Summary
Kv-Kanal Dysfunktion ist mit Herzrhythmusstörungen verbunden. Um zu untersuchen, die molekularen Mechanismen, die zu solchen Arrhythmien nutzen wir eine systematische Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus Kv Kanal Nebenleistungen Untereinheit Knockout-Mäusen führen. Isolierte Herzmuskelzellen kann dann sofort für zellulare elektrophysiologische Studien, biochemischen oder Immunfluoreszenz (IF)-Assays verwendet werden.
Abstract
KCNE Gene für eine kleine Familie von Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten, die heteromeren Komplexe mit Kv-Kanal alpha-Untereinheiten bilden, um ihre funktionellen Eigenschaften zu modifizieren kodieren. Mutationen in KCNE Gene bei Patienten mit Herzrhythmusstörungen wie das Long-QT-Syndrom und / oder Vorhofflimmern gefunden. Allerdings bleibt die genaue molekulare Pathophysiologie, die zu diesen Krankheiten führt unklar. In früheren Studien die elektrophysiologischen Eigenschaften der Krankheit Mutationen in diesen Genen haben meist in heterologen Expressionssystemen untersucht worden und wir können nicht sicher sein, ob die berichteten Effekte können direkt in nativen Kardiomyozyten übersetzt werden. In unserem Labor setzen wir daher einen anderen Ansatz. Wir direkt zu untersuchen die Auswirkungen von KCNE Deletion in isolierten Herzmuskelzellen aus Knockout-Mäusen durch zelluläre Elektrophysiologie - eine einzigartige Technik, die wir beschreiben, in dieser Ausgabe des Journal of Visualized Experiments. Die Herzen von genetically entwickelt KCNE Mäusen schnell ausgeschnitten und montiert auf einem Langendorff-Apparatur durch Aorten Kanülierung. Freiem Ca 2 + in dem Myokard durch EGTA gebunden und Dissoziation von Herzmuskelzellen wird dann durch retrograde Perfusion der Koronararterien mit einem spezialisierten niedrigen Ca 2 +-Puffer, der Kollagenase erreicht. Atria, freien rechtsventrikulären Wand und die linke Herzkammer kann dann durch mikrochirurgische Techniken getrennt werden. Calcium wird dann langsam wieder auf isolierte Herzmuskelzellen in einem mehrstufigen Waschvorgangs zugegeben umfassend. Atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten gesundes Aussehen ohne spontane Kontraktionen werden dann sofort an elektrophysiologische Untersuchungen durch Patch-Clamp-Technik oder andere biochemische Analysen innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Isolierung unterzogen.
Protocol
Ein. Tierische Anästhesie und Organentnahmen
- Betäuben die Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion von Ketamin (200 mg / kg KG) und Xylazin (20 mg / kg KG).
- Um anticoagulate injizieren 250 IU Heparin ip die Blutgerinnung und Thrombusbildung zu vermeiden.
- Warten Sie, bis tiefe Narkose erreicht ist, die durch Areflexie gekennzeichnet. Um Areflexie, Test Cornealreflex durch leichtes Berühren der Hornhaut oder Testflug Reflex Schwanz kneifen überprüfen.
- Übertragen Sie die Maus auf OP-Tisch und fixieren Sie sie in Rückenlage.
- Inzision der Haut und der Bauchwand unterhalb der xiphoid und führen Clamshell Thorakotomie: Erweitern Sie den Schnitt auf beiden Seiten entlang der Rippenbogen und anschließend geschnitten Rippen in der medialen Axillarlinie, lenken die Brustkorb nach oben.
- Öffnen Herzbeutel, finden großen Gefäße. Drücken Sie vorsichtig Herzen caudal zur besseren Darstellung der Aorta. Klemmen Sie die Aorta mit einer Pinzette.
- Legen des Herzens in Konkavität eines Paars von n cissors und sezieren alle verbindenden Gefäße mit einem einzigen Schnitt. Achten Sie darauf, um einen ausreichend großen Teil der aufsteigenden Aorta für Langendorff Kanülierung bewahren.
- Übertragen herausgeschnitten Herz sofort in eine Petrischale mit eiskaltem und Pre-Oxygenwasser Lösung 1 (für Lösungen, siehe Tabelle 1) gefüllt.
