Summary
केवी चैनल शिथिलता कार्डियक arrhythmias के साथ जुड़ा हुआ है. आदेश में आणविक तंत्र है कि ऐसे arrhythmias हम केवी चैनल सहायक सबयूनिट पीटा चूहों से atrial और वेंट्रिकुलर cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए नेतृत्व का अध्ययन करने के लिए. पृथक cardiomyocytes तो तुरंत सेलुलर electrophysiological अध्ययन, जैव रासायनिक या immunofluorescence assays (यदि) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
KCNE जीन केवी चैनल सहायक सब यूनिटों कि केवी चैनल अल्फा सब यूनिटों के साथ heteromeric परिसरों के रूप में उनके कार्यात्मक संपत्तियों को संशोधित करने के एक छोटे से परिवार के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना. KCNE जीन में उत्परिवर्तन लंबी क्यूटी सिंड्रोम और / या atrial fibrillation जैसे हृदय arrhythmias के साथ रोगियों में पाया गया है. हालांकि, सटीक आणविक pathophysiology है कि इन बीमारियों की ओर जाता है मायावी बनी हुई है. पिछले अध्ययनों में इन जीनों में परिवर्तन के कारण बीमारी के electrophysiological गुण ज्यादातर heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली में अध्ययन किया गया है और हमें यकीन है कि नहीं हो सकता है अगर की सूचना दी प्रभाव सीधे देशी cardiomyocytes में अनुवाद किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में इसलिए हम एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग करें. एक अनोखी तकनीक है कि हम visualized प्रयोगों के जर्नल की इस अंक में वर्णन हम सीधे सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा पीटा चूहों से अलग cardiomyocytes में KCNE जीन विलोपन के प्रभाव का अध्ययन. Genetica से दिलlly इंजीनियर KCNE चूहों तेजी से और excised महाधमनी केन्युलेशन के द्वारा एक Langendorff तंत्र पर मुहिम शुरू की है. मायोकार्डियम में मुफ्त Ca 2 + EGTA से बाध्य है, और हृदय myocytes की हदबंदी तो एक विशेष कम Ca 2 + बफर युक्त कोलैजिनेज के साथ कोरोनरी धमनियों की प्रतिगामी छिड़काव द्वारा हासिल की है. एट्रिया, मुफ्त सही वेंट्रिकुलर दीवार और बाएं वेंट्रिकल तो microsurgical तकनीक द्वारा अलग किया जा सकता है. कैल्शियम फिर धीरे धीरे एक कई कपड़े धोने की प्रक्रिया शामिल चरण में अलग cardiomyocytes वापस करने के लिए जोड़ा गया है. कोई सहज संकुचन के साथ स्वस्थ उपस्थिति के Atrial और वेंट्रिकुलर cardiomyocytes तो तुरंत पैच दबाना या अलगाव के बाद पहले 6 घंटे के भीतर तकनीक अन्य जैव रासायनिक विश्लेषण द्वारा electrophysiological विश्लेषण करने के लिए अधीन.
Protocol
1. पशु संज्ञाहरण और अंग कटाई
- Ketamine (200 BW मिलीग्राम / किग्रा) और Xylazine (BW 20 मिलीग्राम / किग्रा) के intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा माउस संज्ञाहीन करना.
- करने के लिए anticoagulate 250 आइयू हेपरिन आईपी इंजेक्षन करने के लिए रक्त के थक्के और thrombus गठन से बचने के लिए.
- रुको जब तक गहरे निद्रावहन तक पहुँच है, जो अप्रतिवर्तता के द्वारा होती है. धीरे या पूंछ pinching द्वारा परीक्षण उड़ान पलटा कॉर्निया को छू अप्रतिवर्तता, परीक्षण corneal पलटा के लिए जाँच करें.
- ऑपरेटिंग मेज पर माउस स्थानांतरण और लापरवाह स्थिति में इसे ठीक कर.
- असिरूप नीचे त्वचा और पेट की दीवार को काटकर अलग कर देना और सीपी thoracotomy प्रदर्शन: दोनों पक्षों के लिए तटीय कट्टर साथ कटौती और विस्तार बाद में औसत दर्जे का कक्षा लाइन में पसलियों में कटौती, रिब पिंजरे के ऊपर की तरफ मोड़ना.
