2 و 10 + الجلوكوز 229.5 EGTA ميكرومتر |
| 3 | 117 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 10 HEPES، 1 KH 2 PO 4، 4 NaHCO 3، 1،7 MgCl 2 و 10 الجلوكوز، CaCl 2 0.1 + 0.8 غرام / L كولاجيناز النوع 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 10 HEPES، 1 KH 2 PO 4، 4 NaHCO 3، 1،7 MgCl 2 و 10 الجلوكوز، CaCl 2 0.2 + 0.8 غرام / L كولاجيناز النوع 2 (300 U / L) * + BSA (1 جم / L) |
| 5 | 117 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 10 HEPES، 1 2 KH 4، 4 NaHCO 3، 1،7 MgCl 2 و 10 الجلوكوز، CaCl 2 0.5 + BSA (1 جم / L) |
| 6 | 117 كلوريد الصوديوم، 4 بوكل، 10 HEPES، 1 KH 2 PO 4، 4 NaHCO 3، 1،7 MgCl 2 و 10 الجلوكوز، CaCl 2 1.0 + BSA (1 جم / L) |
الجدول 1. حلول العزلة. معايرتها لمدة 10 دقيقة مع كربوجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2)، عند 37 درجة مئوية درجة الحموضة = 7.4 (هيدروكسيد الصوديوم). * نشاط قد تعتمد على رقم الدفعة، ويوصى التجارب السابقة لذلك النشاط كولاجيناز.
الشكل 1 العلوي الأيسر: المثالية الملون cardiomyocyte البطين مع دابي (نوى، الأزرق) واليكسا طحين 488 Phalloidin (α-actinin والأخضر) العلوي الأيمن: المثالية آثار كله الخلية المشبك التصحيحتسجيل اليسرى السفلى:. المثالية الملون cardiomyocyte الأذيني مع دابي (نوى، الأزرق) وPhalloidin مترافق ملون تألقي (α-actinin والأخضر) انخفاض الحق: آثار المثالية من كل خلية التصحيح تسجيل المشبك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع تطور متزايد من سلالات الفئران المعدلة وراثيا لدراسة وظيفة القلب وأمراض القلب المتعلقة حذف الجينات هناك أيضا اهتمام متزايد في وسائل متخصصة لدراسة الآثار المترتبة على حذف جين معين في المختبر. في مختبرنا ندرس أدوار عائلة من مفارز كيلو فولت المساعدة على قناة عودة الاستقطاب القلب. الجينات KCNE تضم أسرة مكونة من 5 جينات (KCNE1-5) التي تلعب أدوارا هامة في البطين الإنسان وعودة الاستقطاب الأذيني 11 و 15. KCNEs هي واحدة عبر الغشاء المجال كيلو فولت مفارز قناة المساعدة التي لا يمكن ان تمر أي التيارات البوتاسيوم من تلقاء نفسها، ولكن يمكن أن تشكيل مجمعات مع مفارز قناة ألفا كيلو فولت وتعدل خصائصها الوظيفية مثل الصيدلة النابضة، وتصرف الاتجار داخل الخلية بشكل كبير. ترتبط طفرات والأشكال شيوعا في KCNE2 على سبيل المثال مع س أشكال الموروثة والمكتسبةو متلازمة QT طويلة (LQTS) 1، 16.