2. Vorbereitung der Herz-und Langendorff Perfusion
- Kanülieren die Aorta mit einem 1.8F Stahlkanüle. Achten Sie darauf, Luftembolie zu vermeiden.
- Fixieren Aorta auf der Kanüle mit einer chirurgischen Naht und bündig Koronarien mit 1 ml der Lösung 1.
- Verbinden Kanüle mit einem Langendorff-Apparatur.
- Stellen Sie sicher Zeit von Langendorff nach Thorakotomie Kanülisier nicht übersteigt 120 Sek. erweiterten Ischämie / Reperfusionsverletzung des Myokards zu verhindern.
- Perfuse Herz mit 10 ml Ca 2 + kostenlose Lösung 2 (4 ml / min).
- Perfuse Herz mit Collagenaselösung 3 für 8 min (4 ml / min).
- Transfer Herz in einer vorgewärmten 100-mm Petrischale mit niedrigen Ca 2 +-Lösung 4.
- Entfernen Sie vorsichtig Aorten-und andere nicht-Herzgewebe mit Schere und entsorgen Sie sie.
- Separate Vorhöfe und Kammern und fahren Sie mit jeder Kammer getrennt. Halten Sie Zellen in Lösung 4 eingetaucht. Verwenden Sie kleine Mengen (weniger als 5 ml).
4. Weitere Dissoziation von Kardiomyozyten
- Atrial Kardiomyozyten:
- Zu individualisieren Vorhof Kardiomyozyten übertragen die Vorhöfe in einem separaten vorgewärmten 100-mm Kulturschale und distanzieren das Gewebe durch die sanft Auseinanderziehen mit feinen Pinzetten. Gewährleisten eine fast vollständige Dissoziation des Gewebes.
- Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette mit einer erweiterten Feuer-poliert mit Kunststoff Pipettenspitze, um die Zellen in 1 ml Lösung 5 auszusetzen für 5 min.
- Trennen der Zellen von Schutt durch Verwendung eines Zellfilter (200 um Maschenweite). <li> 5 ml Lösung 5 der Zellsuspension und Zentrifuge für 2 min bei 16 xg bei Raumtemperatur.
- Die folgenden Schritte werden unter einer Zellkultur Haube betrieben. Überstand verwerfen und resuspendiert das Pellet in 5 ml Lösung 6.
- Nach Sedimentation durch die Schwerkraft für 10 min in einem 15 ml-Röhrchen, für 1 min zentrifugieren bei 16 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren die Zellen je nach ihrer Menge in 1-5 ml Lösung 6.
- Sezieren die linksventrikuläre interessierenden Bereich mit feinen Pinzetten in 5 ml Lösung 4.
- Auszusetzen Zellen durch sanftes Pipettieren, bis die meisten der Zellen getrennt sind. Übertragen der Zelle Lösung nach der Filterung (200 um Maschenweite) in einen 50-ml-Röhrchen, einen Volumen von 25 ml aufgefüllt.
- Säule für 2 min bei 16 xg bei Raumtemperatur.
- Die folgenden Schritte werden unter einer Zellkultur Haube betrieben. Überstand abnehmen, resuspendieren das Pellet in 25 mlLösung 6 und damit die Sedimentation der Zellen für 10 min.
- Zählen Sie die Zellen und den Überstand, fügen Sie 25 bis 50 ml Lösung 6 auf die Zellen.
5. Vorbereitung der Kardiomyozyten für Zelluläre Elektrophysiologie, biochemische oder IF Studies
- Für elektrophysiologischen Studien halten die Myozyten in Lösung 6 in einem 50 ml Röhrchen und hemmen Sedimentation.
- Für biochemische Untersuchungen, z. B. Calcium imaging, Platte Myozyten auf Laminin beschichteten Zellkulturschale (Endkonzentration 20 ug / ml Laminin in PBS).
- Für Immunfluoreszenzfärbung bereiten eine Zellkulturschale Platte mit Glasdeckgläschen und beschichtet mit Laminin-Lösung (Endkonzentration 50 ug / ml Laminin in PBS).