- Pericardium खोलें, महान वाहिकाओं का पता लगाने. धीरे दिल लांगुलिय प्रेस के लिए बेहतर महाधमनी प्रदर्शित. संदंश का उपयोग कर महाधमनी क्लैंप करें.
- की एक जोड़ी की concavity में दिल प्लेस cissors और एक एकल कटौती के साथ सभी को जोड़ने वाहिकाओं टुकड़े करना. को Langendorff केन्युलेशन के लिए आरोही महाधमनी का एक बड़ा पर्याप्त हिस्सा बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें कि.
- Excised दिल तुरंत स्थानांतरण एक पेट्री डिश के लिए बर्फ के ठंडे और पूर्व oxygenized समाधान 1 (समाधान के लिए, 1 टेबल देखें) के साथ भरा.
2. हार्ट और Langendorff परफ्यूज़न की तैयारी
- एक 1.8F स्टील प्रवेशनी के साथ महाधमनी Cannulate. वायु अन्त: शल्यता से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
- शल्य चिकित्सा और 1 समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ सीवन फ्लश coronaries साथ प्रवेशनी पर महाधमनी fixate.
- प्रवेशनी एक Langendorff उपकरण के साथ कनेक्ट.
- सुनिश्चित करें कि thoracotomy से Langendorff केन्युलेशन समय 120 सेकंड से अधिक नहीं होनी मायोकार्डियम के लिए विस्तारित चोट / ischemia reperfusion से बचने के लिए करता है.
- 2 सीए के 10 मिलीलीटर के साथ छिड़कना दिल + मुक्त समाधान 2 (4 एमएल / मिनट).
- 8 मिनट (4 मिलीग्राम / मिनट) के लिए समाधान के साथ 3 कोलैजिनेज छिड़कना दिल.
- एक पूर्व गर्म 100 मिमी पेट्री डिश में कम Ca 2 + 4 समाधान युक्त स्थानांतरण दिल.
- ध्यान से कैंची से महाधमनी और अन्य गैर हृदय ऊतक को हटाने और इसे त्यागने.
- अलग atria और ventricles और प्रत्येक कक्ष के साथ अलग से जारी रखने के लिए. 4 समाधान में डूब कोशिकाओं रखें. छोटी मात्रा (कम से कम 5 मिलीग्राम) का प्रयोग करें.
4. Cardiomyocytes की इसके अलावा हदबंदी
- Atrial cardiomyocytes:
- विशिष्ट atrial cardiomyocytes एक अलग पूर्व गर्म 100 मिमी संस्कृति डिश में अटरिया हस्तांतरण और धीरे यह ठीक संदंश के साथ अलग खींच के माध्यम से ऊतक अलग कर देना. ऊतक के एक लगभग पूर्ण हदबंदी सुनिश्चित करें.
- एक बढ़े हुए आग पॉलिश प्लास्टिक विंदुक टिप 5 समाधान के 1 मिलीलीटर में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को निलंबित के साथ एक 1 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग करें.
- एक सेल फिल्टर (200 सुक्ष्ममापी जाल आकार) का उपयोग करके मलबे से कोशिकाओं को अलग. <li> 5 मिलीग्राम सेल निलंबन के लिए 5 समाधान और कमरे के तापमान पर 16 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें.
- निम्नलिखित कदम एक सेल संस्कृति हुड के तहत संचालित कर रहे हैं. सतह पर तैरनेवाला और 6 समाधान के 5 मिलीलीटर में फिर से निलंबित गोली त्यागें.
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिनट के लिए गंभीरता से अवसादन के बाद, 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16 XG पर अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला निकालें. 6 समाधान के 1-5 मिलीलीटर में उनकी मात्रा के आधार पर कोशिकाओं को स्थगित कर देते हैं.
- 4 समाधान के 5 मिलीलीटर में ठीक संदंश के साथ ब्याज की बाएं निलय क्षेत्र काटना.
- जब तक कोशिकाओं के सबसे अलग हो रहे हैं धीरे pipetting द्वारा कोशिकाओं को निलंबित. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में (200 सुक्ष्ममापी जाल आकार) को छानने के बाद सेल समाधान स्थानांतरण, 25 मिलीलीटर की मात्रा जोड़ने.
- 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16 XG पर अपकेंद्रित्र.
