Summary
Kv canale disfunzione è associata ad aritmie cardiache. Al fine di studiare i meccanismi molecolari che portano a tali aritmie che utilizziamo un protocollo sistematico per l'isolamento di cardiomiociti atriali e ventricolari da Kv topi knockout subunità dei canali ausiliari. Cardiomiociti isolati possono essere utilizzate immediatamente per cellulari studi elettrofisiologici, biochimici o di immunofluorescenza (IF) saggi.
Abstract
KCNE geni codificano per una piccola famiglia di Kv canale subunità accessorie che formano complessi con eteromerici Kv canale subunità alfa di modificare le loro proprietà funzionali. Mutazioni in geni KCNE sono stati trovati in pazienti con aritmia cardiaca, come la sindrome del QT lungo e / o fibrillazione atriale. Tuttavia, precisa la fisiopatologia molecolare che porta a queste malattie resta sfuggente. In studi precedenti le proprietà elettrofisiologiche della malattia che provoca mutazioni in questi geni sono in gran parte state studiate in sistemi di espressione eterologa e non possiamo essere sicuri se gli effetti segnalati possono essere direttamente tradotti in cardiomiociti nativi. Nel nostro laboratorio abbiamo quindi utilizzare un approccio diverso. Siamo direttamente studiare gli effetti della delezione del gene KCNE in cardiomiociti isolati da topi knockout per elettrofisiologia cellulare - una tecnica unica che descriviamo in questo numero del Journal of esperimenti visualizzati. I cuori di geneticatopi ingegnerizzati KCNE lly stanno rapidamente asportato e montato su un apparato Langendorff da incannulazione aortica. Gratuito Ca 2 + nel miocardio è vincolato da EGTA, e la dissociazione dei miociti cardiaci viene poi raggiunto da perfusione retrograda delle arterie coronarie con una specializzata a basso Ca 2 + tampone contenente collagenasi. Atria, parete libera del ventricolo destro e il ventricolo sinistro possono essere separati da tecniche microchirurgiche. Il calcio è poi lentamente aggiunti ai cardiomiociti isolati in un passo multiplo comprendente procedura di lavaggio. Cardiomiociti atriali e ventricolari di aspetto sano senza contrazioni spontanee vengono immediatamente sottoposti ad analisi elettrofisiologiche dalla tecnica di patch clamp o altre analisi biochimiche nelle prime 6 ore dopo l'isolamento.
Protocol
1. Animal Anestesia e prelievo di organi
- Anestetizzare il mouse intraperitoneale (ip) iniezione di ketamina (200 mg / kg di peso corporeo) e TMA (20 mg / kg di peso corporeo).
- Per anticoagulate iniettare 250 IP UI di eparina per evitare la coagulazione del sangue e la formazione di trombi.
- Attendere fino narcosi viene raggiunto, che è caratterizzato da areflessia. Per verificare la presenza di areflessia, riflesso corneale prova toccando delicatamente la cornea o del volo reflex test pizzicamento coda.
- Trasferire il mouse sul tavolo operatorio e fissarlo in posizione supina.
- Incidere la pelle e la parete addominale al di sotto del xifoide ed eseguire toracotomia clamshell: estendere il taglio su entrambi i lati lungo l'arco costale e successivamente tagliare le costole nella linea ascellare mediale, deviare verso l'alto gabbia toracica.
- Aprire pericardio, individuare grossi vasi. Premere delicatamente caudale cuore per visualizzare meglio l'aorta. Bloccare l'aorta con pinza.
- Posizionare il cuore in concavità di una coppia di s cissors e sezionare tutte le navi di collegamento con un unico taglio. Assicurarsi di conservare una parte sufficientemente grande della aorta ascendente per incannulazione Langendorff.
- Trasferire cuore staccato immediatamente ad una piastra Petri riempito con ghiaccio freddo e pre-ossigenato soluzione di 1 (per le soluzioni, vedi Tabella 1).
2. Preparazione di perfusione Cuore e Langendorff
- Incannulare l'aorta con una cannula di acciaio 1.8F. Assicurati di evitare embolia gassosa.
- Aorta fissarsi sulla cannula con una sutura chirurgica e coronarie filo con 1 ml di soluzione 1.
- Collegare cannula con un apparato Langendorff.
- Assicurarsi che il tempo di toracotomia per incannulazione Langendorff non supera i 120 secondi per evitare di estesa ischemia / riperfusione al miocardio.