- Entfernen Sie die Lösung vor dem Beschichten Myozyten. Platte der Zellen und steuern die Zelldichte mit Hilfe eines Mikroskops.
- Lassen Sie die Myozyten haften Slip für 1 Stunde bei 37 ° C in 2% CO 2 abzudecken, entfernen Sie die Lösungund beginnen sofort mit einer Standard-Färbeverfahren Protokoll.
- Inkubieren mit Fixiermittel, beispielsweise 4% PFA in PBS (pH 7,5) für 10 min bei Raumtemperatur und folgen mit drei Waschschritten PBS für jeweils 5 min.
- Um die Zellen zu hemmen und permeabilisieren unspezifische Antikörperbindung inkubieren Myocyten mit 10% Serum, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren mit dem primären Antikörper für 1 Std. bei 37 ° C und Waschen wie zuvor beschrieben.
- Inkubieren mit dem sekundären Antikörper für 1 Std. bei Raumtemperatur. Um die Kerne Gegenfärbung und α-actinin Verwendung DAPI und Fluorochrom Phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
- Nach dem Waschen, übertragen die Glasabdeckung rutscht vorsichtig auf Silan behandelten Objektträger und embed Zellen in Fluoreszenz-Eindeckmedium.
6. Cellular Elektrophysiologie
- Führen Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen auf freshly isoliert atrialen und ventrikulären Kardiomyocyten bei Raumtemperatur.
- Übertragen erscheint gesund Kardiomyozyten in Perfusionskammer mit einem definierten Volumen extrazellulären Badlösung gefüllt. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM MgCl 2, 3 mM CoCl 2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose und 0,02 mM Tetrodotoxin (TTX), (pH 7,4) . Verwenden NaOH zur pH-Wert-Einstellung.
- Mit geeigneten Patch Clamp Technik (dh IX71 inversen Mikroskop, ein Multiclamp 700B Verstärker, ein Erfassungssystem Digidata 1440A und PC mit pClamp10.3 Software (Molecular Devices)).
- Verwenden Patch-Pipetten mit Widerständen von 3-5 MOhm, wenn mit intrazellulären Lösung, enthaltend 130 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na 2 GTP, 5 mM Na 2 CP gefüllten und 4,9 mM CaCl 2 (pH 7,2). Verwenden KOH für pH-Wert-Einstellung.
- Evoke außen K + Ströme duRing 4.5-sec Spannungsschritte zu testen Potentiale zwischen -60 und +50 mV in 10 mV-Schritten von einem Haltepotential von -70 mV nach einem 20-msek bis -40 mV Vorpuls.
- Stellen Sie sicher, Leckströme sind immer <100 pA.
- Zum Sezieren von verschiedenen K +-Ströme verwenden spezifische Inhibitoren, wie 4-Aminopyridin (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) oder Tetraethylammonium (TEA, Sigma). Stammlösungen sollen in extrazellulären Badlösung hergestellt werden, und direkt auf eine möglichst enge Nachbarschaft der Zelle über eine Mikrospitze nach "Baseline" Aufnahmen. Äquilibrierung sollte für 2-3 min vor "Droge" Aufzeichnungen zugelassen werden.
- Für die Analyse normalisieren Stromamplituden in einzelnen Zellen der Zellgröße (whole-cell Membran Kapazität). Analysieren von Daten mithilfe pClamp10.3 Software (Molecular Devices) oder vergleichbare Software offline.