- निम्नलिखित कदम एक सेल संस्कृति हुड के तहत संचालित कर रहे हैं. तैरनेवाला निकालें, 25 मिलीलीटर में गोली पुनः को निलंबित6 समाधान और 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के अवसादन अनुमति देते हैं.
- कोशिकाओं गणना और तैरनेवाला हटाने, 25 जोड़ - कोशिकाओं पर 50 मिलीलीटर 6 समाधान.
5. Cardiomyocytes की सेलुलर इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी, बायोकेमिकल के लिए या पढ़ाई यदि तैयारी
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन के लिए, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 6 समाधान में myocytes रखने और अवसादन को बाधित.
- जैव रासायनिक अध्ययन, जैसे कैल्शियम, इमेजिंग, laminin लेपित सेल संस्कृति डिश प्लेट myocytes (अंतिम एकाग्रता 20 ग्राम / मिलीलीटर पीबीएस में laminin).
- Immunofluorescence धुंधला हो जाना कांच के कवर फिसल जाता है के साथ एक सेल संस्कृति पकवान थाली तैयार करने और laminin समाधान (अंतिम 50 ग्राम / मिलीलीटर पीबीएस में laminin एकाग्रता) के साथ लेपित.
- चढ़ाना myocytes पहले समाधान निकालें. कोशिकाओं प्लेट और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल घनत्व को नियंत्रित.
- चलो myocytes पालन करने के लिए 2% सीओ 2 में 1 घंटे के लिए 37 में पर्ची डिग्री सेल्सियस को कवर करने के लिए, इस समस्या का समाधान निकालेंऔर तुरंत एक मानक धुंधला हो जाना प्रक्रिया प्रोटोकॉल के साथ शुरू करते हैं.
- लगानेवाला, पीबीएस में उदाहरण के 4% पीएफए (7.5 पीएच) के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं और 5 मिनट के लिए प्रत्येक तीन पीबीएस वाशिंग कदम के साथ पालन करें.
- कोशिकाओं permeabilize और को बाधित करने के लिए unspecific बाध्यकारी एंटीबॉडी 10% सीरम, 0.3% ट्राइटन, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% BSA के साथ myocytes सेते हैं.
- 37 में 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते डिग्री सेल्सियस और के रूप में पहले वर्णित धो लो.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. नाभिक counterstain और α-actinin उपयोग DAPI और fluorochrome संयुग्मित phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
- धोने के बाद स्थानांतरण, कांच के कवर silane इलाज खुर्दबीन स्लाइड और एम्बेड कोशिकाओं पर ध्यान प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम में निकल जाता है.
6. सेलुलर इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी
- Fre पर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शनकमरे के तापमान पर shly atrial और वेंट्रिकुलर cardiomyocytes अलग.
- छिड़काव कोशिकी स्नान समाधान का एक निर्धारित मात्रा के साथ भरा चेंबर में स्वस्थ प्रदर्शित होने cardiomyocytes स्थानांतरण. 117 मिमी NaCl, 4 मिमी KCl, 1 मिमी KH 2 4 पीओ, 4 मिमी NaHCO 3, 1.7 मिमी MgCl 2, 3 मिमी 2 CoCl, 10 मिमी HEPES, 10 मिमी ग्लूकोज, और 0.02 मिमी (TTX) tetrodotoxin (पीएच 7.4) . NaOH पीएच मान समायोजन के लिए प्रयोग करें.
- उचित पैच दबाना उपकरण का उपयोग (यानी IX71 औंधा माइक्रोस्कोप, एक Multiclamp 700B प्रवर्धक, एक Digidata 1440A अधिग्रहण और pClamp10.3 सॉफ्टवेयर (आण्विक उपकरण) के साथ प्रणाली पीसी).
- MΩ की 3-5 resistances के साथ पैच pipettes का प्रयोग करें जब intracellular 2 सी.पी. ना 130 मिमी KCl, 2 मिमी 2 MgCl, 11 मिमी HEPES, 11 मिमी EGTA, 5 मिमी ना 2 एटीपी, 0.4 मिमी ना GTP 2, 5 मिमी युक्त समाधान के साथ भरा और 4.9 मिमी 2 CACL (7.2 पीएच). पीएच मान समायोजन के लिए KOH का उपयोग करें.