- Cuore profumato con 10 ml di soluzione di Ca 2 + libero 2 (4 ml / min).
- Cuore profumato con una soluzione di collagenasi 3 per 8 min (4 ml / min).
- Cuore trasferimento in un pre-riscaldato a 100 mm piastra Petri contenente partire Ca 2 + soluzione 4.
- Rimuovere con attenzione aortica e altri non-tessuto cardiaco con le forbici e scartarla.
- Atri e ventricoli separati e continuare con ciascuna camera separatamente. Mantenere le cellule immersi in soluzione al 4. Utilizzare piccoli volumi (meno di 5 ml).
4. Dissociazione ulteriore Cardiomyocytes
- Cardiomiociti atriali:
- Per individuare cardiomiociti atriali trasferire gli atri in un apposito pre-riscaldata da 100 mm piastra di coltura e dissociare il tessuto attraverso delicatamente spinge via con una pinza sottile. Assicurare un dissociazione quasi completa del tessuto.
- Usare una pipetta da 1 ml con allargata fuoco lucidato punta di plastica pipetta per sospendere le cellule in 1 ml di soluzione di 5 per 5 min.
- Separare le cellule dai detriti utilizzando un filtro cella (200 maglia um). <li> Aggiungere 5 ml di soluzione al 5 sospensione cellulare e centrifugare per 2 minuti a 16 xg a temperatura ambiente.
- Le seguenti operazioni sono gestite sotto una cappa di coltura cellulare. Eliminare il supernatante e risospeso il pellet in 5 ml di soluzione 6.
- Dopo sedimentazione per gravità per 10 min in una provetta da 15 ml, centrifugare per 1 min a 16 xg a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule a seconda della loro quantità in 1-5 ml di soluzione 6.
- Sezionare la regione di interesse ventricolare sinistra con pinza sottile in 5 ml di soluzione 4.
- Sospendere cellule pipettando gentilmente finché la maggior parte delle cellule sono separate. Trasferire la soluzione cellulare dopo il filtraggio (200 maglia micron) in un tubo da 50 ml, si aggiunge un volume di 25 ml.
- Centrifugare per 2 minuti a 16 xg a temperatura ambiente.
- Le seguenti operazioni sono gestite sotto una cappa di coltura cellulare. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 25 ml disoluzione 6 e consentire la sedimentazione delle cellule per 10 min.
- Contare le cellule e rimuovere il surnatante, aggiungere 25-50 ml di soluzione 6 sulle cellule.
5. Preparazione di Cardiomyocytes per elettrofisiologia cellulare, biochimica o se gli studi
- Per gli studi di elettrofisiologia, tenere i miociti in soluzione 6 in una provetta da 50 ml e inibire la sedimentazione.
- Per studi biochimici, calcium imaging esempio, miociti piastra sul piatto laminina rivestite coltura cellulare (concentrazione finale di 20 pg / ml di laminina in PBS).
- Per colorazione per immunofluorescenza preparare una coltura di piastra di cella piatto con vetrini coprioggetto rivestiti di vetro e con soluzione laminina (concentrazione finale di 50 pg / ml di laminina in PBS).
- Rimuovere la soluzione prima di miociti placcatura. Piastra le cellule e controllare la densità cellulare utilizzando un microscopio.
- Lasciare i miociti aderire fodera per 1 ora a 37 ° C in 2% di CO 2, rimuovere la soluzionee iniziare subito con un protocollo standard procedura di colorazione.
- Incubare con fissativo, ad esempio PFA 4% in PBS (pH 7,5) per 10 min a temperatura ambiente e seguire con tre passaggi di lavaggio PBS per 5 minuti ciascuna.
- Per permeabilizzare le cellule e di inibire l'anticorpo non specifico legame incubare i miociti con 10% di siero, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare con l'anticorpo primario per 1 ora a 37 ° C e lavare come descritto prima.
- Incubare con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente. Per i nuclei di contrasto e di α-actinina uso e fluorocromo DAPI falloidina coniugato (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
- Dopo il lavaggio, trasferire il coperchio di vetro scivola attentamente silano vetrini trattati e cellule embed in fluorescenza mezzo di montaggio.
6. Cellular Elettrofisiologia
- Eseguire Whole-cell patch-clamp su FREshly isolati cardiomiociti atriali e ventricolari a temperatura ambiente.