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Representative Results
Isolierung von adulten murinen Kardiomyozyten aus gentechnisch veränderten Mäusen, die Funktion bestimmter Gene von Interesse in vitro-Studie hat sich zu einem mächtigen Werkzeug, um weiter zu verstehen kardialen Pathophysiologie. Dieses Verfahren wird derzeit nur von einer kleinen, aber wachsenden Zahl von Grundlagenforschung Labors weltweit verwendet. Allerdings können Isolierung von adulten ventrikulären murine Kardiomyozyten tückisch sein und muss gründlich und wiederholt von erfahrenen Händen durchgeführt werden. Abbildung 1 zeigt frisch isolierten Vorbild atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten. Für ventrikulären Kardiomyozyten empfehlen wir nur stabförmigen, gestreift ventrikulären Myozyten von gesunden Aussehen ohne spontane Kontraktionen. Verglichen mit ventrikulären Myozyten sind Vorhofmyozyten kürzer und dünner. Die charakteristische Querstreifung und Stab-Form der ventrikulären Kardiomyozyten wird bei erwachsenen Vorhof murine Kardiomyozyten fehlen. Die Ausbeute für ventrikuläre Kardiomyozyten isoliertvon einem intakten Maus Herz 5x10 5 - 1x10 6. Für atriale Kardiomyozyten ist es deutlich weniger. Wir erwarten im Allgemeinen etwa 5 zu isolieren - 25.000 Vorhof Zellen aus einer Maus Herz. Einmal isoliert, kann Kardiomyozyten zu verschiedenen in vitro Techniken einschließlich elektrophysiologischen Ableitungen (Abbildung 1) unterzogen werden. Wir empfehlen isolierten Kardiomyozyten innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Isolierung verwendet werden. Abbildung 1 zeigt Vorbild Kv-Kanal nach außen Aufnahmen (rechts) von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten durch verschiedene Depolarisation Schritte whole-cell Patch-Clamp-Technik hervorgerufen. Die charakteristische Form der Maus erwachsenen ventrikulären und atrialen Kv Kanal repolarisierender Ströme können über einen definierten zeitlichen Verlauf (hier 4 sec, Abbildung 1) zu sehen. Bitte beachten Sie, dass die aktuelle Amplitude deutlich geringer ist in murinen Erwachsenen Vorhof Kardiomyozyten gegenüber ventrikuläre cardiomycytes.
| Lösung | Inhalt (in mm, wenn nicht anders angegeben) |
| 1 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl2, 10 Glucose |
| 2 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose + 229,5 uM EGTA |
| 3 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl2, 10 Glukose, CaCl2 0,1 + 0,8 g / L Collagenase Typ 2 (300 U / L) * |
| 4 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl2, 10 Glukose, CaCl2 0,2 + 0,8 g / L Collagenase Typ 2 (300 U / l) * + BSA (1 g / L) |
| 5 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl2, 10 Glukose, CaCl2 0,5 + BSA (1 g / L) |
| 6 | 117 NaCl, 4 KCl, 10 HEPES, 1 KH 2 PO 4, 4 NaHCO 3, 1,7 MgCl 2, 10 Glucose, CaCl 2 1,0 + BSA (1 g / L) |
Tabelle 1. Isolation Lösungen. Equilibrated für 10 min mit Carbogen (95% O 2, 5% CO 2) bei 37 ° C pH = 7,4 (NaOH). * Aktivität kann auf Chargennummer abhängen, so vorherige Prüfung der Kollagenase-Aktivität empfohlen.
Abbildung 1 oben links:. Beispielhafte ventrikuläre Kardiomyozyten gefärbt mit DAPI (Zellkerne, blau) und Alexa Flour 488 Phalloidin (α-actinin, grün) Oben rechts:. Beispielhafte Spuren von Ganzzell-Patch-ClampAufnahme unten links:.. Beispielhafte Vorhof Kardiomyozyten gefärbt mit DAPI (Zellkerne, blau) und Fluorochrom konjugiert Phalloidin (α-actinin, grün) Unten rechts: Beispielhafte Spuren von Ganzzell Patch-Clamp-Aufzeichnung.
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Discussion
Mit der wachsenden Entwicklung von gentechnisch veränderten Mauslinien die Herzfunktion und kardiale Pathologie zu Gen-Deletion zu studieren gibt es auch ein zunehmendes Interesse an spezialisierte Methoden, um Effekte der speziellen Gen-Deletion in vitro zu untersuchen. In unserem Labor untersuchen wir die Rolle einer Familie von Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten auf die kardiale Repolarisation. Die KCNE Gene umfassen eine Familie von 5 Gene (KCNE1-5), die eine wichtige Rolle in der menschlichen ventrikulären und atrialen Repolarisation 11, 15 spielen. KCNEs sind einzelne Transmembrandomäne Kv Kanal zusätzlichen Untereinheiten, die nicht passieren können keine Kalium-Ströme auf ihre eigenen, aber sie können bilden Komplexe mit Kv-Kanal alpha-Untereinheiten und modulieren ihre funktionellen Eigenschaften wie Gating, Leitfähigkeit, Pharmakologie und Menschenhandel innerhalb der Zelle deutlich. Mutationen und gemeinsame Polymorphismen in KCNE2 werden beispielsweise mit angeborenen und erworbenen Formen o verbundenf der Long-QT-Syndrom (LQTS) 1, 16.