- जावक + K धाराओं du आह्वानअंगूठी 4.5 सेकंड कदम वोल्टेज -60 और 50 के बाद एक 20-मिसे -40 mV prepulse -70 mV की होल्डिंग क्षमता से 10 mV वेतन वृद्धि में एमवी के बीच क्षमता का परीक्षण करने के लिए.
- सुनिश्चित करें कि रिसाव धाराओं हमेशा <100 PA.
- , 2 Heteropodatoxin (HpTx2, Alomone) या Tetraethylammonium (चाय, सिग्मा), अलग कश्मीर का विच्छेदन के लिए + धाराओं (ICN Biomedicals, इरविन, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका, 4-एपी) 4 - aminopyridine जैसे विशिष्ट inhibitors का उपयोग करें. शेयर समाधान कोशिकी स्नान समाधान में तैयार किया जाना चाहिए, और सीधे सेल के निकटतम संभव आसपास "आधारभूत" रिकॉर्डिंग के बाद एक microtip के माध्यम से आवेदन किया है. संतुलन "दवा" रिकॉर्डिंग से पहले 2-3 मिनट के लिए अनुमति दी जानी चाहिए.
- विश्लेषण के लिए सेल का आकार व्यक्तिगत कोशिकाओं (पूरे सेल झिल्ली समाई) में वर्तमान amplitudes मानक के अनुसार. PClamp10.3 सॉफ्टवेयर (आण्विक उपकरण) या तुलनीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ऑफ़लाइन डेटा का विश्लेषण.
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Representative Results
अनुवांशिक इंजीनियर इन विट्रो में ब्याज की विशेष जीन के समारोह का अध्ययन चूहों से वयस्क murine cardiomyocytes के अलगाव आगे हृदय pathophysiology को समझने के लिए करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है. इस विधि वर्तमान में केवल बुनियादी विज्ञान प्रयोगशालाओं की दुनिया भर में एक छोटी लेकिन बढ़ती संख्या के द्वारा प्रयोग किया जाता है. हालांकि, वयस्क वेंट्रिकुलर murine cardiomyocytes के अलगाव मुश्किल हो सकता है और अच्छी तरह से और repetitively अनुभवी हाथों से किया जाना चाहिए चित्रा 1. हौसले से पृथक कापी atrial और वेंट्रिकुलर cardiomyocytes से पता चलता है. Ventricular cardiomyocytes के लिए हम केवल कोई सहज संकुचन के साथ छड़ के आकार, स्वस्थ उपस्थिति की धारीदार वेंट्रिकुलर myocytes का उपयोग करने की सलाह देते हैं. वेंट्रिकुलर myocytes के साथ तुलना में, atrial myocytes छोटे और पतले हैं. विशेषता और वेंट्रिकुलर cardiomyocytes की छड़ के आकार striation वयस्क atrial murine cardiomyocytes में लापता है. वेंट्रिकुलर cardiomyocytes के लिए उपज पृथक6 1x10 - एक अक्षुण्ण माउस दिल से 5x10 5 है. Atrial cardiomyocytes के लिए यह काफी कम है. एक माउस दिल से 25,000 atrial कोशिकाओं हम आम तौर पर के बारे में 5 अलग करने की उम्मीद है. एक बार अलग, cardiomyocytes electrophysiological रिकॉर्डिंग (1 चित्रा) सहित इन विट्रो तकनीक में अलग किया जा सकता है. हम अलगाव के बाद पहली बार 6 घंटे के भीतर अलग cardiomyocytes उपयोग करने की सलाह देते हैं. चित्रा 1 से पता चलता है कापी atrial और वेंट्रिकुलर पूरे सेल पैच दबाना तकनीक द्वारा विभिन्न विध्रुवण कदम से पैदा cardiomyocytes की केवी चैनल जावक रिकॉर्डिंग (सही पर). murine वयस्क वेंट्रिकुलर और atrial केवी चैनल धाराओं repolarizing की विशेषता आकार एक निर्धारित समय कोर्स (यहाँ 4 सेकंड, चित्रा 1) पर देखा जा सकता है. कृपया ध्यान दें कि वर्तमान आयाम murine वयस्क atrial cardiomyocytes में काफी कम वेंट्रिकुलर cardiomycytes तुलना है.