- Trasferire sani cardiomiociti compaiono nella camera di perfusione riempita con un volume definito della soluzione del bagno extracellulare. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM MgCl 2, 3 mM CoCl 2, HEPES 10 mM, glucosio 10 mM, e 0,02 mM Tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Utilizzare NaOH per la regolazione del valore di pH.
- Usare un equipaggiamento patch clamp (cioè IX71 microscopio invertito, un amplificatore Multiclamp 700B, una acquisizione Digidata 1440A sistema e PC con pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
- Utilizzare pipette patch con resistenze di 3-5 MW quando riempito con soluzione intracellulare contenente 130 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM di HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2 GTP, 5 mM Na 2 CP e 4,9 mM CaCl 2 (pH 7,2). Utilizzare KOH per la regolazione del valore di pH.
- Evoke verso l'esterno K + correnti duanello di 4,5 sec gradini di tensione per testare potenziali tra -60 e +50 mV a 10 mV, con incrementi da un potenziale di mantenimento di -70 mV dopo 20 msec prepulse a mV -40.
- Assicurarsi di correnti di fuga sono sempre <100 pA.
- Per la dissezione di K + diverse correnti di usare inibitori specifici come 4-aminopiridina (4-AP; Biomedicals ICN, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) o Tetraethylammonium (TEA, Sigma). Le soluzioni madre dovrebbero essere preparati in soluzione del bagno extracellulare, e applicato direttamente sulla zona più vicina possibile della cellula tramite una micropunta dopo "baseline" registrazioni. Equilibramento dovrebbe essere consentito per 2-3 minuti prima di "droga" registrazioni.
- Per l'analisi normalizzare ampiezze attuali singole celle a dimensione della cella (a cellula intera capacità di membrana). Analizzare i dati non in linea utilizzando pClamp10.3 software (Molecular Devices) o software simile.
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Representative Results
Isolamento degli adulti cardiomiociti murini di topi geneticamente modificati per studiare la funzione dei geni di interesse specifico in vitro è diventato un potente strumento per capire meglio fisiopatologia cardiaca. Questo metodo è attualmente utilizzato da un numero piccolo ma crescente di base laboratori scientifici di tutto il mondo. Tuttavia, l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari murini adulti può essere difficile e deve essere fatto accuratamente e ripetutamente da mani esperte. Figura 1 mostra appena cardiomiociti modello isolati atriali e ventricolari. Per cardiomiociti ventricolari si consiglia di utilizzare solo a forma di bastoncello, miociti ventricolari striati di aspetto sano, senza contrazioni spontanee. Rispetto al miociti ventricolari, miociti atriali sono più corte e sottili. La striatura caratteristica e l'asta-forma di cardiomiociti ventricolari manca in adulti cardiomiociti atriali murini. Il rendimento di cardiomiociti ventricolari isolatida un cuore di topo intatto è 5x10 5 - 1x10 6. Per cardiomiociti atriali è molto meno. In genere si aspettano di isolare circa 5 - 25.000 cellule atriali da un cuore di topo. Una volta isolato, cardiomiociti possono essere sottoposte a differenti tecniche in vitro incluse registrazioni elettrofisiologiche (Figura 1). Si consiglia di utilizzare cardiomiociti isolati entro le prime 6 ore dopo l'isolamento. Figura 1 mostra esemplari registrazioni dei canali Kv verso l'esterno (a destra) di cardiomiociti atriali e ventricolari evocate da fasi differenti da depolarizzazione cellula intera tecnica del patch clamp. La caratteristica forma ventricolare adulto murino e Kv canale atriale ripolarizzazione correnti può essere visto in un corso di tempo definito (qui 4 sec, Figura 1). Si prega di notare che l'ampiezza della corrente è significativamente più basso nei cardiomiociti murini adulti atriale rispetto al cardiomycytes ventricolari.
| Soluzione | Contenuti (in mm, se non specificato diversamente) |
| 1 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, uno KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosio |
| 2 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, uno KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosio + 229,5 mM EGTA |
| 3 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, uno KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosio, CaCl 2 0,1 + 0,8 g / L Tipo Collagenase 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, uno KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosio, CaCl 2 0,2 + 0,8 g / L Tipo Collagenase 2 (300 U / L) * + BSA (1 g / L) |
| 5 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, uno KH 2 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosio, CaCl 2 0,5 + BSA (1 g / L) |
| 6 | 117 NaCl, KCl 4, 10 HEPES, uno KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucosio, CaCl 2 1,0 + BSA (1 g / L) |
Tabella 1. Soluzioni di isolamento. Equilibrata per 10 min con Carbogen (95% O 2, 5% CO 2), a 37 ° C pH = 7,4 (NaOH). * L'attività può dipendere dal numero di lotto, il test in modo precedente di attività collagenasi è raccomandato.