Pionierarbeit in Isolation und elektrophysiologische Charakterisierung der verschiedenen Kv Kanal alpha-Untereinheiten und ihren Beitrag zur Ratte, sondern auch murine ventrikulären und atrialen Repolarisation wurde von der Gruppe von Dr. Nerbonne an der Washington University in St. Louis in den 1990er Jahren 3, 5 getan worden, 7. Allerdings wird deutlich weniger über den Beitrag der Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten atrialen und ventrikulären Repolarisation im Nager Myokard bekannt. KCNEs haben vor allem in heterologen Expressionssystemen wie CHO-Zellen und Xenopus laevis Oozyten untersucht. Mit Hilfe dieser Methoden KCNE Untereinheiten wurden durch die hohe promiskuitiven beim Bilden heteromeren Kv Kanal Komplexen Identifizieren einer Reihe unterschiedlicher Kv Kanal alpha-Untereinheiten als potentielle Partner für KCNEs 10. Allerdings können wir nicht sicher sein, ob diese spezifische heteromeren Kv-Kanal ergänzenxes treten auch in nativen Herzmuskelzellen oder wenn die beobachteten heteromeren KCNE Kv-Kanal Alpha-Untereinheit Partnerschaften sind heterologe Expression Artefakte 1. Deshalb nahm die Isolation Technik und Kv-Kanal-Aufzeichnung Protokolle aus der Nerbonne Labor und modifizierte sie, wie in dem Protokoll Abschnitt dieses Artikels, um die unterschiedlichen Kv-Kanäle in murinen Repolarisation, die durch KCNE Genen gesteuert werden sezieren. Mit diesem Ansatz haben wir vor kurzem festgestellt, dass die Kv Kanal Nebenleistungen Untereinheit KCNE2 zwei verschiedene Kv Ströme im murinen Myokard (I Kslow, 1 und ich, f) steuert. Durch Anwendung von spezifischen Inhibitoren für verschiedene Kaliumkanäle konnten wir, dass die Deletion des murinen KCNE2 Gens bewirkt eine deutliche Reduzierung der beiden Kv1.5 und Kv4.2 Ströme 14 zeigen. Verordnung des Kv1.5 durch KCNE2 war bisher nicht bekannt, whereas Regulierung des Kv4.2 durch KCNE2 wurde bereits in vitro durch heterologe Expression Studien 20 gezeigt.
Vorhofflimmern (AF) ist die häufigste anhaltende Arrhythmie in der klinischen Praxis und ist mit einer erheblichen Morbidität und Mortalität 4 zugeordnet. Mutationen in allen verschiedenen KCNEs haben vor kurzem mit AF wurde in den Menschen verbunden. Kürzlich wurden zwei nicht gleichbedeutend Mutationen in KCNE1 bei Patienten mit Vorhofflimmern, die nicht anwesend waren in der Kontrollgruppe (Olesen et al., 2012) gefunden. Mechanistisch identifizierten heterologe Expressionsstudien ein gain-of-function Wirkung in KCNQ1 Ströme als wahrscheinliche zugrundeliegende Mechanismus. Darüber hinaus kurzem wurde gezeigt, dass KCNE1 - / - Mäuse aus spontanen Episoden von paroxysmalem AF 17 leiden. In einer Studie, 28 unabhängigen chinesischen Familien mit einsamen AF, Yang et al. identifizierte eine Mutation in KCNE2,das führte zu einer Arginin-to-Cystein-Substitution (R27C). Funktionsanalyse des mutierten Kanal in heterologen Expressionssystemen Studien ergaben eine gain-of-function Wirkung auf KCNQ1 Kanälen (I Ks) 18. Allerdings kann KCNE2 bilden ebenfalls Komplexe mit einer Reihe anderer Kv Kanal α-Untereinheiten, einschließlich Kv1.5, die auch in AF hat impliziert worden. Wir haben kürzlich gezeigt, dass KCNE2 Kv1.5 modulieren können Ströme im murinen Ventrikels führt zu einer Verlängerung der ventrikulären APD 15 in Mäusen. Daher konnten