وقد تم ذلك العمل الرائد في العزلة وتوصيف الكهربية من مختلف الوحدات الصغرى كيلو فولت قناة ألفا ومساهمتها في الفئران ولكن أيضا البطين الفئران وعودة الاستقطاب الأذيني من قبل مجموعة من Nerbonne الدكتور في جامعة واشنطن في سانت لويس في 1990s 3، 5، 7. ومع ذلك، فمن المعروف أقل بكثير عن مساهمة مفارز كيلو فولت المساعدة لعودة الاستقطاب الأذيني قناة البطين وعضلة القلب في القوارض. KCNEs بشكل رئيسي تمت دراسة في نظم تعبير مغايرة مثل خلايا البويضات وCHO القيطم المورق. باستخدام هذه الأساليب مفارز KCNE وقد ثبت أن يكون منحل للغاية في تشكيل المجمعات مغايرة التغصن قناة كيلو فولت تحديد مجموعة من الوحدات الصغرى كيلو فولت مختلفة قناة ألفا والشركاء المحتملين للKCNEs 10. ومع ذلك، لا يمكننا التأكد ما إذا كانت هذه القناة محددة مغايرة التغصن كيلو فولت مجمعاتxes تحدث أيضا في cardiomyocytes الأم أو إذا كان الملاحظ مغايرة التغصن KCNE كيلو فولت الوحيدات ألفا الشراكات هي قناة مغاير التحف التعبير 1. ولذلك اعتمدنا أسلوب العزل والبروتوكولات كيلو فولت تسجيل قناة من المختبر Nerbonne وتعديل لهم كما هو مبين في القسم بروتوكول من هذه المادة لتشريح قنوات مختلفة كيلو فولت في عودة الاستقطاب الفئران، التي تسيطر عليها الجينات KCNE. باستخدام هذا النهج وجدنا مؤخرا أن الوحيدات كيلو فولت التبعية قناة KCNE2 تسيطر تيارين كيلو فولت متميزة في الفئران البطين عضلة القلب (Kslow I، 1 و I ل، و). من خلال تطبيق مثبطات محددة لقنوات البوتاسيوم مختلفة تمكنا من إظهار أن حذف هذا الجين يسبب KCNE2 الفئران انخفاض كبير في كل من Kv1.5 Kv4.2 والتيارات 14. لم Kv1.5 من تنظيم KCNE2 يعرف سابقا، عرجوقد تم بالفعل تنظيم REAS Kv4.2 من KCNE2 أظهرت الدراسات في المختبر من قبل تعبير مغايرة 20.
الرجفان الأذيني (AF) هو عدم انتظام ضربات القلب الأكثر شيوعا في الممارسة السريرية مستمرة ويرتبط مع قسط كبير من المراضة و 4 وفيات. وقد تم مؤخرا الطفرات في جميع KCNEs المختلفة المرتبطة AF في البشر. مؤخرا، تم العثور على اثنين من غير مرادفا الطفرات في KCNE1 في المرضى الذين يعانون من AF التي لم تكن موجودة في السيطرة على المجموعة (أولسن وآخرون، 2012). ميكانيكي، حددت الدراسات تعبير مغايرة له أثر مكاسب من بين ظيفة في KCNQ1 التيارات باعتباره الآلية الأساسية المحتملة. وعلاوة على ذلك، في الآونة الأخيرة تبين أن KCNE1 - / - الفئران تعاني من نوبات من العفوية AF الانتيابي 17. في دراسة تقييم 28 عائلة لا علاقة لها مع AF الصينية وحيد، يانغ وآخرون. حددت طفرة في KCNE2،مما أسفر عن استبدال أرجينين إلى السيستين (R27C). كشف التحليل الوظيفي للقناة متحولة في الدراسات تعبير مغايرة له أثر مكاسب من بين الدالة على KCNQ1 القنوات (I كانساس) 18. ومع ذلك، يمكن أيضا تشكيل KCNE2 المجمعات مع مجموعة من القنوات الأخرى α-كيلو فولت بما في ذلك الوحدات الصغرى Kv1.5، والتي كما تم المتورطين في AF. لقد أظهرنا مؤخرا أن KCNE2 يمكن أن تعدل Kv1.5 التيارات في البطين الفئران مما أدى إلى إطالة أمد APD البطين في الفئران 15. ولذلك، يمكن تعطيل التيارات Kv1.5 الأذيني من ضعف KCNE2 تمثل أيضا الآلية الأساسية لمحدث اضطراب النظم AF في KCNE2 لدينا - / - نموذج الفأر و / أو إيواء المرضى في طفرة في KCNE2 يعانون من AF. كما تم تحديد الطفرات في KCNE3 مؤخرا في المريض مع AF العائلية 8. كشفت التسجيلات الكهربية لincreالنشاط ased من Kv4.3/KCNE3 ولدت التيارات Kv11.1/KCNE3 من قبل الطفرة، وبالتالي منح قابلية حاملات التحور لعودة الاستقطاب العمل بشكل أسرع، وبالتالي القلب المحتملة من التعرض للإعادة الوافد المويجات في الأذينين. ومغلطة V17M KCNE3 