Figura 1 In alto a sinistra:. Esemplare macchiato cardiomiociti ventricolari con DAPI (nuclei, blu) e Alexa Farina 488 falloidina (α-actinina, verde) In alto a destra:. Esemplari tracce di clamp intero patch di cellaregistrazione in basso a sinistra:.. esemplare macchiato cardiomiociti atriale con DAPI (nuclei, blu) e falloidina fluorocromo coniugato (α-actinina, verde) In basso a destra: tracce esemplari di tutta la registrazione patch clamp cella.
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Discussion
Con lo sviluppo crescente di ceppi di topi geneticamente per studiare la funzione cardiaca e patologia cardiaca relativa a gene delezione c'è anche un crescente interesse per metodi specializzati per studiare gli effetti della delezione genica specifica in vitro. Nel nostro laboratorio studiamo i ruoli di una famiglia di Kv canale subunità accessorie sulla ripolarizzazione cardiaca. I geni KCNE comprendono una famiglia di 5 geni (KCNE1-5), che svolgono un ruolo importante in ventricolare umano e ripolarizzazione atriale 11, 15. KCNEs sono singole transmembrana dominio Kv subunità di canali accessori che non passano tutte le correnti di potassio, in quanto tali, ma possono formare complessi con Kv subunità alfa del canale e modulare le loro proprietà funzionali come gating, conduttanza, farmacologia e il traffico all'interno della cellula in modo significativo. Le mutazioni e polimorfismi comuni in KCNE2 per esempio, vengono associati a forme ereditarie ed acquisite of la sindrome del QT lungo (LQTS) 1, 16.
Lavoro pionieristico in isolamento e caratterizzazione elettrofisiologica delle diverse subunità alfa del canale Kv e il loro contributo al topo, ma anche ventricolare murino e ripolarizzazione atriale è stato fatto dal gruppo del Dr. Nerbonne alla Washington University di St. Louis nel 1990 3, 5, 7. Tuttavia, molto meno si sa circa il contributo dei canali Kv subunità accessorie a ripolarizzazione atriale e ventricolare nel roditore miocardio. KCNEs sono state principalmente studiate in sistemi di espressione eterologhi come cellule CHO e Xenopus laevis ovociti. Usando questi metodi KCNE subunità hanno dimostrato di essere altamente promiscue eteromerici formare complessi di canale Kv individuare una serie di differenti subunità alfa del canale kV come potenziali partner per KCNEs 10. Tuttavia, non possiamo essere sicuri che queste specifiche eteromerici Kv canale complexes si verificano anche in cardiomiociti nativi o se gli osservati eteromerici KCNE Kv canale partnership subunità alfa sono artefatti di espressione eterologa 1. Abbiamo quindi adottato la tecnica di isolamento e Kv protocolli canale di registrazione dal laboratorio Nerbonne e modificato come indicato nella sezione del protocollo di questo articolo per sezionare i canali Kv diversi ripolarizzazione murino, che sono controllati da geni KCNE. Utilizzando questo approccio abbiamo recentemente scoperto che il Kv canale subunità accessoria KCNE2 controlla due correnti Kv distinte nel miocardio ventricolare murino (I Kslow, 1 e I, f). Mediante l'applicazione di inibitori specifici per diversi canali di potassio siamo stati in grado di dimostrare che delezione del gene murino KCNE2 causa una riduzione significativa sia Kv1.5 e Kv4.2 correnti 14. Regolamento del Kv1.5 da KCNE2 non era già noto, wheregolamentazione Reas di Kv4.2 da KCNE2 è già stato dimostrato in vitro da studi di espressione eterologa 20.