| समाधान | सामग्री (मिमी में अगर अलग ढंग से निर्दिष्ट नहीं) |
| 1 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4 पीओ, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 ग्लूकोज |
| 2 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4 पीओ, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 ग्लूकोज + 229.5 सुक्ष्ममापी EGTA |
| 3 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4 पीओ, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 ग्लूकोज, 2 CACL 0.1 + 0.8 ग्राम / एल Collagenase टाइप 2 (300 यू / एल) * |
| 4 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4 पीओ, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 ग्लूकोज, 2 CACL 0.2 + 0.8 ग्राम / एल Collagenase टाइप 2 (300 यू / एल) * + (BSA 1 / छ एल) |
| 5 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 2 KH 4, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 ग्लूकोज, 2 CACL 0.5 + BSA (1 ग्राम / एल) |
| 6 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, 1 KH 2 4 पीओ, 4 3 NaHCO, 1.7 MgCl 2, 10 ग्लूकोज, CACL 2 1.0 + BSA (1 ग्राम / एल) |
तालिका 1. अलगाव समाधान. Carbogen (95% 2 हे, 5% सीओ 2) के साथ 37 पर 10 मिनट के लिए Equilibrated ° C पीएच 7.4 = (NaOH). * गतिविधि बैच नंबर पर निर्भर हो सकता है, इसलिए पिछले कोलैजिनेज गतिविधि के परीक्षण की सिफारिश की है.
चित्रा 1 ऊपरी बाएँ: DAPI (नाभिक, नीला) और Alexa मैदा 488 Phalloidin (α-actinin, हरे) के साथ अनुकरणीय निलय cardiomyocyte दाग ऊपरी सही: पूरे सेल पैच दबाना अनुकरणीय निशानरिकॉर्डिंग वाम लोअर. अनुकरणीय DAPI (नाभिक, नीला) और fluorochrome संयुग्मित Phalloidin (α actinin, हरा) के साथ atrial cardiomyocyte दाग कम सही: पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग की अनुकरणीय निशान.
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Discussion
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस उपभेदों और हृदय समारोह हृदय विकृति जीन विलोपन से संबंधित अध्ययन के बढ़ते विकास के साथ वहाँ भी विशेष तरीकों में एक बढ़ती रुचि के लिए इन विट्रो में विशिष्ट जीन विलोपन के प्रभाव का अध्ययन है. हमारी प्रयोगशाला में हम हृदय repolarization पर केवी चैनल सहायक सब यूनिटों के एक परिवार की भूमिका का अध्ययन करते हैं. KCNE जीन 5 (KCNE1-5) जीन है कि मानव वेंट्रिकुलर और atrial repolarization 11, 15 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के एक परिवार शामिल KCNEs एकल transmembrane डोमेन केवी चैनल सहायक सब यूनिटों कि अपने दम पर किसी भी पोटेशियम धाराओं पारित नहीं कर सकते हैं, लेकिन वे कर सकते हैं केवी चैनल अल्फा सब यूनिटों के साथ परिसरों फार्म और gating, प्रवाहकत्त्व, औषध और कक्ष के भीतर की तस्करी के रूप में उनके कार्यात्मक संपत्तियों काफी मिलाना. उदाहरण के लिए और उत्परिवर्तनों KCNE2 में आम बहुरूपताओं विरासत में मिला और अधिग्रहण रूपों ओ के साथ जुड़े रहे हैंच लांग क्यूटी सिंड्रोम (LQTS) 1, 16.