الطفرة كان مع ذلك أي تأثير التيارات KCNE3/KCNQ1 على الرغم من أن KCNE3 أشكال المجمعات مع KCNQ1 الوظيفية في عضلة القلب. وعلاوة على ذلك، وقد تبين مؤخرا أن ينظم KCNE3 حتى في البشر مع صمامي AF دعم الفرضية القائلة بأن KCNE3 تلعب دورا ليس فقط في AF العائلي ولكن أيضا صمامي AF 6. مؤخرا، تم تحديد تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (G / T) في KCNE4 مما أدى إلى حمض الجلوتاميك (غلو، E) / حمض الأسبارتيك (ASP، D) في موقف استبدال 145 من الببتيد KCNE4 19. كشف التحليل الوظيفي لاحق من هذا التعدد أن تعدد الأشكال KCNE4يمارس تأثير "كسب وظيفة" على القنوات KCNQ1 9. مرة أخرى، أجريت هذه الدراسات في النظم تعبير مغايرة والأدلة التجريبية من cardiomyocytes الأصلي لا يزال غير موجود. وفي الآونة الأخيرة، تم التعرف معزولة غير العائلية حالة AF مع طفرة (L65F) مغلطة في الفوج الدنماركية من 158 المرضى الذين يعانون من AF 12. وعلاوة على ذلك، تم تحديد تعدد الأشكال في KCNE5 (C97T) داخل مجتمع الدراسة نفسه، الذي كان مرتبطا مع مخاطر أعلى لتطوير AF 13. تنتج تفاعل كل من متحولة β-مفارز (KCNE2 وKCNE5) مع قناة KCNQ1 تأثير مكاسب من بين وظيفة مع زيادة التيارات IKS. يمكن للKCNQ1 α-الوحيدات لقناة IKS المنتسبين مع أي واحد من الإكسسوارات β-5 مفارز (KCNE1-5). ولذلك KCNQ1 يبدو أن المرشح المحتمل α-الوحيدات عند البحث عن شريك ركيزة الجزيئية طن التسبب في KCNE المرتبطة AF. ومع ذلك، وبالنظر إلى المجون وضوحا من مفارز KCNE الأهداف الجزيئية الأخرى ممكنة، ونحن عازمون على وجه التحديد ذلك للتحقيق في هذه ممكن KCNE / كيلو فولت الوحيدات ألفا التفاعلات. ولذلك فإن الدراسات في المختبر لدينا أيضا تهدف حاليا إلى إلقاء الضوء على الآليات وراء KCNE المرتبطة باستخدام تقنية AF وصفنا في هذه المقالة - عزل cardiomyocytes الأذيني الفئران واللاحقة في التسجيلات الكهربية المختبر مع تطبيق مثبطات محددة لمختلف الوحدات الصغرى كيلو فولت قناة ألفا و البيوكيميائية تحليلات cardiomyocytes الأصلية من الفئران خروج المغلوب KCNEx.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، فريتز تيسين-ستيفتونغ وشاريتيه / MDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
References
- Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs? Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
- Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
- Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels? Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
- Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
- Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
- Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
- Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
- Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
- Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
- McCrossan, Z. A., Abbott, G. W.
- Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
- Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
- Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
- Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
- Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
- Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
- Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M.
- Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
- Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
- Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).