La fibrillazione atriale (AF) è la più frequente aritmia sostenuta nella pratica clinica ed è associata a significativa morbidità e mortalità 4. Mutazioni in tutti KCNEs differenti sono stati recentemente associati AF nell'uomo. Recentemente, due non-sinonimo mutazioni vennero trovate in KCNE1 in pazienti con fibrillazione atriale che non erano presenti nel gruppo di controllo (Olesen et al., 2012). Meccanicisticamente, studi di espressione eterologa identificato un guadagno-di-funzione effetto KCNQ1 correnti come il probabile meccanismo sottostante. Inoltre, recentemente è stato dimostrato che KCNE1 - / - mice soffre di episodi spontanei di fibrillazione atriale parossistica 17. In uno studio che ha valutato 28 famiglie non imparentate cinesi con fibrillazione atriale isolata, Yang et al. identificarono una mutazione nel KCNE2,che ha comportato un arginina-to-cisteina sostituzione (R27C). Analisi funzionale del canale mutante in studi di espressione eterologa rivelato un guadagno-di-funzione effetto KCNQ1 canali (I Ks) 18. Tuttavia, KCNE2 può anche formare complessi con una gamma di altri Kv canale α-subunità Kv1.5 compreso, che è stata anche implicata nel AF. Abbiamo recentemente dimostrato che KCNE2 può modulare Kv1.5 correnti nel ventricolo murino portando ad un prolungamento della APD ventricolare in topi 15. Pertanto, l'interruzione di atriali Kv1.5 correnti di disfunzione KCNE2 potrebbe anche rappresentare il meccanismo alla base aritmogena per AF nel nostro KCNE2 - / - topo modello e / o in pazienti portatori di mutazione in KCNE2 affetti da AF. Le mutazioni in KCNE3 sono stati recentemente identificato in un paziente con famigliare AF 8. Le registrazioni elettrofisiologiche rivelato un increattività di deterioramenti Kv4.3/KCNE3 e Kv11.1/KCNE3 correnti generate dalla mutazione, conferendo in tal modo la suscettibilità di portatori di mutazioni di ripolarizzazione cardiaca potenziale azione veloce e quindi vulnerabilità rientranti wavelets negli atri. Il missenso KCNE3 V17M mutazione tuttavia non ha avuto effetto KCNE3/KCNQ1 correnti nonostante KCNE3 forma complessi funzionali con KCNQ1 nel miocardio. Inoltre, KCNE3 stato recentemente dimostrato di essere regolata su in una popolazione umana con valvolare AF supportando l'ipotesi che KCNE3 gioca un ruolo non solo in AF familiare ma anche valvolare AF 6. Recentemente, un polimorfismo di singolo nucleotide (G / T) è stata identificata in KCNE4 risultante in un acido glutammico (Glu, E) / acido aspartico (Asp, D) sostituzione alla posizione 145 del peptide KCNE4 19. Successiva analisi funzionale di questo polimorfismo rivelato che il polimorfismo KCNE4esercita l'effetto di "guadagno di funzione" sulle KCNQ1 canali 9. Ancora una volta, questi studi sono stati effettuati in sistemi di espressione eterologhi e le prove sperimentali da cardiomiociti nativi è ancora carente. Più di recente, un caso isolato non-familiare caso di fibrillazione atriale con un (L65F) mutazione missenso è stata identificata in una coorte danese di 158 pazienti con FA 12. Inoltre, un polimorfismo in KCNE5 (C97T) è stato identificato all'interno della popolazione stesso studio, che è stato associato ad un più alto rischio per lo sviluppo di AF 13. L'interazione di entrambi mutante β-subunità (KCNE2 e KCNE5) con il canale KCNQ1 prodotto un guadagno-di-funzione effetto con maggiori correnti IKS. KCNQ1 subunità α del canale IKs può associarsi con uno qualsiasi degli accessori cinque subunità β-(KCNE1-5). Pertanto KCNQ1 sembra essere un candidato probabile α-subunità compagno durante la ricerca di un substrato molecolare in patogenesi della KCNE associata AF. Tuttavia, data la promiscuità pronunciato di subunità KCNE altri bersagli molecolari sono possibili e pertanto intendiamo studiare specificatamente queste eventuali KCNE / Kv alfa-subunità interazioni. Gli studi nel nostro laboratorio sono quindi anche attualmente l'obiettivo di chiarire i meccanismi che stanno dietro KCNE associata AF utilizzando la tecnica che descriviamo in questo articolo - isolamento di cardiomiociti murini atriali e successive nelle registrazioni elettrofisiologiche in vitro con applicazione di inibitori specifici per diverse subunità alfa del canale Kv e analisi biochimiche di cardiomiociti nativi di topi knockout KCNEx.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung e Charité / MDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
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