पायनियर और अलग केवी चैनल अल्फा सब यूनिटों और चूहे के लिए उनके योगदान के electrophysiological लक्षण वर्णन अलगाव में काम भी murine वेंट्रिकुलर और atrial repolarization सेंट लुई के वॉशिंगटन विश्वविद्यालय में डॉ. Nerbonne के 1990 के दशक में 3, 5 समूह द्वारा किया गया है, 7. हालांकि, काफी कम केवी चैनल सहायक सब यूनिटों के की कृंतक मायोकार्डियम के भीतर atrial और वेंट्रिकुलर repolarization योगदान के बारे में जाना जाता है KCNEs चो कोशिकाओं और Xenopus laevis oocytes के रूप में heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली में मुख्य रूप से अध्ययन किया गया है. का उपयोग करने के लिए इन तरीकों KCNE सब यूनिटों अत्यधिक 10 KCNEs के लिए संभावित भागीदारों के रूप में अलग Kv चैनल अल्फा सब यूनिटों की एक श्रृंखला की पहचान heteromeric केवी चैनल परिसरों के गठन में अनेक प्रकार का होना दिखाया गया है. हालांकि, हमें यकीन नहीं किया जा सकता है कि क्या इन विशिष्ट heteromeric केवी चैनल compleXES भी देशी cardiomyocytes में या मनाया heteromeric KCNE केवी चैनल अल्फा सबयूनिट भागीदारी heterologous अभिव्यक्ति 1 कलाकृतियों अगर होते हैं. इसलिए हम अलगाव तकनीक और Nerbonne प्रयोगशाला से केवी चैनल रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल अपनाया और संशोधित रूप में उन्हें इस लेख के प्रोटोकॉल अनुभाग में संकेत दिया murine repolarization में अलग केवी चैनल, जो KCNE जीन द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं टुकड़े करना है. इस दृष्टिकोण का उपयोग हम हाल ही में पाया है कि केवी चैनल सहायक KCNE2 सबयूनिट murine निलय मायोकार्डियम (मैं Kslow, 1 और मैं, च) में दो अलग केवी धाराओं को नियंत्रित करता है. विभिन्न पोटेशियम चैनलों के लिए विशिष्ट inhibitors के आवेदन करके हम murine KCNE2 जीन दोनों Kv1.5 और Kv4.2 14 धाराओं में एक महत्वपूर्ण कमी का कारण बनता है कि विलोपन दिखाने में सक्षम थे. की KCNE2 Kv1.5 द्वारा नियमन पहले नहीं जाना जाता था whereas विनियमन Kv4.2 KCNE2 द्वारा पहले से ही heterologous अभिव्यक्ति 20 अध्ययनों के द्वारा किया गया है इन विट्रो में प्रदर्शन किया.
Atrial fibrillation (वायुसेना) सबसे अक्सर नैदानिक व्यवहार में निरंतर अतालता है और महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर 4 के साथ जुड़ा हुआ है. उत्परिवर्तनों सभी विभिन्न KCNEs में हाल ही में मानव में किया गया है वायु सेना के साथ जुड़ा हुआ है. हाल ही में, दो गैर पर्याय बन म्यूटेशन KCNE1 में वायुसेना के साथ रोगियों है कि नियंत्रण समूह (OLESEN एट अल, 2012) में मौजूद नहीं थे में पाए गए. Mechanistically, heterologous अभिव्यक्ति अध्ययन की संभावना अंतर्निहित तंत्र के रूप KCNQ1 धाराओं में एक लाभ के समारोह प्रभाव की पहचान की. इसके अलावा, हाल ही में यह दिखाया गया था है कि KCNE1 / - चूहों की कंपकंपी वायुसेना 17 सहज एपिसोड से ग्रस्त है. एक अकेला वायुसेना, यांग एट अल के साथ 28 असंबंधित चीनी परिवारों के मूल्यांकन के अध्ययन में. KCNE2 में एक उत्परिवर्तन की पहचान की,जो एक प्रतिस्थापन arginine करने सिस्टीन (R27C) में हुई. कार्यात्मक विश्लेषण heterologous अभिव्यक्ति अध्ययनों में उत्परिवर्ती चैनल के लाभ के समारोह KCNQ1 (मैं एस) 18 चैनलों पर प्रभाव का पता चला. हालांकि, KCNE2 भी अन्य केवी α सब यूनिटों Kv1.5 सहित चैनल है, जो भी वायुसेना में शामिल किया गया है की एक श्रृंखला के साथ परिसरों फार्म कर सकते हैं. हमने हाल ही में पता चला है कि KCNE2 murine 