Störungen des atrialen Kv1.5 Ströme durch KCNE2 Dysfunktion stellen auch die darunterliegende arrhythmogenen Mechanismus für AF in unserem KCNE2 - / - Maus-Modell und / oder bei Patienten, die Mutation in KCNE2 leidet AF. Mutationen in KCNE3 wurden kürzlich auch in einem Patienten mit familiärer AF 8 identifiziert. Elektrophysiologischen Ableitungen zeigten eine Schrittenased Aktivität Kv4.3/KCNE3 und Kv11.1/KCNE3 erzeugten Ströme durch die Mutation, so verleiht Anfälligkeit Mutationsträger schneller Herztätigkeitspotential Repolarisation und damit die Anfälligkeit für einspringenden Wavelets in den Vorhöfen. Die KCNE3 V17M Fehlsinnmutation jedoch keine Wirkung KCNE3/KCNQ1 Ströme obwohl KCNE3 Formen funktionellen Komplexe mit KCNQ1 im Myokard. Darüber hinaus wurde KCNE3 kürzlich gezeigt, dass in einer menschlichen Population werden mit Herzklappen-AF unterstützen die Hypothese, dass KCNE3 spielt nicht nur eine Rolle bei der familiären AF sondern auch valvular AF 6 geregelt. Kürzlich wurde eine einzelne Nukleotidpolymorphismusstelle (G / T) in KCNE4 identifiziert, was zu einer Glutaminsäure (Glu, E) / Asparaginsäure (Asp, D) eine Substitution an Position 145 des KCNE4 Peptid 19. Nachfolgende funktionelle Analyse dieses Polymorphismus ergab, dass die KCNE4 Polymorphismusübt die Wirkung von "gain of function" auf den KCNQ1 Kanälen 9. Wiederum wurden diese Studien in heterologen Expressionssystemen und experimentelle Beweise aus nativen Kardiomyozyten fehlt noch durchgeführt. In jüngerer Zeit hat eine isolierte nicht-familiäre Falle AF mit einer Missense (L65F) Mutation in einem dänischen Kohorte von 158 Patienten mit Vorhofflimmern 12 identifiziert. Weiterhin wurde ein Polymorphismus in KCNE5 (C97T) innerhalb desselben Studienpopulation, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von AF 13 zugeordnet wurde identifiziert. Wechselwirkung der beiden mutierten β-Untereinheiten (KCNE2 und KCNE5) mit dem Kanal KCNQ1 produzierte eine gain-of-function-Effekt mit erhöhter IKs Ströme. Die KCNQ1 α-Untereinheit des IKs Kanal kann mit einem der fünf Zubehör β-Untereinheiten (KCNE1-5) zu verknüpfen. Deshalb KCNQ1 scheint ein aussichtsreicher Kandidat sein α-Untereinheit Partner bei der Suche nach einem molekularen Substrat in die Pathogenese der KCNE-assoziierte AF. Angesichts der ausgeprägten Promiskuität KCNE Untereinheiten andere molekulare Ziele sind möglich und wir wollen daher gezielt untersuchen, diese möglichen KCNE / Kv alpha-Untereinheit Interaktionen. Studien in unserem Labor sind daher derzeit auch das Ziel, die Mechanismen hinter KCNE-assoziierte AF Nutzung der Technik, die wir in diesem Artikel beschrieben aufzuklären - Isolierung von murinen Vorhof Kardiomyozyten und anschließender in vitro elektrophysiologischen Ableitungen mit der Anwendung von spezifischen Inhibitoren auf verschiedene Kv Kanal alpha-Untereinheiten und biochemische Analysen von nativen Kardiomyozyten aus KCNEx Knockout-Mäusen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung und der Charité / MDC finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrodotoxin | Alomone | ||
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals | ||
| Heteropodatoxin 2 | Alomone | ||
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington |
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