15 चूहों में वेंट्रिकुलर APD की एक मोहलत के लिए अग्रणी निलय में Kv1.5 धाराओं मिलाना कर सकते हैं. / - माउस मॉडल और / या वायु सेना से KCNE2 दुख में उत्परिवर्तन शरण रोगियों में इसलिए, atrial Kv1.5 KCNE2 दोष से धाराओं के विघटन भी अंतर्निहित KCNE2 हमारे में वायुसेना के लिए हृदय - अतालताएँ उत्पन्न करने के सक्षम तंत्र का प्रतिनिधित्व कर सकता है. KCNE3 में उत्परिवर्तन भी हाल ही में थे पारिवारिक 8 वायु सेना के साथ एक रोगी में पहचान की. Electrophysiological रिकॉर्डिंग एक incre का पता चलाKv4.3/KCNE3 और Kv11.1/KCNE3 की ased गतिविधि उत्परिवर्तन द्वारा धाराओं उत्पन्न, जिससे तेजी से हृदय कार्रवाई संभावित repolarization और इस प्रकार अटरिया में पुन: प्रवेशी तरंगिकाओं जोखिम उत्परिवर्तन वाहक की संवेदनशीलता conferring. लेकिन KCNE3 V17M missense उत्परिवर्तन इस तथ्य के बावजूद नहीं प्रभाव KCNE3/KCNQ1 धाराओं था कि KCNE3 रूपों KCNQ1 मायोकार्डियम में कार्यात्मक परिसरों. इसके अलावा, KCNE3 हाल ही में वाल्वुलर वायुसेना परिकल्पना है कि KCNE3 न केवल पारिवारिक वायुसेना में एक भूमिका निभाता है, लेकिन यह भी 6 वायुसेना वाल्वुलर समर्थन के साथ एक मानव आबादी में विनियमित किया जाना दिखाया गया था. हाल ही में, एक एकल nucleotide बहुरूपता (छ / टी) KCNE4 में पहचान की थी एक glutamic एसिड (Glu, ई) / एसपारटिक (एएसपी, डी) एसिड की पेप्टाइड KCNE4 19 145 स्थान पर प्रतिस्थापन में जिसके परिणामस्वरूप. इस बहुरूपता के बाद कार्यात्मक विश्लेषण से पता चला है कि KCNE4 बहुरूपताKCNQ1 9 चैनलों पर "समारोह के लाभ" के प्रभाव डाल रही है. फिर, इन अध्ययनों heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली और देशी cardiomyocytes से प्रयोगात्मक सबूत अभी भी कमी है में किए गए. अभी हाल ही में, एक missense उत्परिवर्तन (L65F) के साथ एक अलग गैर - पारिवारिक वायुसेना के मामले में 12 वायु सेना के साथ 158 रोगियों के एक डेनिश काउहोट में पहचान की गई है. इसके अलावा, KCNE5 (C97T) में एक बहुरूपता इसी अध्ययन की आबादी है, जो 13 वायुसेना के विकास के लिए एक उच्च जोखिम के साथ जुड़े थे भीतर पहचान की थी. KCNQ1 चैनल के साथ दोनों β सब यूनिटों उत्परिवर्ती (KCNE2 और KCNE5) की वृद्धि हुई IKS धाराओं के साथ बातचीत एक लाभ के समारोह प्रभाव का उत्पादन किया. KCNQ1 IKS चैनल के α सबयूनिट पांच सहायक β सब यूनिटों (KCNE1-5) में से किसी एक के साथ जोड़ सकते हैं. इसलिए मैं KCNQ1 करने के लिए एक संभावित उम्मीदवार α सबयूनिट साथी हो सकता है लगता है कि जब एक आणविक सब्सट्रेट के लिए खोजn KCNE से जुड़े वायुसेना के रोगजनन. हालांकि, KCNE सब यूनिटों स्पष्ट संकीर्णता दिया अन्य आणविक लक्ष्य संभव हो रहे हैं और इसलिए हम के लिए विशेष रूप से इन संभव / KCNE केवी अल्फा सबयूनिट बातचीत की जांच करना चाहते हैं. अलग केवी चैनल अल्फा सब यूनिटों murine atrial cardiomyocytes के अलगाव और विशिष्ट inhibitors के आवेदन के साथ इन विट्रो electrophysiological रिकॉर्डिंग में बाद में और हमारी प्रयोगशाला में अध्ययन इसलिए भी कर रहे हैं वर्तमान में KCNE पीछे तंत्र से जुड़े वायुसेना तकनीक हम इस लेख में वर्णन का उपयोग स्पष्ट करने के उद्देश्य से KCNEx पीटा चूहों से देशी cardiomyocytes की जैव रासायनिक विश्लेषण.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG), फ्रिट्ज Thyssen-Stiftung और / Charité एमडीसी से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
References
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